Concepção e utilização de matrizes quemostato Multiplexados

Resumo

Temos desenvolvido e validado um conjunto de pequenas dimensões de quimiostatos em miniatura construído a partir de partes prontamente disponíveis para baixo custo. Resultados evolução fisiológica e experimental foram semelhantes aos quimiostatos de maior volume. A matriz ministat fornece uma plataforma compacta, barata e acessível para experimentos quemostato tradicionais, a genômica funcional e aplicações de rastreamento de produtos químicos.

Resumo

Quimiostatos são sistemas de cultura contínua em que as células são cultivadas num ambiente bem controlado, quimicamente constante onde a densidade da cultura é limitada pela limitação de nutrientes específicos. ^1,2 Dados do quimiostatos são altamente reprodutível para a medição de fenótipos quantitativos uma vez que proporcionam uma taxa de crescimento constante e meio ambiente no estado estacionário. Por estas razões, quimiostatos se tornaram ferramentas úteis para a caracterização de fina escala da fisiologia através da análise da expressão do gene da ^3-6, e outras características de culturas de equilíbrio de estado estacionário. ^Sete experiências a longo prazo em quimiostatos pode destacar trajectórias específicas que as populações microbianas adoptarem durante a evolução adaptativa no ambiente controlado. Na verdade, quimiostatos têm sido utilizados para a evolução experimental desde a sua invenção. ⁸ Um resultado comum em experimentos de evolução é para cada réplica biológica para adquirir um repertório único de mutações. ^9-13 Essa diversidade sugere que há ainda muito a ser descoberto por realizar experimentos evolução, com rendimento muito maior.

Nós apresentamos aqui o projeto e operação de uma matriz relativamente simples, de baixo custo de quimiostatos-ou-em miniatura ministats e validar seu uso na determinação de fisiologia e evolução em experimentos com leveduras. Esta abordagem implica crescimento de dezenas de quimiostatos correr um único multiplexados bomba peristáltica. As culturas são mantidas a um volume de trabalho de 20 ml, o que é prático para uma variedade de aplicações. A nossa esperança é que aumentando a produção, diminuindo despesas e prestação de edifício e instruções detalhadas de operação pode também motivar a investigação e aplicação industrial deste projeto como uma plataforma geral para caracterizar funcionalmente um grande número de cepas, espécies, e parâmetros de crescimento, bem como genética ou bibliotecas de medicamentos.

Introdução

A dinâmica do crescimento microbiano e evolução são fundamentais para a microbiologia, ecologia, genética e biotecnologia. O método mais comum é a cultura de micróbios em lotes, onde as células são inoculadas a uma densidade baixa em caldo rico em nutrientes e cultivadas até à saturação. Embora simples de realizar utilizando equipamento de laboratório padrão, culturas em lote experimentar um ambiente químico flutuante e, correspondentemente, alterar a fisiologia celular. Este ambiente de crescimento heterogêneo pode resultar em efeitos secundários de crescimento e estresse que podem mascarar sutis diferenças fisiológicas. Evolução experimental por transferência lote de série pode selecionar para misturas complexas de crescimento fase subpopulações específicas, dificultando tentativas de conexão adaptações às condições específicas do seletivos. Medição de fenótipos quantitativos pode ser difícil devido ao ruído do tempo de coleta imprecisa e variação em características como tempo de atraso. Culturas contínuas fornecer uma alternativaregime de crescimento, onde as células podem ser cultivadas de forma reprodutível num ambiente quimicamente homogéneo com uma taxa de crescimento definidos para chegar a um estado fisiológico constante. Devido a estas vantagens, os estudos sobre evolução experimental e caracterização do estado celular utilizam frequentemente o ambiente controlado de culturas contínuas como o quimiostato ^14.

Apreciação destas vantagens levou a um ressurgimento do interesse nas culturas quimiostato. ¹⁵ Desde a sua introdução em 1950, ^1,2 quimiostato sistemas têm sido desenvolvidos para a função de uma variedade de escalas que vão de litros de microlitros e para uma variedade de aplicações ^{16. -19} Estes projetos diversos, que variam de biorreatores produzidos comercialmente para navios glassblown para plataformas personalizadas microfluídica, partes princípios gerais de design. A câmara de cultura é agitada e arejada (normalmente, fazendo borbulhar ar através dele) e os micróbios neles contidos são mantidos homogéneosly dispersas por toda a câmara de cultura em todos os momentos. Meio fresco de composição definido é adicionado continuamente e a velocidade de adição controla a taxa de crescimento e influencia o ambiente químico experimentado pela cultura. Um estouro define o volume de cultura no tubo de crescimento, e através desta o transbordamento cultura serão amostrados na mesma taxa em que entra no meio fresco. Desta forma, as culturas rapidamente chegar a um estado fisiológico estável em que muitos parâmetros biológicos permanecem constantes. Apesar das vantagens do quimiostatos e relatórios destas plataformas diferentes na literatura, a adoção generalizada tem sido limitada por dificuldades de construção e operação desses sistemas, e altos custos associados às opções comerciais. Além disso descrições de como fazer e utilizar estes dispositivos podem ser opacos.

Apresentamos projetos e instruções para uso de uma matriz de pequenas dimensões de quimiostatos miniatura construídas a partir de partes prontamente disponíveis a baixo custo. Nós obsErve altamente consistentes parâmetros experimentais e resultados reproduzíveis quando se compara o nosso dispositivo com dados relatados para leveduras cultivadas em biorreatores maior volume comerciais. Isto inclui a reprodutibilidade da fisiologia celular, como visto através do alcance de estado estável de equilíbrio dentro de 10-15 gerações e obtenção de densidades semelhantes de cultura no estado de equilíbrio. Além disso, os padrões de expressão de genes são consistentes entre ministats e uma plataforma de maior volume comercial. Estabilidade da taxa de diluição, a densidade óptica e da reprodutibilidade da expressão do gene entre as três culturas replicadas demonstrar a robustez da nossa plataforma. Mostramos também que as mesmas mutações adaptativas surgir ao longo prazos semelhantes evolução experimental como com quimiostatos de maior volume.

Protocolo

Use a técnica estéril adequada durante o protocolo.

1. Montagem de peças e Preparação para a matriz Ministat

1. Ordenar todas as peças.
2. Limpar os tubos de vidro. Marcar tubos de 20 ml de volume.
3. Fazer montagens de cortiça com ar, a mídia, e as portas de efluentes e colocá-los no topo dos tubos de cultura limpas de vidro.
4. Prepare câmaras de umidificação e organizar todas as partes não autoclavados.
5. Fazer o ar, efluentes e tubos de mídia usando de tubagens suficientes e acoplamentos compatíveis.
6. Conecte cada tipo de tubo (ar, mídia e efluentes) para as assembleias de cortiça e filtros de alumínio e os meios de comunicação de conexão rápida para prepará-los para a autoclave.
7. Preparar um garrafão para utilização na fabricação de meio estéril quimiostato.
8. Preparar as garrafas de colheita de amostras de cultura através da inserção de uma rolha de borracha de dois furos, com acessórios apropriados. Folha cada filtro para prepará-los para a autoclave.
9. Fit da matriz montada perfeitamente em uma ou mais bandejas autoclave e manter todas as partes.
10. Faça e filtrar mídia quemostato em garrafões autoclavada.

2. Configurando uma experiência

1. Encha cada frasco de 700 ml hidratação com DDH ₂ O.
2. Coloque as ministats autoclavados no conjunto do bloco de aquecimento a uma temperatura desejada.
3. Coloque as companhias aéreas para o colector de 4 portas e ligar a bomba de ar.
4. Ligue as linhas de efluentes para as 100 garrafas de coleta ml.
5. Remover a película a partir da extremidade da tubagem de media e media garrafão e ligar o rápido conecta dois. Passe cada pedaço de tubo de bomba através de um cartucho de bomba peristáltica e clique-los no lugar. Ligue a bomba de mídia.
6. Vamos encher as câmaras. Desligar a bomba de mídia.
7. Pulverizar os conjuntos de cortiça com etanol a 70% e inocular as culturas, utilizando uma seringa. Guardar uma amostra do inoculo como um estoque de glicerol congeladose desejado. Deixe as culturas crescer durante 30 h.
8. Ajustar a altura da agulha até que o volume de efluente da cultura é ajustado para 20 ml com o fluxo de ar desligado. Isto pode demorar vários ajustamentos ao longo de uma hora. Quando terminar desligar o fluxo de ar em volta.
9. Ligue a bomba de mídia em.
10. Esvazie as garrafas de amostragem de efluentes, que contêm mídia coletados durante a definição do volume de cultura de trabalho, e registrar o tempo.
11. A ocupar um lugar de medição de tempo zero das linhas de efluentes em tubos de coleta estéreis para 15 min-2 horas (dependendo do que o volume que deseja provar para análise de DNA). Também fazer um estoque de glicerol congelado de cada cultura nesta altura, se desejado.

3. Medidas diárias

1. Tal como acontece com a sua medida de tempo zero, a amostra em gelo durante 15 min-2 h (como requerido para a sua experiência) em gelo e registará o tempo de amostragem para o DNA e as amostras congeladas imagens.
2. Para amostras de RNA ou coletar uma pequena volUme usando uma seringa e uma agulha de 22G 5 "a partir da cultura ou uncork cada ministat para colher toda a cultura. amostras devem ser tomados de forma rápida, recolhido por filtração, e imediatamente congelados em azoto líquido.
3. Meça o efluente coletado desde a última amostragem para cada ministat quantificar taxa de diluição. Ajustar as taxas de diluição, se necessário reajustando a definição bomba ou ajustar o ajuste fino em linhas individuais da bomba.
4. Substitua as linhas de efluentes em garrafas vazias de coleta.
5. Quantificar células / ml, bem como outros parâmetros de interesse e fazer um estoque de glicerol congelado.

4. Pós-experimento de Limpeza

1. Coloque todos os tubos em bandejas separadas e enxaguar abundantemente com DDH ₂ O. Tubo seco utilizando uma bomba de aquário.
2. Limpe as assembleias de cortiça com DDH ₂ O e usar inserção de agulha para limpar as agulhas, aspiração e distribuição de água, por sua vez. Passe o exterior das agulhas e de cortiça para remover qualquermídia residuais.
3. Limpar o tubo de vidro com água e etanol, e remover os contaminantes físicos com 3 enrolado Kimwipes e fórceps.
4. Lavar e secar todas as partes novamente antes da utilização.

Resultados

A matriz ministat descrito acima e na (Figura 1A, B) foi utilizado para a cultura de uma estirpe haplóide MATa laboratório de fermento de brotamento (S288c) sob condições limitantes de sulfato, tal como descrito previamente ^10. Testamos a eficácia para aplicações quimiostato comuns, incluindo a determinação da fisiologia e evolução experimental. Para validar os ministats, repetiu-se várias experiências anteriormente realizadas em fermentadores industriais modificados para utilização quimiostato. Sixfors ^10,20,21 fermentadores ATR foram corridas a um volume de trabalho de 300 ml, mais de 10 vezes o volume dos ministats, e têm modos consideravelmente diferentes cultura de aeração e agitação. Buscou-se replicar estabilidade equipamento, fisiologia estado estacionário, os resultados experimentais de evolução, e padrões de expressão de genes obtidos com esses fermentadores.

Desde uniformidade da taxa de diluição e aeração são aspectos importantes do projeto quemostato, que measured a taxa de diluição real em 32 ministats após 15 gerações de crescimento e descobriu que, com uma taxa de diluição de 0,17 alvo vol / hr (4-5 gotas / min) que atingiu uma taxa de diluição média de 0,17208 com um desvio padrão de 0,0075 entre 32 repetições. Esta gama foi no nosso tolerância típico de + / -0,01 diferença vol / hr a partir da configuração de alvo, para além do qual grandes alterações na expressão de genes têm sido observadas. ^22-23 Através 4 ministats a taxa de fluxo de ar foi determinado como sendo 307,5 ​​ml / min, com um desvio padrão de 9,57 ml / min. Isto sugere que o fluxo de ar para dentro das câmaras é robusto e igualmente dividida entre os quatro câmaras e é um valor semelhante ao descrito para o arejamento em fermentadores industriais ^20.

Nós já observado amplificação recorrente do SUL1 transportador de alta afinidade de enxofre-ion em 8/8 experimentos sulfato limitados evolução em leveduras. ¹⁰ Dada a consistência dos resultados sob thicondição s escolhemos sulfato de limitação para testar a capacidade do nosso sistema. Um elemento necessário de cultura quimiostato é a necessidade de manter um ambiente químico constante. Flutuações na abundância de uma mudança de limitação de nutrientes ou outras no ambiente tipicamente resultar numa mudança do número de células numa dada cultura. Medimos a densidade óptica, como um proxy para o número de células (Figura 2A) e da reprodutibilidade medido em 16 culturas replicadas, encontrar uma A600 média de 1,12 (~ 10 ⁹ células) após aproximadamente 15 gerações de crescimento, com um desvio padrão de 0,057 unidades, ou 5,1 %. Para comparação, as medições efectuadas a partir de 4 culturas replicadas cultivadas nos fermentadores industriais mostrou um desvio padrão de 2,5%. As células foram bem misturadas na câmara de crescimento: As medições de OD e contagem de células extraídos da pista de efluente foram equivalentes às amostras colhidas directamente a partir do tubo de cultura (dados não mostrados). Estes resultados demonstram a robustez da nossa plataforma de umd capacidade de manter um ambiente químico constante dentro de uma tolerância semelhante ao fermentador industrial.

Como uma leitura mais sensível da fisiologia, comparamos genome-wide expressão do gene de estado estacionário a partir de culturas cultivadas em sulfato de limitação nas ministats e no fermentador industrial. A expressão do gene nas ministats mostrou um elevado grau de semelhança entre três réplicas biológicas (Figura 2B). Nós anteriormente notado que, para o RNA derivado de duas réplicas quimiostatos Sixfors e co-hibridada com um microarray, expressão de 99% dos genes caiu dentro de um intervalo de 1,5 vezes, o que permite a utilização de 1,5 X como um nível de significância empírica. ²¹ expressão do gene a partir de ministats três replicados, em comparação aos pares, mostraram 99% de genes caiu dentro de um intervalo 1,5-1,7 vezes, comparável aos resultados dos fermentadores industriais. As três amostras foram hibridizados com matrizes individuais e os rácios calculados emparelhadas depois, portanto, estes values incluem matriz inter-ruído para além do ruído biológico, potencialmente sobrestimar a variação entre réplicas em comparação com os publicados, co-hibridizados resultados. 138 genes foram diferencialmente expressos> 1,5 vezes em todos ministat três repetições, em comparação com uma amostra colhida de uma cultura correspondente crescido no fermentador industrial. Genes diminuição na expressão dos ministats foram fortemente enriquecido para o metabolismo do ferro. Esta assinatura pode reflectir a composição do metal diferente de cada configuração do dispositivo: o aparelho Sixfors inclui um rotor de metal e montagem de arejamento submerso na cultura, e os meios de comunicação garrafões utilizado anteriormente também necessário hardware metal. O ministat utiliza agulhas de aço inoxidável, mas nenhum componente de metal. Os genes com expressão aumentada foram amplamente associados a membranas celulares, embora o significado biológico desta associação não é claro.

Finalmente, testou-se a evolução experimental under estas condições. Após 250 gerações de sulfato de crescimento limitado, 4 quartos clones testados a partir de 4 populações independentes mostraram amplificação da evolução SUL1 como detectado pela matriz hibridação genómica comparativa (CGH, a Figura 2C). Este resultado é consistente com os achados quimiostatos maior volume em intervalos de tempo semelhantes. ¹⁰

Figura 1. A. Desenho e arranjo da matriz ministat. B. Desenho da câmara de cultura.

Figura 2. A. experimental dados que mostram que as culturas atingem o equilíbrio dentro de 10 gerações de crescimento (n = 16). B. Expressão de dados para três réplicas biológicas S1-3 amostrada durante o estado estacionário sob sulfato de limitação em relação a uma referência comum cultivadas em correspondência quimiostato Sixfors sulfato limitada amplificações. C. SUL1 recuperado em ministats após 250 gerações de crescimento em um ambiente de sulfato limitado. O ADN genómico de cada um dos clones foi comparada com a evolução do DNA ancestral CGH como descrito por ^21. Média do número de cópias calculado para cada região amplificada e é mostrado ao lado de cada fragmento amplificado. Todos os dados de microarranjos são depositados no banco de dados GEO sob adesão GSE36691. Clique aqui para ver maior figura.

Discussão

Cultivo quemostato nos ministats, como com qualquer quemostato, requer atenção aos detalhes e resolução de problemas. Desde que a contaminação é de grande preocupação em experimentos de cultura contínua, que normalmente olhar através do microscópio para a contaminação bacteriana e fúngica após inoculação ea cada 50 gerações durante experimentos evolução a longo prazo. Até à data, não observamos contaminação através de 96 experiências de evolução superior a 300 gerações (dados não mostrados). Para testar a contaminação cruzada entre ministats e do potencial de micróbios para colonizar a câmara de cultura por meio da linha de efluente 16 que correu ministats tais que cada ministat outro foi inoculado com a levedura como acima, e o restante não foram inoculados com a cultura. As culturas foram recolhidos num recipiente de resíduos urbanos, que foi esvaziado em dias alternados. Assim, se fosse possível para os contaminantes para entrar na linha de efluentes que provavelmente teria observado que neste experiment. Durante três semanas e mais de 100 gerações de crescimento neste padrão quadriculado de células inoculadas e não inoculados não foi observada no crescimento não-inoculados tubos de cultura ministat, sugerindo que a contaminação por fungos ou outros micróbios fora é improvável que ocorra em experimentos de prazos semelhantes.

Embora os ministats foram projetados para operar de forma análoga à quimiostatos comerciais, a natureza modular deste arranjo permite a otimização para se ajustar às necessidades dos usuários e orçamento. A bomba peristáltica usada no presente protocolo podem alcançar taxas de fluxo entre 0,0186 vol / vol para 3,6 hr / hr (dados não mostrados). Um maior controlo das taxas de diluição pode ser conseguido com modelos de bombas alternativas. Note-se que a operação a baixas taxas de diluição podem exigir a substituição de uma agulha de maior calibre para atingir a mesma frequência de fornecimento de gotículas. O tamanho da população é uma consideração importante para o projeto adequado de experimentos evolução.A taxa de diluição padrão e concentração de nutrientes utilizada aqui proporciona uma população relativamente grande (~ 10 ⁹ células) da mesma ordem de grandeza que os estudos publicados de evolução. ¹¹ populações maiores ou menores podem ser mantidos, alterando o volume de trabalho, ou limitar a concentração de nutrientes. Fornecimento de mutação aumentada também pode ser obtida através do trabalho com as estirpes com taxas de mutação elevadas.

Os ministats também pode ser melhorado com o nosso projeto atual. Por exemplo, a condensação pode acumular nas paredes do tubo de cultura e pode ser muito reduzido por meio de um banho de água profunda, incubadora ou sala de temperatura constante. Embora a aglomeração e crescimento de parede em sulfato de culturas limitadas parece ser relativamente rara, aparecendo em experiências 5/48 evolução por 300 gerações (dados não mostrados), uma variedade de surfactantes estão disponíveis, que podem ajudar a diminuir ou retardar esta característica. No caso em que interfere com a agregação de cultura adequadoagitação, a mistura pode ser aumentada pela redução do número de caminhos de cada bomba de ar é dividido, ou pela adição de um aparelho de agitação. Sondas adicionais para a concentração de gás dissolvido, o pH, ou outros parâmetros podem também ser incluídos, tal como em alguns modelos de outros ^17.

Apesar de possíveis modificações, usando os ministats como descritas neste protocolo, observou-se altamente consistentes parâmetros experimentais e resultados reproduzíveis quando se compara o nosso dispositivo com dados relatados para quimiostatos maior volume comerciais. Isto incluiu a reprodutibilidade da fisiologia celular, como visto através do alcance de estado estável de equilíbrio dentro de 10-15 gerações (Figura 2A) e a obtenção de densidades semelhantes de cultura no estado de equilíbrio. Padrões de expressão de genes foram consistentes em três repetições em ministats biológica e entre ministats e comerciais de grande volume plataformas (Figura 2B), com a excepção de genes do metabolismo do ferro. Estes expression diferenças são provavelmente causado por alterações no teor de metais dos dois dispositivos ou melhorias na qualidade dos ingredientes de mídia. Os nossos dados sugerem que ministats serão úteis para a fisiologia ou a concorrência experiências onde um ambiente consistente é necessária.

Para testar se o desenho ministat é suficiente para aplicações de evolução experimental que evoluíram culturas sob limitação de sulfato durante 250 gerações e CGH utilizado para caracterizar a amplificação no locus SUL1 -. Uma característica fundamental da evolução a longo prazo sob estas condições em quimiostatos maior volume ¹⁰ Observou amplificação de clones de SUL1 em 4/4 experiências independentes em evolução sulfato limitados meios de comunicação (Figura 2C). Tomado como um todo, estes dados sugerem que são ministats uma plataforma sólida que pode ser útil para uma variedade de aplicações quimiostato tradicionais. Embora demonstrado sua utilização na cultura de levedura de brotamento, as ministats devetambém ser compatível com outros organismos e projetos similares foram efectivamente utilizadas para cultura de bactérias e leveduras outros. ^16,17,25 Além disso, o menor volume de cultura e correlacionados diminuição da necessidade de mídia pode fazer ministats uma alternativa atraente para experimentos que requerem caros ou exóticos Os reagentes, como pode ser o caso em química ou telas genéticos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
3/32 tubing "x 7/32" de silicone	VWR	63009-260	Tobogã: Ordem: (50 'pacote de bobina)
Tubagem de 1/2 "x 5/8" de silicone (muito grande)	VWR	63009-299	Tobogã: Ordem: (50 'pacote de bobina)
1/4 "x 3/8" de tubagem de silicone (meio)	VWR	63009-279	Tobogã: Ordem: (50 'pacote de bobina)
Laranja verde tubulação de bomba Marprene	Watson-Marlow	978.0038.00 +	Tobogã: Order: 6x (pacote de 6)
Luer fêmea, 1/8 barbela "	Cole Parmer	HV-45500-04	: Ordem: 4x (pacote de 25)
Luer lock macho, 1/8 barbela "	Cole Parmer	HV-45503-04	: Ordem: 1x (pacote de 25)
Reduzindo conector, PVDF, 1/4 "a 1/8"	Cole Parmer	EW-30703-50	: Ordem: 1x (pacote de 10)
Farpado conector Y, 1/8 "ID	Cole Parmer	HV-30703-92	: Ordem: 3x (pacote de 10)
Médio braçadeiras de tubulação	VWR	63022-405	Grampos: Ordem: 1x (pacote de 12)
Dia Pinchcock (braçadeira de metal para tubos)	VWR	21730-001	Grampos: Ordem: 1x (pacote de 10)
Linha masculina valvulados rápida conector, Fits tubulação: 1/4 pol	Pescador	05-112-39	: Ordem: 1x (pacote de 25)
Linha feminina valvulados conector rápido, Fits tubulação: 1/4 pol ID, Polipropileno	Pescador	05-112-37	: Ordem: 1x (pack de 5)
Silenciosas Bombas de ar	Aquário Guys.com	212422	Air Supply: Ordem: 4 bombas
Filtros de PTFE, de 0,45 um, para a filtração do ar	Cole Parmer	HV-02915-22	Air Supply: Ordem: 1x (caixa com 100)
Flask 1L com arma	Pescador	10-181F	Air Supply: Ordem: 2x (Pack of 6)
º 8 rolha de silicone, 3/8 no buraco, para garrafas sidearm	Pescador	K953715-0801	Air Supply: Ordem: 8 rolhas
4 Porta-colector	Cole Parmer	EW-06464-85	Air Supply: Ordem: 8 manifolds
55 ml de parafuso cultura tubos com tampas de	Corning Life Sciences	9825-25	Câmara cultura: Ordem: 2x (pacote de 48)
Regular hipodérmica agulha branca hub, 16G, 5 polegadas de comprimento para linha de efluentes	Pescador	14-817-105	Câmara cultura: Ordem: 1x (pacote de 100)
Agulha de punção lombar	VWR	BD40836	Câmara cultura: Ordem: 4x (pacote de 10)
Agulha hipodérmica regular rosa	Pescador	14-817-104	Câmara cultura: Ordem: 1x (pacote de 100)
Espuma de silicone rolha tamanho "2", rosa	Cole Parmer	EW-06298-06	Câmara cultura: Ordem: 2x (pacote de 20)
8-Bem rack tubo	VWR	82024-452	Câmara cultura: Ordem: 4 racks
Garrafa Reservatório 10L com mangueira de saída inferior: seguro de vácuo	VWR	89001-530	Mídia: Ordem: 2 ou mais
Rolha de silicone amarelo espuma, não-padrão tamanho 12	Cole Parmer	EW-06298-22	Mídia: Ordem: 2 ou mais
Garrafão Ventilação Filtro	Pescador	SLFG 050 10	Media: Pedidos: 1x (pacote de 10)
Fita isolante, verde	Amazon.com	10.851-BA-10	Media: Ordem 1 rolo.
Filtro frasco superior, 1L, 0,2 mM, 45 mm	VWR	29442-978	Media: ordem: (1 caso de 12)
5000 frasco reservatório ml com descarga de fundo: vacuhum seguro	VWR	89003-384	Mídia: (Opcional)
Rolha de silicone azul Espuma, nonstandardsize 10 1/2	Cole Parmer	EW-06298-18	Mídia: (Opcional)
205S/CA16, 16 bomba de cartucho	Watson-Marlow	020.3716.00A	Mídia Bomba: Ordem: 1
De 16 canais 205CA cabeça da bomba de extensão	Watson-Marlow	023.1401.000	Mídia Bomba: Ordem: 2 cabeças de bomba de extensão
Silicone selante aquário	Pescador	S18180B	Mídia Bomba: Ordem: 1
6-bloco banho seco	VWR	12621-120	Heatblock: Ordem: 2 para 32 ministats ou um para 16.
Bloco para drybath, 6 tubo de ensaio x 25 mm por bloco	VWR	12621-120	Heatblock: Ordem: 12 para 32 ministats ou 6 para 16.
Filtros de membrana de nylon, Tamanho 0,45 mM poros; Dia: 25 mm.	Pescador	R04SP02500	Colheita: Ordem: 1x (pacote de 100) (opcional)
Filtros de membrana de nylon, 0,45 uM Pore Size 45 milímetros;	Pescador	R04SP04700	Colheita: Ordem: 1x (pacote de 100) (opcional)
47 mm, aparelho de filtro grande	Pescador	Xx10 047 30	Colheita: Ordem: 1 (opcional)
Glass suporte do filtro, 25 mm, o aparelho de filtro pequeno	VWR	26316-692	Colheita: Ordem: 1 (opcional)
Dewar frasco, 1L de nitrogênio líquido	VWR	63380-052	Colheita: Ordem: 1 (opcional)