ネズミの胎児心エコー検査

要約

心臓の発達に影響を与える遺伝的変化を検討する際に、胎児および周産期死亡は、一般的な機能です。高周波超音波イメージングは​​、2次元の解像度を向上しており、早期に心臓の開発に優れた情報を提供することができますし、死亡前に心臓の構造と機能に及ぼす影響を検出するための理想的な方法です。

要約

心臓の発達と機能の異常が表示されたトランスジェニックマウスでは、理解するための強力なツールを表す通常の血管機能と人間の心血管疾患の病態生理学的基礎の両方の分子機構。心臓の開発^1から3に影響^を与える遺伝的変化を検討する際に、胎児および周産期死亡は、一般的な機能です。心臓機能の初期発生における遺伝的または薬理学的変化の役割を研究するためには、生きた胎児の超音波イメージングは​​異常とフォローアップ縦の早期認識のための重要なツールとなっている。非侵襲的な超音波画像診断は先天性奇形や死^4〜前心機能への影響を検出し、研究するための理想的な方法です。それは生きている胎児の異常の早期発見を可能にし、病気の進行は、縦断的研究^5,6と、子宮内で追跡することができる。最近まで、胎児マウスの心臓のイメージングが頻繁に侵襲的な方法を含んでいた。胎児は、磁気共鳴顕微鏡と電子顕微鏡を実行したり、外科的に透視顕微鏡用に配信するために犠牲にしなければなりませんでした。従来の2次元およびパルス波ドップラーイメージングと高周波プローブの適用は^6月10日利用できるようになり、通常の発達的変化のデータベースでは胚発生時に心臓の収縮と心拍数の測定値を提供することが示されている。 、適切な撮像面は、しばしば得ることが困難であるが、Mモードイメージングは​​、さらに、重要な機能的なデータを提供します。胎児の高周波超音波イメージングは2-Dの解像度を向上しており、心臓の構造体¹¹の初期の開発に優れた情報を提供することができる。

プロトコル

1。イメージングのためのマウスを準備する

1. イメージング研究に先立って、誘導チャンバー内ダム（2-3％イソフルラン）を麻酔。誘導室から動物を取り外し、すぐに麻酔システムに接続されたノーズコーンの中に鼻を入れてください。バリカンと下肢（ 図1を参照）に半ば胸部レベルから毛皮を取り外します。脱毛クリームと残りの体の毛を削除します。脱毛クリームもバリカンせずに使用することができ、徹底的に刺激を防ぐため、使用後の肌の洗い流さなければなりません。
2. 体温（ 図1）を維持するためにつながる組み込み心電図で加熱パッド上仰臥位で麻酔にマウスを置きます。 4足とECG電極にテープそれらを電極にゲルを適用します。
3. 手順全体を通して定常鎮静レベル（100％O ₂と混合1.0パーセント〜1.5％イソフルラン）を取得します。麻酔のレベルはmに調整することができます450の目標心拍数±分あたり50ビート（BPM）をaintain。細心の注意は、1時間未満に鎮静のイソフルランおよび期間の投与量を最小限にするために支払わなければならない。
4. ゆっくり加熱パッドを介して体温を監視するために直腸プローブ（潤滑後）に挿入します。それは狭い範囲内の体温を維持するために重要である（37.0℃±0.5℃）。制御された麻酔薬および一定の体温は、母親と胎児の血行動態の安定のために不可欠です。

技術的な考慮事項

胎児心エコー図の取得が困難な場合があります。これらの研究から得られたデータは、ダムと胎児の両方からストレスに対する応答に起因べらぼうすることができます。理想的には、動物の温度が温暖化パッド、加熱ランプ、またはautoregulated加熱毛布を循環させる、温水イメージングプラットフォームを使用して維持されるべきである。加えて、温めておいた音響ゲルの日常的な使用が推奨されます。アル体温制御に関する支配的な懸念は、低体温症を避けるためですが、温熱療法の開発が等しい関心事でなければならない。このような単純な加熱パッドまたはハロゲン照明に近接の存在として監視されていない加熱装置は、体温を迅速かつ危険な仰角になることがあります。いずれかの方向にかなりの体温の変動が危険にさらされた動物を配置するので、すべての試みは、通常の体温を維持するためになされるべきである。

画像を取得する超音波検査だけでは、変換器の重量が変化した心機能をもたらすかもしれないので、変換器を空洞に過度の圧力をかけないようにする必要があります。画像取得の時間も長引く鎮静起因する生理学的および血行動態の変化を低減するために、最小の（理想的には1時間未満）に抑える必要があります。さらに、時間と各研究のイソフルランへの露出の長さはminimuに抑える必要がありますイソフルラン¹²の潜在的な催奇形性に起因メートル。

2。胚の識別

1. イメージングは、（ 図を参照してくださいここで、L1、2,3、とcetera（左側）とR1、2,3、とcetera（右側）としてラベル左右の子宮角に胎児と、ランドマークとして母親の膀胱を使用して開始され1C）。胎児の位置の表記は撮像後の標本の検索に有用である。
2. 腹部に深すぎる位置の標本は、その存在を文書化するためにスキャンされますが、解像度が低いためのデータ分析から除外されます。隣接した胚をスキャンする機能は、胎児（ 図2A）を追跡するのに役立つ可能性があります。
3. 走査面を走査平面に対してマウスの向きを変更することによって変更されています。画像は、各胎児に2直交平面（ 図2）で得られる。努力は横、正面、あるいは矢状面を近似するビューを取得するために作ったがSであるometimesは腹部の子宮の位置によって斜めの面に限定されています。走査ヘッドの回転もダムを移動せずに向きの変更が可能になります。

技術的な考慮事項

プローブのハンドヘルド操作は成体マウスの心エコー検査で可能ですが、胎児のイメージングにおけるハンドヘルド操作はお勧めできません。胎児の同定は、子宮の位置、ねじれ、そして運動の可変的性質によって複雑になる。胎児のローカライズの難しさを最小限に抑えるためには、ダムの水平面を越えて最小限の動きと静止トランスデューサーの使用（ 図1）は不可欠である。

3。構造と機能の評価

1. スキャニングBモード画像は、心房、心室中隔、心室腔、および左右流出管（ 図2）などの基本的な心臓の構造を識別するために使用されます。
2. Mモード画像sは短軸像から得られ、心室壁の厚さとチャンバー寸法（ 図3）を測定するために使用されます。正しいアライメントが胎児の嘘のために得られない場合には、Bモード画像からの測定値は、％短縮率（FS）を定量化するために使用することができます。次のようにLV収縮末期径（LVESD）と心周期を通してLV拡張終期径（LVEDD）間の時間的変化は、短縮率（FS）の計算に使用されています：
   ％FS = [（LVEDD - LVESD）/ LVEDD]×100
3. 左心室と右心室は、頭から尻尾まで走査することにより識別されます。左側と右側に注釈が付けなければなりません。高エコー胎児血液によって生成された目に​​見える流れストリームは僧帽弁口内ドプラサンプルボリュームの正確な配置を容易にします。左室流入速度は頂四室とLV長軸ビュー（ 図4、C）の僧帽弁から取得されます。大動脈流出測定はsystoを測定するために使用することができますlicの駆出時間（ 図4、D）。心拍数は、次のフローサイクル（ 図4、CおよびD）に1フローサイクルの測定値から計算することができる。ケアは、ドップラー角を最小にするために血流やドップラービームを揃えるために取られるべきである。 60度の角度を超えて取得した値は不正確であり、避けるべきである。
4. スキャニングBモード画像は、心室中隔欠損（ 図5）のような共通の構造先天異常を識別するために使用されています。心室内ドプラサンプルボリュームが心室中隔を横切ってフローを識別するために使用されるかもしれません。簡単に監視されているパラメータを追加すると、胎児の大きさ、心拍数、流速、心嚢液貯留、および胎児水腫が含まれています。特定の心臓の欠陥の確定診断は剖検及び病理組織学的検査による追加評価が必要である。

技術的な考慮事項

左右チャムの同定BERには、開発時には心室腔の類似の寸法のために胎児の心臓イメージングでは困難な場合があります。一つの戦略は、水平面内イメージングプラットフォームを移動することによってリアルタイムで左右の胎児の向きを確立することである。鼻、肢芽、脊椎の同定は、胎児のlet /右方向を識別するのに役立ちます。可能であれば、アーチまたは肺動脈の主な分岐の可視化への流出のトラックを追跡することは、それぞれ左心室流出路または右流出路の同定が可能になる。勉強各胎児にとっては、保存された画像上で決定左右の向きに注意することが重要です。

イメージング後の動物のモニタリングとケア

イメージングの完了に続いて、ダムは、標準的な制度的処置後のプロトコルに従って、適切なハウジングに戻され、監視されています。この撮像手順に従って鎮痛は必要ありません。通常のアクティビティの完全な再開は5分以内に予想することができます。

4。胎児心エコー検査の代表的な結果

高周波プローブ（8 MHz以上）の開発は、画像が拡大し、1センチの深さで取得されたとき0.3ミリメートルの空間分解能で約0.2mmの軸方向の分解能を持っている商業心エコー装置を許可している。最近開発されたトランスデューサーのほとんどは、フィールドのアーティファクト近く回避するという利点を持っている直線的である。高周波（30〜50 MHz）の機械的なプローブは、最近5〜12ミリメートルの深さ約50μmの軸方向の分解能を可能にする、ネズミの胸や心拍数に適したものが開発されてきた。最近では、これらの高周波メカニカルプローブは、心室と弁機能とsの識別の完全な評価を可能にするカラードプラ機能を追加しましたハントは、胎児の心臓の病変。ここで説明する方法はVisualSonics VEVO 770システム上で実行され、ほぼすべての同等システムに適用することができる。現在市販されている超高周波超音波システムは、横方向の最大60ミリメートル、50〜100 mmスラスト解像度（Vevo770、VisualSonics、Inc。）と、7〜14mmの最大撮像深度を40 Hzで動作することができます。これは、50〜100mmの軸方向および臨床ACUSONセコイア超音波システムと200〜500ミリメートル横分解能、60 Hzと20ミリメートル撮像深度と比較しています。

マウス胎児の心臓の小さなサイズを考えると、マウスの胎児心エコー検査の研究では、技術的に挑戦しています。成体マウスにおける心エコー検査とは異なり、超音波検査では胎児の体軸によって定義された従来にない超音波イメージング·プレーンを使用する必要があります。子宮の蛇行も胎児の向きに影響を与え、考慮しなければなりません。さらに、ultrの侵入深さに固有の制限高周波数の超音波は、画像にそれが難しい胎児数の多い妊娠中の全ての標本を作ることができます。

超音波イメージング戦略は、先天性心血管疾患や心臓外の欠陥⁷のためのハイスループットスクリーニングを可能にする。遺伝子変異の研究を超えて、この技術は、薬理学的および毒性試験における欠陥のスクリーニングに使用されるかもしれません。この方法論はまた、注射や心室圧¹³の測定などのインターベンション手技のための指導のツールとして使用することができます。

胎児の超音波の非侵襲的な性質は、これがリアルタイムで重要な表現型の情報を提供しますので、それはまた、心血管機能は生理的条件下で評価することができますが、ためだけではなく、有利である。胎児の心臓の縦検査は、技術的には可能であるが、いくつかの理由のために挑戦のままです。同じ胎児とideの連続検査それぞれの試験で同じ胎児のntificationは明らかな構造欠陥が存在しない場合に挑戦している。子宮と胎児の動きが完全に試料の向きを変更して、縦方向のトラッキングを行い、フォローアップ測定¹⁴難しいかもしれません。

心エコー検査は、心臓の異常を識別するための強力な手法であるが、構造的な心臓欠陥の具体的な診断は、剖検及び病理組織学的検査¹⁵によりさらに具体的表現型を必要とします。遺伝子型と特定の胎児の相関は、好ましくは直ちにエコー研究の後、ダムはまだ向きや胚の場所の変更を最小限に抑えるために麻酔をかけている間に、子宮切開によって胎児を収穫する必要があります。

チャンバーの寸法や機能の正常値は、これらの値^6月10日のための文献リストを確認することをお勧めします、この手法のマウス胎児とユーザーが報告されている。査定弁膜形態の画像解像度によって制限されていますが、主要な血管を介して環状の寸法測定及び速度測定でも、早ければ9.5のEDとして実現可能である。ケアは血流とトランスデューサー^10、16との適切なアライメントを得るために払わなければなりません。

それは、心臓の大きさはマウス系統、性別や年齢に応じて変化し、急速に別の胚の時点と心拍数に変更することを強調すべきである。マウスのグループは、これらのパラメータに一致していることを確認することが重要です。胎児のイメージングだけでなくマウス系統によって異なります。例えば、妊娠CD-1ダムは日常C57/BL6株に比べてより多くの胚が含まれており、その結果、すべての検体を視覚化することがより難しいかもしれません。これらの理由から、年齢を使用し、各実験にマッチさせた対照をひずみが基準値の代わりに使用されるべきです。また、このような左心室拡張終期径および後部など、個々のパラメータの測定壁の厚さは最大^25％、8〜正常マウスで異なる場合があります。

図1。 VisualSonics VEVO 770システムを使用して、セットアップの概要。生理学的モニタリングユニットと（）VisualSonics統合されたレールシステム（B）マウスが配置され、適切に加熱基板上に制限することをいう。四肢は、ECG電極にテープで固定されています。妊娠マウス胚のレイアウトの（C）の模式図。子宮の各角内胚数、胎児の向きに加えて、大きく変動することがある。（D）を移動させる操作の平面（X軸、Y軸）を指摘した矢印付きのイメージングプラットフォーム上に配置ダムイメージングのためのダム。 Z軸は上下振動子の動き（パネルBの矢印で示される）を指します。 A、B、膀胱、L、左、R、里GHT。

図2。代表的なBモード画像。この図は、胎生14.5胎児の代表的なBモード画像が含まれています隣接する二つの胎児の（A）の可視化。ボックスは、胎児の心臓の位置を示す。方向を導くために、胎児の（B）の解剖学的ランドマーク。 4腔症ビュー（C）は 、左心室と右心室の短軸像（D）は 、右室流出路と肺動脈（PA）（E）、および左心室流出タクト（LVOT）における胎生14.5心臓と大動脈（F）です 。

図3。心室機能の代表的な評価。この図は、代表的な含まれています2D胎生14.5日で心臓の長軸像（）の心エコー、4腔症図（B）（C）M-モード心拡張期における左と右心室の内径を示す線を使用したトレース（Rの画像/ LVIDd）と4つのチャンバー像面から収縮（R / LVIDs）。心室中隔（IVS）も可視化される。

図4。代表的なドップラーアセスメント。この図は、心尖部四腔像（）内の胎生14.5心臓の2D心エコー検査の代表的な画像が含まれています。左心房と左心室腔が概説されている。僧帽弁流入を記録するためのパルス波ドプラサンプル量の（B）の代表配置（C）僧帽弁流入ドップラーパターンから拡張早期velocityおよび心房収縮（ "A"と表記）の速度を測定することができます（D）代表大動脈ドップラー波形（ "E"表記）。大動脈ドップラージェットは、駆出時間（ET）を測定するために使用することができます。心拍数（HR）は、次のフローサイクルに1フローサイクルの測定値から計算することができる。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図5。心室中隔欠損症の代表的な検出は、この図の（B）に概説されている右と左心室腔と心尖部四腔像における胎生14.5心臓（）の代表的なBモード画像が含まれています。心室中隔の存在を注意してください（C）は画像化された心臓の横断面は、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。心室萼片の欠陥（VSD）と胎生14.5心の（D）の Bモード画像は、矢印で示すように、（E）右と左心室の空洞が横切る流れの記録のためにパルス波ドプラサンプルボリュームの重畳された配置で概説されています心室中隔。（F）は横断面が試料回収した後に画像化された心臓のヘマトキシリンとエオシンで染色した。心室中隔を横切る流れを記録するためのパルス波ドプラサンプル容量の（G）の重畳配置（H）代表ドップラー（G）からのトレース左から右心室への流れを実証する。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

ディスカッション

シリアル測定を実行すると、心臓の欠陥を有する変異胎児を検出する能力は、正常および異常な心臓血管の発達を調査するための心エコーの有用性を強調しています。 in vivoでの心臓の構造と機能の解析は、正常な胎児の発達への遺伝的および非遺伝的改変の説明の中で不可欠な一部となっている。 2D誘導ドップラーの可用性は、リアルタイム画像を取得しながら心拍数と血流パター?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
VEVO 770イメージングシステム	VisualSonics		（トロント、カナダ）
RMV707B.15-45 MHzのトランスデューサー
テック3イソフルラン気化器
イソフルラン（2 - クロロ-2 - （ジフルオロメトキシ）-1,1,1 - トリフルオロエタン）