Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA de ratones infectados

Resumen

Un método para el aislamiento de los leucocitos inflamatorios adherentes de los vasos sanguíneos cerebrales de los Plasmodium berghei ANKA de ratones infectados se describe. El método permite la cuantificación así como la caracterización fenotípica de los leucocitos aislados después de la tinción con anticuerpos fluorescentes y el posterior análisis por citometría de flujo.

Resumen

Se describe un método para el aislamiento y caracterización de células adherentes inflamatorias de los vasos sanguíneos cerebrales de P. berghei ANKA-ratones infectados. La infección de las cepas susceptibles de ratón con esta cepa del parásito en los resultados de la inducción de la malaria cerebral experimental, un síndrome neurológico que recapitula algunos aspectos importantes de Plasmodium falciparum mediada por paludismo grave en ^1,2 seres humanos. Formas maduras de la malaria en etapa de sangre expresar proteínas parasitarias en la superficie de los eritrocitos infectados, lo que les permite unirse a las células endoteliales vasculares. Este proceso induce obstrucciones en el flujo sanguíneo, lo que resulta en hemorragias hipoxia y ³ y también estimula el reclutamiento de los leucocitos inflamatorios en el sitio de secuestro del parásito.

A diferencia de otras infecciones, es decir, virus neutrotopic ^4-6, ambas parasitados malaria-glóbulos rojos (pRBC) así como Inflamm asociadoAtory leucocitos permanecen secuestrados dentro de los vasos sanguíneos en lugar de infiltrar el parénquima cerebral. Así, para evitar la contaminación de los leucocitos secuestrados con no inflamatorias circulantes, células de perfusión intracardiaca extenso de los ratones infectados antes de la extracción de órganos y procesamiento de tejidos es necesario en este procedimiento para retirar el compartimento de la sangre. Después de la perfusión, los cerebros se cosechan y disecado en trozos pequeños. La estructura del tejido es más interrumpido por tratamiento enzimático con colagenasa D y DNAsa I. El homogeneizado cerebral resultante se centrifugó en un gradiente de Percoll que permite la separación de secuestrados cerebro-leucocitos (BSL) de la mielina y los residuos de otro tejido. Las células aisladas se lavan a continuación, se contaron usando un hemocitómetro y se tiñeron con anticuerpos fluorescentes para su posterior análisis por citometría de flujo.

Este procedimiento permite la caracterización fenotípica completa de la migración de los leucocitos inflamatorios en el cerebro en rerespuesta a varios estímulos, incluyendo accidente cerebrovascular, así como infecciones víricas o parasitarias. El método también proporciona una herramienta útil para la evaluación de nuevos tratamientos anti-inflamatorios en modelos animales preclínicos.

Protocolo

1. La infección de ratones con P. berghei ANKA-

1. Descongelar una alícuota de criopreservado P. berghei ANKA GRI.
2. Reprime un cerebral malaria resistente a ratones BALB / c de ratón donante (8-12 semanas de edad) mediante la técnica de restricción de dos manos. Inyectar ratón con 100-200 l de pRBC utilizando una jeringa de 1 ml de insulina (28G aguja). Rutinariamente, 1-2 ratones donantes se inyectan.
3. En 4-5 días post-infección (pi) eliminar ratón donante de la jaula y lo coloca en una estación de trabajo o un paño desechable de trabajo.
4. Suavemente contener ratón por el extremo de la cola con unas tijeras pequeñas y cortar la punta de la cola (aproximadamente 1 mm). Alternativamente, una punción pequeña cola usando una aguja de 25 G se pudo realizar.
5. Colocar una gota de sangre de la vena de la cola del ratón cerca del final de un portaobjetos de microscopio esmerilado final.
6. Coloque una segunda diapositiva (spreader) en un ángulo de 45 ° y una copia en la gota de sangre. Una vez que la sangre se extiende a lo largo del borde, pulse la víspera esparcidor de diapositivasólo en todo el portaobjetos de un microscopio para hacer el frotis de sangre. Deje que la mancha se seque al aire.
7. Fijar los frotis de sangre en 100% de metanol durante 30 segundos y luego se tiñen con Giemsa portaobjetos recién preparada durante 10 min.
8. Enjuague frotis de sangre con agua corriente durante 1 minuto, se deja secar al aire y examinar portaobjetos bajo el microscopio (100x, aceite de inmersión). Enumerar pRBC a 1.000 eritrocitos y calcular parasitemia por ciento. Los ratones donantes debería alcanzar los niveles de parasitemia entre 2.5-5% antes de que puedan ser sangrados para la infección de animales experimentales.
9. Recoger sangre del ratón donante por sangrado retro-orbital utilizando un heparinizada micro-hematocrito tubo capilar. Todos los experimentos se llevan a cabo de conformidad con el Walter y Eliza Hall Institute requisitos comité de ética animal. Dependiendo de las necesidades locales Animal Comité de Ética otros procedimientos sangrado puede ser utilizado. Disolver la cantidad necesaria de sangre en medio RPMI a una concentración final de 1x10 ⁶ pRBC/0.2 ml. Considere la posibilidad de queun hematocrito normal de ratón es ~ 6x10 ⁹ eritrocitos / ml 1.
10. Infect experimental C57BL / 6 ratones (8-12 semanas de edad) mediante la inyección por vía intraperitoneal (ip) 1x10 ⁶ pRBC/0.2 ml.
11. Para controlar los niveles de parasitemia de ratones infectados siga los pasos 1.3-1.8. La parasitemia debe determinarse cada 2-3 días a partir del día 2 o 3 pi
12. El inicio de la malaria severa en C57BL / 6 ratones pueden manifestarse como apariencia encorvada, fallo de piel y baja actividad. Algunos ratones puede recuperar en esta etapa, pero la progresión de la pérdida de reflejo autoadrizable indica enfermedad irreversible y los animales deben ser sacrificados.

2. La perfusión intracardiaca de ratones y de extracción del cerebro

1. Montar un sistema de perfusión manual de gravedad asegurando un depósito de 500 ml a un soporte de columna fijado a la parte superior de un soporte de columna de 60 cm. Conectar un tubo de plástico en el extremo inferior del depósito y garantizar una abrazadera de la tubería para controlar el flujo de tampón. Conecte el tubo a una aguja de 23 G. Fill hasta el depósito con PBS (mantenido a 22 ° C), abrir la abrazadera y permitir tampón para correr a través del tubo para eliminar todas las burbujas de aire.
2. P. eutanasia berghei ANKA-ratón infectado por inhalación de CO _2. Confirmar la muerte por la ausencia de pedal, orbital y las respuestas respiratorias.
3. Pin ratón sacrificados por las patas traseras y delanteras dorsalmente en un tablero de espuma de poliestireno disección contenida en una bandeja de plástico. Dependiendo de ética locales Animal Comité requisitos anestesia puede administrarse antes de comenzar pefusion intracardial.
4. Limpie lado ventral con 70% de etanol.
5. Con unas tijeras grandes y pinzas para abrir la piel a lo largo de la línea media para exponer la cavidad torácica. Del pliegue cutáneo y el pin a los lados.
6. Mantenga el esternón con unas pinzas finas y cortar el diafragma y a lo largo de ambos lados del esternón cortar las costillas. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos grandes.
7. Pin de la caja torácica por el esternón libremente al lado de la cabeza.
8. Mantenga ingenio ventrículosh finas pinzas y el atrio derecho incisión cuidadosamente con unas tijeras finas.
9. Inserte la aguja 23G conectada al sistema de perfusión por gravedad en el ventrículo izquierdo hacia la aorta ascendente mientras PBS está en marcha. Inserte sólo 0,5 cm de la punta de la aguja.
10. Perfundir ratón durante 5 minutos o hasta que el efluente es clara.
11. Liberar ratón y lo pondré sobre su abdomen. Limpiar la cabeza con 70% de etanol.
12. Con unas tijeras grandes, haga un corte justo por encima del área de la médula espinal cervical.
13. El uso de tijeras finas para hacer una mediana caudal-rostral corte a partir de la base del cráneo y la cáscara de la piel para exponer el cráneo.
14. Sosteniendo la cabeza, colocar las hojas de una tijera pequeñas en cada cavidad orbital y realizar un corte entre las órbitas.
15. Haga un corte longitudinal a lo largo de la sutura sagital y retire con cuidado el cráneo en cada hemisferio del cerebro hacia el exterior.
16. Usando una espátula, levante suavemente el cerebro y lo coloca en un tubo de centrífuga de 10 ml que contenía medio RPMI.

3. Aislamiento de Brain-secuestrados leucocitos (BSL)

1. Trabajando en una cabina de seguridad, lugar recién cosechado cerebro en la parte superior de un filtro de acero inoxidable de células (40-60 tamaño de malla) en una placa de Petri que contenía 3-5 ml de medio de cultivo RPMI tejido.
2. Cortar el tejido cerebral en trozos pequeños.
3. Empuje pequeñas piezas de tejido cerebral a través del colador celular usando un émbolo de cristal.
4. Transferir homogeneizado de cerebro a un tubo de 10 ml y centrifugar a 250 xg durante 10 min a 4 ° C.
5. Disolver sedimento en 3 ml de medio RPMI, que contiene 0,05% de colagenasa D y 2U/ml DNAsa I.
6. Girar mezcla durante 30 min a temperatura ambiente. Eliminar los restos celulares por empujar la mezcla a través de un filtro de células de nylon 70 micras y / o mediante la incubación en hielo durante 5 min.
7. Lay homogeneizado de cerebro en un cojín 7 ml de Percoll al 30% y se centrifuga a 400 xg (sin frenos) durante 20 min a temperatura ambiente.
8. Resuspender el sedimento en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos e incubar en hielo durante 5 min alisar pRBC adherente, que no puede ser eliminado desde el cerebro por perfusión intracardial.
9. Añadir 9 ml de medio RPMI, lavar las células y centrifugar a 250 xg durante 10 min a 4 ° C.
10. Resuspender el pellet que contiene BSL en 50-100 l de medio RPMI y las células de transferencia a un tubo Eppendorf.
11. Diluir una alícuota de 5-10 l de la muestra de células 1:2 en azul tripán para la identificación de células viables.
12. Contar las células viables bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro. A partir del día 6 en adelante, cuando pi P. berghei ANKA de ratones infectados muestran signos neurológicos, 20.000-100.000 BSLs se puede recuperar.

4. Inmunofenotipificación de BSL por citometría de flujo multicolor

1. Centrifugar las células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 l de tampón de tinción (PBS, 1% de suero de ternera fetal (FCS), 2 mM de EDTA).
2. Añadir el 1 l de anticuerpo purificado anti-CD16/32 (Fcblock).
3. Se incuban las células durante 10 min en hielo.
4. Lavar las células con 1 ml de tampón de tinción. Centrifugar las células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante.
5. Resuspender las células en 50 l de tampón de tinción que contiene predeterminados diluciones óptimas requeridas de anticuerpos fluorescentes, es decir, anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR y anti-NK1.1.
6. Incubar durante 1 hora en hielo.
7. Lavar las células con 1 ml de tampón de tinción. Centrifugar las células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante.
8. Resuspender las células en 100 l de PBS.
9. Transferir las células a un tubo de flujo plástico citometría.
10. El uso de un citómetro de flujo, obtener al menos 5,000-10,000 eventos. Adecuados controles de células no teñidas y muestras fluorocromo compensación deben ser incluidas como sea necesario.
11. Analizar los resultados utilizando el software apropiado citometría de flujo.

Resultados

Los resultados en la figura. 2 muestran porcentajes y números absolutos de las diferentes poblaciones BSL recuperados de los cerebros de los ratones control perfundidos o unperfused infectadas por la malaria e ingenuo. Aislado BSL fueron teñidas con PE-anti-NK1.1 y anticuerpos APC-anti-TCR-β como se indica en el texto del Protocolo. De acuerdo con resultados anteriores ^7-9, αβTCR ⁺ células T comprende una elevada proporción de la piscina BSL en cerebros de perfundidos infectadas por la malar...

Discusión

El aislamiento y el análisis de BSL es un método que permite la caracterización y cuantificación de células inflamatorias que migran hacia el cerebro en respuesta a la lesión tisular o la infección en modelos experimentales de ratón. La introducción de un paso de perfusión intracardiaca para la retirada del compartimento de la sangre antes de la extracción de órganos y posterior aislamiento de las células es útil para prevenir la contaminación de células inflamatorias con no inflamatorias leucocitos circ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
			Soluciones y tampones
Giemsa azur-eosina-azul de metileno solución	Merck Millipore	1.09204.0500	Dilución 1:10 en agua destilada
Medio RPMI			Ratón tonicidad
Ratón tonicidad PBS			20 mM de fosfato de sodio, 0,149 de NaCl, pH 7,3
0,4% de azul de tripano	Sigma Aldrich	T-8154	Dilución 1:2
La colagenasa D	Worthington Biochemical
DeoxyribonuClease (DNasa) I	Sigma Aldrich	D4263-5VL	De páncreas bovino
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	30% solución en PBS
Ultrapura Tris	Invitrogen	15505-020
Cloruro de amonio (NH 4 Cl)	AnalaR	10017
Red Cell Lysis Buffer			17 mM Tris, 14nm NH 4 Cl, pH 7,2
FCS	Gibco	1009
EDTA sal disódica	Merck	10093.5V	0,1 M, pH 7,2
			Anticuerpos y conjugados
Anti-ratón CD16/CD32 (Fc Block), clon 2.4G2	BD Pharmingen	553142	1 l en 50 l tampón de tinción (0.5mg/50 ml)
FITC-anti-ratón, clon CD4 H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-anti-ratón NK1.1, clon PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5-anti-ratón CD8, clon 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC-anti-ratón TCR-β, clon H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-anti-ratón de CXCR3, clon 220803	R & D Systems	FAB1685P
Biotinilado anti-ratón de CCR5, clon C34-3448	BD Pharmingen	559922
Estreptavidina-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
			Equipos y materiales
SuperFrost portaobjetos de microscopio	Lomb Menzel-Gläser
Pinzas de disección, tijeras	REDA Instrumente
500 ml de PBS reservorio	Nalgene
Caucho tubería
Aguja 23G	BD PrecisionGlide	302008
Disociación celular kit que contiene metal tamiz	Sigma Aldrich	CD-1
70 micras filtro de células de nylon	BD Falcon	352350
Hemocitómetro	Neubauer GmbH	717810
Tubos de citometría de flujo	BD Falcon	352008