Diseño y uso de arrays de quimiostato multiplexados

Resumen

Hemos desarrollado y validado una serie de pequeñas dimensiones, de quimiostatos miniatura construidas con piezas fácilmente disponibles por un costo bajo. Resultados de la evolución fisiológica y experimental fueron similares a quimiostatos de mayor volumen. La matriz Ministat proporciona una plataforma compacta, barata, y accesible para los experimentos chemostat tradicionales, genómica funcional, y aplicaciones químicas de detección.

Resumen

Quimiostatos son sistemas de cultivo continuo en el que las células se cultivan en un muy controlado, ambiente químicamente constante donde está limitada la densidad de cultivo mediante la limitación de nutrientes específicos. ^1,2 Datos de quimiostatos son altamente reproducibles para la medición de caracteres cuantitativos, ya que proporcionan una tasa de crecimiento constante y el medio ambiente en estado estacionario. Por estas razones, quimiostatos se han convertido en herramientas útiles para la caracterización a escala fina de la fisiología a través del análisis de la expresión génica ^3-6 y otras características de los cultivos en equilibrio de estado estacionario. ⁷ experimentos a largo plazo en quimiostatos puede resaltar trayectorias específicas que las poblaciones microbianas adopten durante la evolución adaptativa en un entorno controlado. De hecho, quimiostatos se han utilizado para la evolución experimental desde su invención. ⁸ Un resultado común en experimentos de evolución está para cada réplica biológica para adquirir un repertorio único de mutaciones^9-13. Esta diversidad indica que aún queda mucho por descubrir mediante la realización de experimentos de evolución con un rendimiento mucho mayor.

Se presenta aquí el diseño y operación de una relativamente simple, de bajo costo de matriz quimiostatos-o miniatura ministats-y validar su uso en la determinación de la fisiología y en experimentos de evolución con levadura. Este enfoque implica el crecimiento de decenas de quimiostatos funcionan con una sola multiplexado bomba peristáltica. Los cultivos se mantienen en un volumen de 20 ml de trabajo, que es práctico para una variedad de aplicaciones. Tenemos la esperanza de que el aumento de rendimiento, disminución de gastos, y la disponibilidad para la construcción detallada e instrucciones de operación también pueden motivar la investigación y la aplicación industrial de este diseño como una plataforma general para caracterizar funcionalmente gran número de cepas, las especies y los parámetros de crecimiento, así como la genética o bibliotecas de medicamentos.

Introducción

La dinámica del crecimiento microbiano y la evolución son fundamentales para la microbiología, la ecología, la genética y la biotecnología. El método más común de los microbios de cultivo es en lotes, donde las células se inoculan a baja densidad en caldo rico en nutrientes y se cultivaron hasta saturación. Aunque fácil de realizar utilizando un equipo estándar de laboratorio, cultivos discontinuos experimentar un ambiente químico fluctuante y en consecuencia cambiar la fisiología celular. Este entorno de crecimiento heterogéneo puede resultar en efectos secundarios de crecimiento y estrés que pueden enmascarar sutiles diferencias fisiológicas. Evolución experimental mediante transferencia por lotes de serie puede seleccionar para mezclas complejas de subpoblaciones fase de crecimiento específicos, lo que complica los intentos de conexión adaptaciones específicas para condiciones selectivas. Medición de caracteres cuantitativos puede ser difícil debido al ruido de sincronización de la muestra imprecisa y la variación en las características tales como tiempo de retraso. Cultivos continuos proporcionan una alternativarégimen de crecimiento donde las células puede ser reproducible cultivada en un medio químicamente homogénea a una tasa de crecimiento definido para alcanzar un estado de equilibrio fisiológico. Debido a estas ventajas, los estudios de evolución experimental y caracterización del estado celular utilizan a menudo el ambiente controlado de cultivos continuos como el quimiostato. ¹⁴

Valoración de estas ventajas ha llevado a un resurgimiento del interés en chemostat culturas. ¹⁵ Desde su introducción en 1950, ^1,2 chemostat sistemas han sido desarrollados para funcionar en una variedad de escalas que van desde litros a microlitros y para una variedad de aplicaciones. ^{16 -19} Estos diseños diferentes, que van desde biorreactores producidos comercialmente a los buques glassblown a las plataformas de microfluidos personalizados, comparte los principios generales de diseño. Una cámara de cultivo se agita y se airea (generalmente por burbujeo de aire a través de él) y los microbios contenidos en el mismo se mantiene homogéneaLy dispersado por toda la cámara de cultivo en todo momento. Medio fresco de la composición definida se añade continuamente y la velocidad de adición controla la tasa de crecimiento y la influencia del entorno químico experimentado por el cultivo. Un desbordamiento establece el volumen de cultivo en el tubo de crecimiento, y a través de este desbordamiento de la cultura se muestrea a la misma velocidad a la que entra en medio fresco. De esta manera las culturas alcanzan rápidamente un estado fisiológico estable en el que muchos parámetros biológicos se mantienen constantes. A pesar de las ventajas de quimiostatos e informes de estas plataformas diferentes en la literatura, la adopción generalizada se ha visto limitado por dificultades en la construcción y operación de estos sistemas, y los altos costos asociados con las opciones comerciales. Además las descripciones de cómo realizar y utilizar estos dispositivos pueden ser opacas.

Se presentan diseños e instrucciones de uso de una matriz de pequeñas dimensiones, de quimiostatos miniatura construidos a partir de piezas fácilmente disponibles a bajo costo. Nos obsErve parámetros experimentales altamente consistentes y reproducibles resultados al comparar nuestro dispositivo con los datos reportados por levaduras cultivadas en biorreactores de mayor volumen comercial. Esto incluye la reproducibilidad de la fisiología celular como se ve a través de alcanzar el estado estacionario de equilibrio dentro de 10-15 generaciones y la obtención de densidades similares de cultivo en el equilibrio. Además, los patrones de expresión génica son consistentes entre ministats y una plataforma comercial de mayor volumen. Estabilidad de la tasa de dilución, la densidad óptica y la reproducibilidad de la expresión génica entre tres cultivos replicados demostrar la robustez de nuestra plataforma. También muestran que las mutaciones de adaptación surgen las mismas sobre escalas de tiempo similares evolución experimental como con quimiostatos de mayor volumen.

Protocolo

Utilice una técnica estéril apropiada durante todo el protocolo.

1. Montaje de piezas y preparación para la matriz Ministat

1. Encargar todas partes.
2. Limpiar los tubos de vidrio. Marque los tubos con un volumen de 20 ml.
3. Hacer asambleas de corcho con aire, medios de comunicación y los puertos de efluentes y colocarlos en la parte superior de los tubos de cultivo de vidrio limpios.
4. Preparar cámaras de humidificación y organizar todas las piezas no tratadas en autoclave.
5. Hacer aire, efluentes, y los tubos de medios con longitudes suficientes tubos y acoplamientos compatible.
6. Conecte cada tipo de tubería (aire, medios de comunicación y efluente) a los conjuntos de corcho y los filtros de papel de aluminio y los medios de comunicación. Conexión rápida a fin de prepararlos para el autoclave
7. Preparar una bombona para su uso en la fabricación de chemostat medio estéril.
8. Prepare las botellas de muestreo de cultivo mediante la inserción de un tapón de goma con dos orificios con los accesorios adecuados. Frustrar cada filtro para prepararlos para la autoclave.
9. Fit la matriz montado fácilmente en una o más bandejas autoclave y dejar todas las partes.
10. Marca y filtrar los medios de comunicación chemostat en bombonas autoclave.

2. Configuración de una prueba

1. Llena cada frasco con 700 ml hidratación ddH ₂ O.
2. Coloque los ministats autoclave en el conjunto de bloque de calentamiento a la temperatura deseada.
3. Coloque las compañías aéreas en el múltiple de 4 puertos y encienda la bomba de aire.
4. Conecte los conductos de evacuación a las 100 botellas de la colección ml.
5. Retirar la lámina desde el extremo de la tubería de medios de comunicación y medios de bombona y conectar el rápido de dos conecta. Pase cada uno de longitud de tubo de la bomba a través de un cartucho de bomba peristáltica y haga clic en su lugar. Encienda la bomba de medios de comunicación.
6. Vamos a llenar las cámaras. Apague la bomba de medios de comunicación.
7. Pulverizar los conjuntos de corcho con 70% de etanol y inocular los cultivos utilizando una jeringa. Guardar una muestra del inóculo como un stock de glicerol congeladosi se desea. Vamos culturas crecer durante 30 horas.
8. Ajustar la altura de la aguja efluente hasta que el volumen de cultivo se ajusta a 20 ml con el flujo de aire apagado. Esto puede tardar varios ajustes en el transcurso de una hora. Cuando termine su vez el flujo de aire de nuevo.
9. Encienda la bomba multimedia en.
10. Vaciar las botellas de muestreo de efluentes, que contienen los medios de comunicación recogieron durante el ajuste del volumen de cultivo de trabajo, y registrar el tiempo.
11. Para tomar un lugar medición del tiempo de cero a los conductos de evacuación en tubos de recolección estériles durante 15 minutos-2 horas (dependiendo de qué volumen desea muestrear para análisis de ADN). También hacer una reserva de glicerol congelado para cada cultura en este momento si lo desea.

3. Las mediciones diarias

1. Al igual que con el tiempo-cero de medición, la muestra en hielo durante 15 min-2 h (como se requiere para la prueba) en hielo y registrar el tiempo de muestreo para el ADN y las muestras congeladas de stock.
2. Para las muestras de ARN o bien recoger una pequeña volbio mediante una jeringa y una aguja 22G 5 "de la cultura o descorchar cada Ministat para cosechar toda la cultura. Las muestras deben ser tomadas rápidamente, recogió por filtración y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido.
3. Mida el efluente retenido desde la última toma de muestras para cada Ministat para cuantificar la tasa de dilución. Ajuste de dilución si es necesario por el reajuste de la configuración de la bomba o el ajuste del ajuste fino en las líneas individuales de la bomba.
4. Vuelva a colocar los conductos de evacuación en botellas de colección vacía.
5. Cuantificar células / ml, así como criterios de valoración de interés y hacer una reserva de glicerol congelado.

4. Post-experimento limpieza

1. Coloque todos los tubos en bandejas separadas y enjuagar excesivamente con ddH ₂ O. Tubería seca con una bomba de acuario.
2. Limpie los conjuntos de corcho con ddH ₂ O y usar inserto la aguja para limpiar las agujas, aspirar y dispensar agua a su vez. Limpiar el exterior de las agujas y de corcho para eliminar cualquiermedios residuales.
3. Limpiar el tubo de vidrio con agua y etanol, y eliminar los contaminantes físicos con 3 bola con Kimwipes y fórceps.
4. Enjuague y seque todas las partes de nuevo antes de su uso.

Resultados

La matriz Ministat descrito anteriormente y en la (Figura 1A, B) fue usado para cultivar una cepa de laboratorio MATa haploide de levadura de gemación (S288c) bajo condiciones limitantes de sulfato como se describe anteriormente. ¹⁰ Hemos probado la eficacia para aplicaciones chemostat comunes incluyendo la determinación de la fisiología y evolución experimental. Para validar los ministats, se repitió varios experimentos realizados anteriormente en fermentadores industriales modificados para uso quimiostato. ^10,20,21 Sixfors ATR fermentadores se llevaron a cabo en un volumen de 300 ml de trabajo, más de diez veces el volumen de los ministats, y tienen modos considerablemente diferentes cultura de la aireación y agitación. Hemos intentado replicar estabilidad equipo, fisiología estado estacionario, los resultados experimentales evolución, y patrones de expresión génica obtenidos con estos fermentadores.

Dado que la uniformidad de la tasa de dilución y la aireación son aspectos importantes del diseño de quimiostato, que measured la tasa de dilución real a través de 32 ministats después de 15 generaciones de crecimiento y se ha encontrado que con una tasa de dilución objetivo de 0,17 vol / hr (4-5 gotas / min) se alcanzó una tasa de dilución promedio de 0,17208 con una desviación estándar de 0,0075 a través de 32 se replica. Esta gama estaba dentro de nuestro tolerancia típica de + / -0,01 vol / hr diferencia de la fijación de objetivos, más allá de que cambios a gran escala en la expresión génica se han observado. ^22-23 Across 4 ministats la tasa de flujo de aire se determinó que era 307,5 ​​ml / min con una desviación estándar de 9,57 ml / min. Esto sugiere que el flujo de aire dentro de las cámaras es robusto y divide por igual entre las 4 cámaras y es un valor similar a la descrita para la aireación en fermentadores industriales. ²⁰

Hemos observado anteriormente amplificación recurrente de la SUL1 transportador de alta afinidad de iones de azufre en 8.8 experimentos de evolución sulfato limitados en la levadura. ¹⁰ Teniendo en cuenta la coherencia de los resultados de acuerdo con thicondición s elegimos sulfato de limitación para poner a prueba la capacidad de nuestro sistema. Un elemento necesario de la cultura chemostat es la necesidad de mantener un ambiente químico constante. Las fluctuaciones en la abundancia de una limitación de nutrientes o cambios de otro tipo en el medio ambiente suelen dar lugar a un cambio en el número de células en un cultivo dado. Se midió la densidad óptica tal como un proxy para el número de células (Figura 2A) y la reproducibilidad medido a través de 16 cultivos replicados, encontrar un promedio A600 de 1,12 (~ 10 ⁹ células) después de ~ 15 generaciones de crecimiento con una desviación estándar de 0,057 unidades, o 5,1 %. Para la comparación, las medidas tomadas de 4 cultivos replicados cultivadas en los fermentadores industriales mostraron una desviación estándar de 2,5%. Las células fueron bien mezclados en la cámara de crecimiento: mediciones de OD y recuento de células tomadas de la pista efluente eran equivalentes a las muestras tomadas directamente desde el tubo de cultivo (datos no mostrados). Estos resultados demuestran la solidez de nuestra plataforma de und capacidad para mantener un ambiente químico constante con una tolerancia similar a la del fermentador industrial.

En una lectura más sensible de la fisiología, se comparó el genoma expresión estable del gen estado de los cultivos que crecen bajo limitación sulfato en las ministats y en el fermentador industrial. La expresión génica en las ministats mostraron un alto grado de similitud a través de tres réplicas biológicas (Figura 2B). Hemos observado anteriormente que para el ARN derivado de dos quimiostatos Sixfors repetidos y de co-hibridizada a un microarray, la expresión de genes de 99% cayó dentro de un rango de 1,5-veces, lo que permite el uso de 1,5 X como un corte de significación empírica. ²¹ la expresión génica desde ministats tres replicados, por parejas, en comparación mostró 99% de los genes cayó dentro de un rango de 1.5-1.7 veces, comparable a los resultados de los fermentadores industriales. Las tres muestras se hibridó con los conjuntos individuales y las relaciones de pares calculados después, por lo que estos VAlues incluyen inter-array ruido además de ruido biológico, potencialmente sobreestimar la variación entre las réplicas en comparación con los publicados, co-hibridados resultados. 138 genes fueron expresados ​​diferencialmente> 1,5-veces en todos los Ministat tres repeticiones en comparación con una muestra obtenida de un cultivo crecido emparejado en el fermentador industrial. Genes disminución en la expresión en las ministats se enriquecieron en gran medida por el metabolismo del hierro. Esta firma puede reflejar la composición del metal diferente de cada configuración de dispositivos: el aparato Sixfors incluye un impulsor de metal y ensamble aireación inmerso en la cultura, los medios de comunicación y la garrafones utilizado anteriormente también se requiere hardware metal. El Ministat utiliza agujas de acero inoxidable, pero ningún componente metálico. Los genes con una mayor expresión se asocia en gran medida con las membranas celulares, aunque la importancia biológica de esta asociación no está claro.

Por último, hemos probado unde evolución experimentalr estas condiciones. Después de 250 generaciones de sulfato limitado crecimiento, 4/4 clones ensayados de 4 poblaciones independientes evolución mostraron amplificación de SUL1 como se detecta por hibridación genómica comparada (CGH, Figura 2C). Este resultado es consistente con los hallazgos en quimiostatos de mayor volumen en intervalos de tiempo similares. ¹⁰

1. A. Diseño y disposición de la matriz Ministat. Figura B. Diseño de la cámara de cultivo.

Figura 2. A. ExperimeNTAL datos que muestran que los cultivos alcancen el equilibrio dentro de diez generaciones de crecimiento (n = 16). B. Datos de expresión para tres repeticiones biológica S1-3 muestreadas durante el estado estacionario bajo limitación de sulfato en comparación con una referencia común crecido en un conjunto combinado de sulfato limitado chemostat Sixfors C. amplificaciones. SUL1 recuperado en ministats después de 250 generaciones de crecimiento en un entorno de sulfato limitado. El ADN genómico de cada clon evolucionado se comparó con el ADN ancestral por CGH como se describe. ²¹ La media de número de copia se calculó para cada región amplificada y se muestra junto a cada uno de amplificación. Todos los datos de microarrays se depositan en la base de datos GEO bajo adhesión GSE36691. Haga clic aquí para ampliar la figura.

Discusión

Cultivo en chemostat los ministats, como con cualquier chemostat, requiere atención al detalle y la resolución de problemas. Dado que la contaminación es de gran preocupación en experimentos con cultivos continuos, se suelen mirar a través de microscopio en busca de contaminación bacteriana y fúngica tras la inoculación y cada 50 generaciones durante experimentos de evolución a largo plazo. Hasta la fecha no hemos observado contaminación a través de 96 experimentos de evolución de más de 300 generaciones (datos no mostrados). Para la prueba de contaminación cruzada entre ministats y el potencial de microbios para colonizar la cámara de cultivo por medio de la línea de efluente que corrió 16 ministats tales que cada Ministat otro se inoculó con la levadura como anteriormente y el resto no se inocularon con cualquier cultura. Los cultivos se recogen en un contenedor de residuos comunales, que se vació cada dos días. Así, si fuera posible que los contaminantes para entrar a través de la línea de efluente que probablemente han observado que en este experiment. Durante tres semanas y más de 100 generaciones de crecimiento en este patrón de tablero de ajedrez de los cultivos inoculados y no inoculadas No se observó crecimiento en no inoculadas tubos de cultivo MINISTAT, lo que sugiere que la contaminación de la levadura u otros microbios exterior es poco probable que ocurra en los experimentos de marcos de tiempo similares.

Aunque los ministats fueron diseñadas para operar en un modo análogo a quimiostatos comerciales, la naturaleza modular de esta disposición permite la optimización para adaptarse a las necesidades del usuario y el presupuesto. La bomba peristáltica utilizada en este protocolo pueden lograr tasas de flujo entre 0,0186 vol / hora a 3,6 vol / h (datos no mostrados). Mayor control de las tasas de dilución se podría lograr con modelos de bombas alternativos. Tenga en cuenta que la operación a tasas de dilución inferiores pueden requerir la sustitución de una aguja de calibre más alto para lograr la misma frecuencia de entrega de las gotitas. Tamaño de la población es un factor importante para el diseño adecuado de los experimentos de evolución.La tasa de dilución estándar y la concentración de nutriente utilizado aquí proporciona un tamaño de población relativamente grande (~ 10 ⁹ células) del mismo orden de magnitud que los estudios publicados evolución. ¹¹ poblaciones más grandes o más pequeñas podría ser mantenida por cambiar el volumen de trabajo o limitar la concentración de nutrientes. Aumento en el suministro mutación también podría obtenerse trabajando con cepas con elevadas tasas de mutación.

Los ministats también podría ser mejorado en nuestro diseño actual. Por ejemplo, la condensación puede acumularse en las paredes del tubo de cultivo y se puede reducir considerablemente mediante el uso de un baño de agua profunda, incubadora, o sala a temperatura constante. Aunque aglutinación y crecimiento de la pared en sulfato de cultivos limitados parece ser relativamente poco frecuente, apareciendo en experimentos de evolución 5/48 por 300 generaciones (datos no mostrados), una variedad de tensioactivos están disponibles que pueden ayudar a disminuir o retrasar este rasgo. En el caso de que interfiere con la formación de grumos cultivo adecuadola mezcla y agitación, aumento se puede lograr mediante la reducción de la cantidad de formas se divide cada bomba de aire, o mediante la adición de un aparato de agitación. Sondas adicionales para la concentración de gas disuelto, pH, u otros parámetros también pueden ser incluidos, como en algunos otros diseños. ¹⁷

A pesar de las modificaciones posibles, utilizando los ministats como se describe en este protocolo, se observó parámetros experimentales altamente consistentes y reproducibles resultados al comparar nuestro dispositivo con los datos reportados por quimiostatos de mayor volumen comercial. Esto incluyó la reproducibilidad de la fisiología celular como se ve a través de alcanzar el estado estacionario de equilibrio dentro de 10-15 generaciones (Figura 2A) y la obtención de densidades similares de cultivo en el equilibrio. Patrones de expresión génica fueron consistentes entre los tres repeticiones biológica en ministats y entre ministats y comerciales de gran volumen plataformas (Figura 2B), con la excepción de los genes del metabolismo de hierro. Estos expresión diferencias son causados ​​probablemente por los cambios en el contenido de metal de los dos dispositivos o mejoras en la calidad de los ingredientes de los medios. Nuestros datos sugieren que ministats será útil para experimentos de fisiología o competición donde se requiere un ambiente consistente.

Para probar si el diseño Ministat es suficiente para aplicaciones evolución experimental que se desarrollaron culturas con limitación sulfato para 250 generaciones y CGH utilizado para caracterizar la amplificación del locus SUL1 -. Un sello de evolución a largo plazo en estas condiciones en quimiostatos mayor volumen ¹⁰ Observamos amplificación de SUL1 en clones de 4/4 experimentos de evolución independientes en sulfato limitados medios de comunicación (Figura 2C). Tomados en su conjunto estos datos sugieren que ministats son una plataforma robusta que puede ser útil para una variedad de aplicaciones chemostat tradicionales. A pesar de que ha demostrado su uso en el cultivo de levadura en ciernes, los ministats deberíatambién ser compatible con otros organismos y diseños similares, de hecho, han sido utilizados para el cultivo de bacterias y otras especies de levadura. ^16,17,25 Además, el volumen menor cultura y la necesidad de una correlación disminuyó para los medios de comunicación pueden hacer ministats una alternativa atractiva para experimentos que requieren costosos o exóticos reactivos como puede ser el caso en química o cribados genéticos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
3/32 "x 7/32" tubo de silicona	VWR	63009-260	Tubería: Orden: (50 'pack de bobina)
1/2 "x 5/8" tubo de silicona (extra grande)	VWR	63009-299	Tubería: Orden: (50 'pack de bobina)
1/4 "x 3/8" tubo de silicona (medio)	VWR	63009-279	Tubería: Orden: (50 'pack de bobina)
Orange verde Marprene tubería de la bomba	Watson-Marlow	978.0038.00 +	Tobogán: Order: 6x (paquete de 6)
Luer hembra, 1/8 "púa	Cole Parmer	HV-45500-04	Conectores: Orden: 4x (paquete de 25)
Hombre de bloqueo luer, 1/8 "púa	Cole Parmer	HV-45503-04	Conectores: Orden: 1x (paquete de 25)
La reducción de conector, PVDF, 1/4 "a 1/8"	Cole Parmer	EW-30.703-50	Conectores: Orden: 1x (paquete de 10)
Barbed conector en Y, 1/8 "ID	Cole Parmer	HV-30703-92	Conectores: Orden: 3x (paquete de 10)
Abrazaderas de tubos Medio	VWR	63022-405	Abrazaderas: Orden: 1x (paquete de 12)
Día abrazadera (clamp metálico para tubos)	VWR	21730-001	Abrazaderas: Orden: 1x (paquete de 10)
En línea con válvula macho de conexión rápida, se ajusta a tubería: 1/4 pulg	Pescador	05-112-39	Conectores: Orden: 1x (paquete de 25)
Mujer en línea con válvulas de conexión rápida, se ajusta a tubería: 1/4 pulg ID, Polipropileno	Pescador	05-112-37	Conectores: Orden: 1x (paquete de 5)
Bombas Silent Air	Acuario Guys.com	212422	Air Supply: Orden: 4 bombas
PTFE filtros, 0,45 m, para la filtración de aire	Cole Parmer	HV-02915-22	Air Supply: Pedido: 1 x (caja de 100)
Frasco de 1L con arma	Pescador	10-181F	Air Supply: Orden: 2x (paquete de 6)
# 8 tapón de silicona, 3/8 en el agujero, para matraces sidearm	Pescador	K953715-0801	Air Supply: Orden: 8 tapones
4-Port colector	Cole Parmer	EW-06464-85	Air Supply: Orden: 8 colectores
55 ml tubos con tapa de rosca de cultivo	Corning Ciencias de la Vida	9825-25	Sala de Cultura: Orden: 2x (paquete de 48)
Hipodérmica Regular blanco cubo de la aguja, 16G, 5 pulgadas de longitud para la línea de efluentes	Pescador	14-817-105	Sala de Cultura: Pedido: 1 x (paquete de 100)
Aguja de punción espinal	VWR	BD40836	Sala de Cultura: Orden: 4x (paquete de 10)
Aguja hipodérmica rosa Regular	Pescador	14-817-104	Sala de Cultura: Pedido: 1 x (paquete de 100)
Espuma de silicona tapón de tamaño "2", de color rosa	Cole Parmer	EW-06298-06	Sala de Cultura: Orden: 2x (paquete de 20)
8-Bueno Gradilla	VWR	82024-452	Sala de Cultura: Orden: 4 bastidores
Botella Reservoir 10L con manguera de desagüe inferior: seguro vacío	VWR	89001-530	Medios: Solicitar: 2 o más
Espuma amarilla tapón de silicona, no estándar tamaño 12	Cole Parmer	EW-06298-22	Medios: Solicitar: 2 o más
Bombona filtro de ventilación	Pescador	SLFG 050 10	Medios: Solicitar: 1x (paquete de 10)
Cinta aislante, verde	Amazon.com	10851-BA-10	Medios: Solicitar un rollo.
Botella superior del filtro, 1L, 0,2 m, 45 mm	VWR	29442-978	Medios: Solicitar: (1 caso de 12)
5000 ml botella depósito con salida inferior: Vacuum seguro	VWR	89003-384	Medios: (Opcional)
Tapón azul de silicona Espuma, nonstandardsize 10 1/2	Cole Parmer	EW-06298-18	Medios: (Opcional)
205S/CA16, 16 cartucho de la bomba	Watson-Marlow	020.3716.00A	Bomba de medio: Orden: 1
16-canal Extensión 205CA cabezal de la bomba	Watson-Marlow	023.1401.000	Bomba de medio: Orden: 2 cabezales de bomba de extensión
Silicona acuario sellador	Pescador	S18180B	Bomba de medio: Orden: 1
6 cuadras baño seco	VWR	12621-120	Heatblock: Orden: 2 para 32 ministats o 1 para 16.
Bloque para drybath, 6 x 25 mm tubo de ensayo por bloque	VWR	12621-120	Heatblock: Orden: 12 por 32 ministats o 6 para 16.
Los filtros de membrana de nylon de 0,45 micras de tamaño de poro; Diámetro: 25 mm.	Pescador	R04SP02500	Cosecha: Pedido: 1 x (paquete de 100) (opcional)
Filtros de membrana de nylon, tamaño de poro 0,45 micras; 45 mm	Pescador	R04SP04700	Cosecha: Pedido: 1 x (paquete de 100) (opcional)
47 aparato mm, filtro grande	Pescador	XX10 047 30	Cosecha: Pedido: 1 (opcional)
Glass soporte del filtro, 25 mm, aparato de filtro pequeña	VWR	26316-692	Cosecha: Pedido: 1 (opcional)
Frasco Dewar, 1L para nitrógeno líquido	VWR	63380-052	Cosecha: Pedido: 1 (opcional)