多重ケモスタットアレイの設計および使用

要約

我々が開発し、低コストで容易に入手できる部品から構築ミニチュアケモスタットのフットプリントの小さい配列を検証されています。生理学的および実験的な進化の結果は、大きなボリュームケモスタットに類似していた。 ministatアレイは、従来のケモスタット実験、機能ゲノミクス、化学スクリーニングアプリケーションのため、コンパクトで安価、かつアクセス可能なプラットフォームを提供します。

要約

ケモスタットは、細胞を培養密度は、特定の栄養素を制限することによって制約されて厳密に制御され、化学的に一定の環境に成長させた連続培養システムです。ケモスタットから^1,2のデータは、それらが一定の成長率を提供するように定量的な表現型を測定するための非常に再現性がある定常状態で、環境。これらの理由から、ケモスタットは、遺伝子発現^3-6および定常均衡における文化の他の特性の分析による生理機能の微細特性評価のために有用なツールとなっています。ケモスタット⁷長期実験は微生物集団が採用する特定の軌跡を強調表示することができます制御された環境での適応進化の過程。実際には、ケモスタットは、その発明以来、実験的な進化のために使用されている^。8進化実験における一般的な結果は、されている各生物の複製のために突然変異のユニークなレパートリーを取得する^{。9-13は、}この多様性は、はるかにはるかに大きなスループットと進化実験を行うことによって発見されるようにそこに残っていることを示唆している。

我々はここでミニチュアケモスタットまたは比較的単純な、低コストのアレイの設計と動作提示ministatsを、生理学の決定において、酵母による進化実験におけるそれらの使用を検証します。このアプローチは、ケモスタット数十単一の多重化蠕動ポンプをオフに実行の成長を伴います。文化は、様々な用途のために実用的である20ミリリットル作業容積に維持されています。これは、経費を減らし、スループットを向上させることを願っていますし、詳細な建物と操作指示を提供することにも機能的に株、種、成長パラメータの多数を特徴付けるための一般的なプラットフォームとして、このデザインの研究と産業応用のやる気を引き出すだけでなく、遺伝的なことがまたは薬物ライブラリ。

概要

微生物の成長と進化の原動力は微生物学、生態学、遺伝学、バイオテクノロジーの基礎である。培養微生物の最も一般的な方法は、細胞が栄養豊富な培地に低密度で接種し、飽和状態に栽培されているバッチである。標準的な実験装置を使用して実行することは簡単だが、バッチ培養は、変動の化学的環境を体験し、それに応じて、細胞生理を変える。この異種の生育環境は、二次成長と微妙な生理的な違いを隠すことができるストレスの影響をもたらすことができます。シリアルバッチ転送による実験的進化は特定の選択条件に適応を接続しようとする試みを複雑にし、成長期特有の亜集団の複雑な混合物のために選択することができます。定量的な表現型の測定は、ラグタイムなどの機能で不正確なサンプルタイミングとバリエーションからノイズに起因する困難にな​​る可能性があります。連続培養は、代替手段を提供細胞が再現生理定常状態に到達するために定義された成長率で化学的に均質な環境で栽培することができる成長レジーム。これらの利点により、細胞の状態の実験的進化と特性評価の研究はしばしばケモスタットのように連続培養の制御された環境を利用しています¹⁴

これらの利点の増価はケモスタット文化への関心の復活につながっている^。15 1950年の発売以来^、1,2ケモスタットシステムはリットルからマイクロリットルに至るまで様々なスケールで、様々なアプリケーションを機能させるために開発されてきた¹⁶シェアは、商業的に生産バイオリアクターからglassblown船舶へのカスタムマイクロ流体プラットフォームへの一般的な設計原則の範囲^-19これらの様々なデザイン、。培養室を攪拌し、通気し（通常はそれを介して空気をバブリングすることによって）、その中に含まれる微生物は均質保持されているLyはすべての回で、培養室全体に分散。定義された組成の新鮮な培地を継続的に追加され、添加速度は、成長率を制御し、文化が経験した化学的環境に影響を与えている。オーバーフローが成長チューブ内培養液量を設定し、このオーバーフローによって文化を新鮮な培地が入ったときと同じレートでサンプリングされます。このように文化はすぐに多くの生物学的パラメータが一定のままでいる生理定常状態に達する。ケモスタットや文学では、これらのさまざまなプラットフォームでのレポートの利点にもかかわらず、広範な普及は、これらのシステムの構築と運用の難しさ、および商用オプションに伴う高コストによって制限されています。さらに、これらのデバイスを作成し、使用する方法の説明が不透明であることができる。

私たちは、デザインと低コストで容易に入手できる部品から構築ミニチュアケモスタットのフットプリントの小さい配列の使用説明書を提示します。我OBS大きなボリュームの商用バイオリアクターで培養した酵母のための報告されたデータへの我々のデバイスを比較する際に非常に一貫性のある実験パラメータと再現性のある結果をerve。これは10から15世代以内定常状態平衡に達すると平衡状態で似たような文化の密度を得ることを通じて見られるように、細胞生理の再現性を備えている。さらに、遺伝子発現パターンはministatsや商業大音量のプラットフォーム間で一貫しています。 3複写文化間の希釈率、光学濃度および遺伝子発現の再現性の安定性は、当社のプラットフォームの堅牢性を実証している。また、同じ適応変異が大きく、ボリュームケモスタットと同様に同様の実験進化の時間スケールで起こることを示している。

プロトコル

プロトコルを通して適切な滅菌技術を使用してください。

1。のための部品を組み立ててMinistatアレイを準備する

1. すべての部品を注文してください。
2. ガラス管を清掃してください。 20mlの音量でチューブをマークします。
3. コルク空気とアセンブリ、メディア、および排水口を作り、洗浄したガラス培養管の最上部に置いてください。
4. 加湿チャンバーを用意し、すべての非オートクレーブした部品を配置します。
5. 十分なチューブの長さと互換性のあるカップリングを使用して空気、排水、およびメディア·チューブを作る。
6. オートクレーブのためにそれらを準備するためにコルクアセンブリおよび箔フィルターやメディアクイック接続にチューブの各種類（空気、メディア、および廃液）を接続します。
7. 無菌ケモスタット培地を作る際に使用するためにカーボイを準備します。
8. 適切な金具を使用した2穴のゴム栓を挿入することにより、文化のサンプリングボトルを準備します。オートクレーブのためにそれらを準備するために、各フィルタをくじく。
9. 無線LANトンきちんと一つ以上のオートクレーブトレイに配列を組み立てて、すべての部品をオートクレーブ。
10. オートクレーブしたガラス製にケモスタットメディアを作成し、フィルタリングします。

2。実験のセットアップ

1. 700ミリリットル蒸留H ₂ Oでそれぞれ水和フラスコを埋める
2. 所望の温度に設定した加熱ブロックにオートクレーブしministatsを置きます。
3. 4ポートのマニホールドに航空会社を置き、空気ポンプの電源をオンにします。
4. 100mlのコレクションボトルに廃液ラインを接続します。
5. メディアチューブとメディアカーボイの端からホイルを外し、クイックコネクト2を接続してください。蠕動ポンプカートリッジにポンプチューブのそれぞれの長さを通し、所定の位置にそれらをクリックします。メディアポンプの電源をオンにします。
6. チャンバが埋めるましょう。メディアポンプの電源を切ります。
7. 70％エタノールでコルクアセンブリをスプレーし、シリンジを用いて培養を接種する。凍結グリセロールストックとして接種のサンプルを保存必要に応じて。培養は30時間のために成長しましょう​​。
8. 空気の流れをオフにして培養液量を20mlに設定されるまで、排水針の高さを調整します。これは、時間の経過とともに、いくつかの調整を取ることができる。するときは、背面の空気の流れを回し終えた。
9. 上のメディアポンプを回します。
10. ワーキング培養液量を設定し、時間を記録しながら、収集したメディアを含む廃液サンプリングボトルを空にします。
11. 時間ゼロで測定場所を取るために15分-2時間（DNA分析のためにサンプルを取りたいどのボリュームに依存します）のための無菌採血管に排水ライン。必要に応じても、この時点でそれぞれの文化のためにグリセロール凍結ストックを作る。

3。連日測定

1. 氷上で15分-2時間（あなたの実験のために必要）を氷上で自分の時間ゼロ測定は、試料とDNAおよび凍結ストックのサンプルのためにサンプリング時間を記録として。
2. RNAサンプルのいずれか小さいvolを集めるために培養液からシリンジと22G 10 "針を使用してUMEや文化全体を収穫するために、各ministatを抜く。サンプルを濾過によって集め、素早く取り出し、液体窒素中で直ちに凍結しなければなりません。
3. 希釈率を定量化するために、各ministatための最後のサンプリング以来収集した排水を測定します。ポンプの設定を再調整することにより、必要に応じて希釈倍率を調整するか、罰金は、個々のポンプラインで調整チューニング。
4. 空のコレクションボトルに廃液ラインを取り付けます。
5. 細胞/ mlを定量化するだけでなく、関心のある他のエンドポイントとグリセロール凍結ストックを作る。

4。ポスト実験のクリーンアップ

1. 個別のトレイにすべてのチューブを置き、蒸留H ₂ Oで過度にすすぎ水槽のポンプを用いたドライチューブ。
2. ddH ₂ Oでコルクアセンブリを清掃し、順番に水を吸引し、調剤、針をクリーニングするニードルインサートを使用しています。いずれかを削除するために針とコルクの外側を拭き残留メディア。
3. 水とエタノールでガラス管を清掃し、3で物理的な汚染物質を除去するには、キムワイプと鉗子を球状に。
4. 使用前に、もう一度すべての部品を洗浄し、乾燥させます。

結果

ministatアレイ（ 図1A、B）は、上記とで説明の下に文化に出芽酵母の一倍体マタ実験室株（S288C）を使用した硫酸制限前述のように条件を¹⁰我々は、生理学の決定を含む一般的なケモスタットアプリケーションのための有効性をテストし、実験的な進化。 ministatsを検証するために、我々は以前にケモスタット使用するために変更され、工業発酵槽で行われ、いくつかの実験を繰り返し^10,20,21のATR Sixforsの発酵はministatsの10倍の体積の上、300ミリリットルの作業ボリュームで実行された、とかなり異なるモードを持っている文化通気や攪拌の。我々は、これらの発酵槽を用いて得られた機器の安定性、定常状態の生理学、実験的な進化の結果、遺伝子発現パターンを複製しようとしました。

希釈率と通気の均一性がケモスタット設計の重要な側面ですので、私成長の15代後32 ministats渡る実際の希釈率をasuredおよび0.17体積/ hrのターゲットの希釈率（4-5滴/分）で我々は32を越え0.0075、標準偏差は0.17208の平均希釈率を達成したことがわかった複製されます。この範囲は+ / -0.01の私たちの代表的な耐性遺伝子発現の大規模な変化が観察されているそれを超える目標設定から、体積/時間差の範囲内であった。4 ministatsアクロス^22から23の空気流量は307.5ミリリットルであることが決定された9.57ミリリットル/分の標準偏差/分。これは、チャンバー内への空気の流れは、堅牢かつ均等に4室の間で分割され、工業発酵槽における曝気について説明したのと同様の値であることを示唆している^。20

我々は以前に酵母で8月8日硫酸限られた進化実験における高親和性硫黄イオントランスポーターSUL1の再発増幅を観察した^。10 THI下結果の一貫性を考えるの条件は、我々のシステムの能力をテストするために硫酸制限を選んだ。ケモスタット培養の必須要素は、一定の化学的環境を維持する必要があります。環境における制限栄養素あるいはその他の変化の存在量の変動は、一般的に与えられた培養中の細胞数の変化をもたらす。我々は、平均0.057単位の標準偏差で成長〜15世代後1.12 A600（〜10 ⁹細胞）、または5.1を見つけ、16複写文化を越えて細胞数（ 図2A）、測定再現性のためのプロキシとして光学密度を測定％。比較のために、工業用発酵槽で増殖させた4反復培養から得られた測定値は、2.5％の標準偏差を示した。細胞が成長チャンバでよく混合した：ODおよび排水トラックから取ら細胞数の測定は、培養チューブ（データは示されていない）から直接採取された試料と同等であった。これらの結果は、我々のプラットフォームの堅牢性を実証工業用発酵槽と同様の許容範囲内で一定の化学的環境を維持するために開発能力。

生理学のより敏感な読み出しとして、我々はministatsや工業発酵槽で硫酸制限下で増殖させた培養からゲノムワイドな定常状態の遺伝子発現を比較した。 ministatsにおける遺伝子発現は、生物が複製3（ 図2B）の向こう側に高い類似性を示した。我々は以前にRNAを2つのレプリカSixforsのケモスタットに由来し、マイクロアレイに共同ハイブリダイズし、遺伝子の99％の発現が実証的有意性のカットオフとして1.5Xの使用を可能にする、1.5倍の範囲内であったことを指摘した^。21遺伝子発現から3複写ministats、比べペアワイズは、遺伝子の99％が工業用発酵槽からの結果に匹敵する、1.5から1.7倍の範囲内に収まって示した。 3つのサンプルを個々のアレイおよびその後計算の対比にハイブリダイズさせたので、これらのVA梅毒は、潜在的に、公表、共同ハイブリダイズした結果と比較レプリケート間の変動を過大評価、生物学的なノイズに加えて、相互のアレイノイズが含まれています。 138遺伝子は差動で全3 ministatで> 1.5倍発現していたなどの産業用発酵槽で栽培マッチ培養液から採取した試料と比較して複製します。 ministatsの式で減少する遺伝子は重く、鉄代謝のために濃縮した。このシグネチャは、各デバイスのコンフィギュレーションの異なる金属組成を反映している可能性があります。Sixfors装置は、文化に浸金属インペラと通気アセンブリが​​含まれており、以前に使用されたガラス製のメディアはまた、金属のハードウェアを必要とした。 ministatは、ステンレス製の針が、その他の金属部品を採用しています。この協会の生物学的意義は不明であるが発現増加した遺伝子は、主に、細胞膜と関連していた。

最後に、我々は実験的な進化の未定義をテストrは、これらの条件。アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH、 図2C）によって検出された硫酸塩が制限された成長の250世代後に、4つの独立した進化集団からテスト4月4日のクローンはSUL1の増幅を示した。この結果は、類似した時間間隔で大きなボリュームケモスタットでの知見と一致しています¹⁰

培養チャンバーの図 ministat配列の1。A.デザインと配置。B.デザイン 。

図2 A. Experime文化は成長の10代（n = 16）の内に平衡に達することを示すntalデータ。3生物学のためのBの式のデータが一致した硫酸限らSixforsのケモスタットで成長させ、共通の基準に比べて硫酸塩制限下で定常状態の間にサンプリングS1-3を複製硫酸限定された環境で成長の250世代後ministatsで回収℃ で SUL1増幅 。各進化クローンからのゲノムDNAは、記載されるようなCGHによって先祖のDNAを比較した図²¹平均コピー数は、各増幅領域について計算された、それぞれのアンプリコンの横に表示されます。すべてのマイクロアレイデータを加盟GSE36691下GEOデータベースに寄託されている。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

任意ケモスタットと同様ministatsでケモスタット培養は、詳細およびトラブルシューティングに注意を払う必要があります。汚染が連続培養実験における大きな関心事であるので、我々は一般的に長期的な進化実験中に接種し、すべての50世代によって細菌および真菌汚染のために顕微鏡を介して見える。これまでに我々はより大きい300世代の96進化実験（データは示さず）にわたって汚染は確認されていません。 ministats、我々は他のすべてのministatが上記のように酵母を接種した、残りは任意の培養を接種していなかったような16 ministatsを走った廃液ラインを経由して、培養室にコロニーを形成する微生物の可能性との間のクロスコンタミネーションをテストします。培養物は、一日おきに空にされた共同体廃棄物容器に採取した。汚染物質が排水ラインを介して入力することが可能であった場合、このように我々は、おそらく認められていたであろうこのexperimでENT。我々が外の酵母または他の微生物からの汚染がの実験で発生する可能性が低いことを示唆し、非接種ministat培養管の成長を観察していない接種と非接種文化のこの市松模様の3週間と成長の100世代よりも大きい時に類似のタイムフレーム。

ministatsが商業ケモスタットに類似した方法で動作するように設計されていたが、この配置のモジュール性は、最適化のために、ユーザーのニーズと予算に合わせてすることができます。このプロトコルに使用される蠕動ポンプは0.0186体積/時間〜3.6体積/時間（データは示さず）との間の流量を達成することができます。希釈率の増加制御が代替ポンプモデルを達成できた。低い希釈率での動作が可能になり、液滴配達の同じ周波数を達成するために、より高いゲージの針の置換を必要とするかもしれないことに注意してください。人口規模では、進化実験を適切に設計するための重要な考慮事項です。ここで使用される標準的な希釈率と栄養塩濃度は、公開され進化の研究と同程度の大きさの比較的大きな人口規模（約10 ^9個の細胞）を提供しています¹¹もっと大きくしたり、小さくしたり集団が作業容量を変更したり、栄養塩濃度を制限することによって維持することができた。増加した変異供給も上昇突然変異率を有する株を操作することで得ることができた。

ministatsはまた私達の現在の設計で改善することができた。インスタンスの縮合に関しては培養チューブの壁に収集することができ、大幅に深い水浴、インキュベーター、または恒温室を使用することで軽減することができます。凝集と硫酸限られた文化の壁の伸びは300世代（データは示さず）、界面活性剤の様々な方法によって48分の5進化実験に現れる、比較的まれであるように見えるけれども、この特性を減少または遅延させるのを助けることができることを提供しています。凝集が十分な文化を妨害した場合には混合、攪拌増加は、各空気ポンプが分割されている方法の数を減らすことによって、または攪拌装置を追加することで実現できます。溶存ガス濃度、pH、または他のパラメータの追加のプローブにもいくつかの他のデザインのように、含まれる可能性があります^。17

大きい容積の商業ケモスタットための報告データに我々のデバイスを比較するときに、このプロトコルに記載されているようministatsを使用して潜在的な変更にもかかわらず、我々は非常に一貫性のある実験パラメータと再現性のある結果を観察した。これは10から15世代（ 図2A）内に定常状態平衡に達すると平衡状態で似たような文化の密度を得ることを通じて見られるように、細胞生理の再現性が含まれていた。遺伝子発現パターンは、3つの生物間で一貫していた鉄代謝遺伝子を除いて、ministatsとministatsや商業大容量のプラットフォーム（ 図2B）の間で複製されます。これらのEXPressionの違いはおそらく2つのデバイスまたはメディア食材の質の向上の金属含有量の変化によって引き起こされます。我々のデータはministatsが一貫した環境が必要とされる生理または競合実験に有用であろうことを示唆している。

ministatデザインは、我々は250の世代のために硫酸塩制限下の文化を発展し、SUL1座の増幅を特徴づけるために、CGH用いた実験進化の用途には十分であるかどうかをテストするために- 。大きなボリュームケモスタットでこれらの条件の下での長期的な進化の特徴¹⁰我々は観察硫酸限られたメディアで4月4日の独立した進化実験（ 図2C）からクローンにおけるSUL1の増幅。全体として見ると、これらのデータはministatsは、伝統的なケモスタットの様々なアプリケーションに有用であり得る堅牢なプラットフォームであることを示唆している。我々は培養出芽酵母におけるそれらの使用を実証していますが、ministatsはすべきまた、実際に培養細菌や他の酵母種のために使用されている他の生物と同じような設計と互換性がある^。16,17,25さらに小さく培養容量とメディアのための必要性が減少した相関が必要な実験のためにministatsに魅力的な代替手段を行うことができる高価なまたはエキゾチック試薬は、化学的または遺伝子スクリーニングの場合することができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
3/32 "×7/32"シリコンチューブ	VWR	63009-260	チューブ：オーダー：（50 'コイルパック）
1/2 "×5/8"シリコンチューブ（特大）	VWR	63009-299	チューブ：オーダー：（50 'コイルパック）
1/4 "×3/8"シリコンチューブ（ミディアム）	VWR	63009-279	チューブ：オーダー：（50 'コイルパック）
オレンジ緑marpreneポンプチューブ	ワトソン·マーロー	978.0038.00 +	チューブ：Order：6X（6個入）
雌型ルアー、1/8 "バーブ	コー​​ルパーマー	HV-45500から04	コネクタ：注文：4倍（25本パック）
バーブオス型ルアーロック、1/8 "	コー​​ルパーマー	HV-45503から04	コネクタ：オーダー：1倍（25パック）
"1/8"、1/4コネクタ、PVDFを削減	コー​​ルパーマー	EW-30703から50	コネクタ：オーダー：1倍（10個）
バーブ付きYコネクタ、1/8 "ID	コー​​ルパーマー	HV-30703から92	コネクタ：注文：3倍（10個）
ミディアムチューブクランプ	VWR	63022-405	クランプ：注文：1倍（12個入り）
デイPinchcock（チューブ用金属クランプ）	VWR	21730-001	クランプ：注文：1倍（10個）
1/4インチ：クイックコネクタバルブ付きオスのインラインは、チューブに適合	フィッシャー	05-112-39	コネクタ：オーダー：1倍（25パック）
ID、ポリプロピレンインチ1/4：女性インラインチューブに適合し、クイックコネクタをバルブ付き	フィッシャー	05-112-37	コネクタ：オーダー：1X（5個入）
サイレントエアポンプ	水族館Guys.com	212422	エア·サプライ：受注：4ポンプ
空気ろ過用PTFEフィルター、0.45μmで、	コー​​ルPARMER	HV-02915から22	エア·サプライ：オーダー：1倍（100箱）
サイドアーム付き1Lフラスコ	フィッシャー	10-181F	エア·サプライ：オーダー：2X（6パック）
＃8サイドアームフラスコ用シリコン栓、穴の中の3月8日、	フィッシャー	K953715-0801	エア·サプライ：オーダー：8ストッパー
4ポートマニホールド	コー​​ルパーマー	EW-06464から85	エア·サプライ：オーダー：8マニホールド
55ミリリットルねじキャップ培養管	コー​​ニングライフサイエンス	9825から25	培養室：オーダー：2倍（48本パック）
定期的な皮下注射白ハブ針、16G、排水ラインの長さは5インチ	フィッシャー	14-817-105	培養室：オーダー：1倍（100枚入りパック）
脊椎穿刺針	VWR	BD40836	培養室：オーダー：4倍（10個）
定期的な皮下注射針ピンク	フィッシャー	14-817-104	培養室：オーダー：1倍（100枚入りパック）
発泡シリコーンストッパーサイズ "2"、ピンク	コー​​ルパーマー	EW-06298から06	培養室：オーダー：2倍（20パック）
8まあ管ラック	VWR	82024-452	培養室：注文：4ラック
ボトムホース出口と10Lリザーバーボトル：真空金庫	VWR	89001-530	メディア：お取り寄せ：2以上
黄色の泡シリコンストッパー、非標準サイズ12	コー​​ルパーマー	EW-06298から22	メディア：お取り寄せ：2以上
カーボイベントフィルター	フィッシャー	050 10 SLFG	メディア：オーダー：1倍（10個）
電気テープ、緑	Amazon.com	10851-BA-10	メディア：注文1ロール。
ボトルトップフィルター、1L、0.2ミクロン、45ミリメートル	VWR	29442-978	メディア：オーダー：（12の1ケース）
底部出口で5000 mlのリザーバボトル：vacuumの安全	VWR	89003-384	メディア：（オプション）
青い泡シリコンストッパー、nonstandardsize 10 1/2	コー​​ルパーマー	EW-06298から18	メディア：（オプション）
205S/CA16、16カートリッジポンプ	ワトソン·マーロー	020.3716.00A	メディアポンプ：注文：1
16チャンネル205CA拡張ポンプヘッド	ワトソン·マーロー	023.1401.000	メディアポンプ：オーダー：2拡張ポンプヘッド
シリコーン水族館シーラー	フィッシャー	S18180B	メディアポンプ：注文：1
6ブロック乾燥浴	VWR	12621-120	Heatblock：お取り寄せ：2 32 ministatsまたは16のための1のために。
drybath、ブロックあたり6×25 mm試験管用ブロック	VWR	12621-120	Heatblock：お取り寄せ：32 ministatsのための12か6 16。
ナイロンメンブレンフィルター、孔径0.45μm、直径：25ミリメートル。	フィッシャー	R04SP02500	収穫：オーダー：1倍（100枚入りパック）（オプション）
ナイロンメンブレンフィルター、孔径0.45μm、45ミリメートル	フィッシャー	R04SP04700	収穫：オーダー：1倍（100枚入りパック）（オプション）
47ミリメートル、大型フィルター装置	フィッシャー	XX10 047 30	収穫：注文：1（オプション）
GLASSフィルターホルダー、25mmの小さなフィルタ装置	VWR	26316-692	収穫：注文：1（オプション）
デュワーフラスコ、液体窒素用1L	VWR	63380-052	収穫：注文：1（オプション）