Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Resumen

Este artículo describe el uso de una proteína de fusión luciferasa de luciérnaga-GFP para investigar In vivo Plegamiento de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. El uso de este reactivo, el replegamiento de un modelo de proteína desnaturalizada con calor puede ser controlada simultáneamente por microscopía de fluorescencia y un ensayo enzimático para investigar las funciones de los componentes de la red Proteostasis en el control de calidad de la proteína.

Resumen

Proteostasis, definida como los procesos combinados de plegamiento de proteínas / biogénesis, replegado / reparación, y la degradación, es un delicado equilibrio celular que se debe mantener para evitar consecuencias perjudiciales ^1. Factores externos o internos que perturban este equilibrio puede conducir a la agregación de la proteína, la toxicidad y la muerte celular. En los seres humanos esto es un factor importante que contribuye a los síntomas asociados con los trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Huntington, Parkinson, y las enfermedades de Alzheimer ^10. Por lo tanto, es esencial que las proteínas implicadas en el mantenimiento de proteostasis ser identificados con el fin de desarrollar los tratamientos para estas enfermedades debilitantes. Este artículo describe las técnicas para el seguimiento en el plegamiento de proteínas in vivo a una resolución de tiempo casi real utilizando el modelo de proteína luciferasa de luciérnaga fusionado a la proteína fluorescente verde (FFL-GFP). FFL-GFP es una proteína quimérica modelo único como resto de FFL es extremadamente sensible a la tensión inducida por misfolding y la agregación, que inactiva la enzima ^12. La actividad de luciferasa se controló usando un ensayo enzimático, y el resto de GFP proporciona un método de visualización de FFL soluble o agregada mediante microscopía automatizada. Estos métodos acoplados incorporan dos enfoques paralelos y técnicamente independiente para analizar tanto replegamiento y la reactivación funcional de una enzima después de estrés. Recuperación de la actividad se puede correlacionar directamente con la cinética de desagregación y de re-solubilización para comprender mejor cómo los factores de control de calidad de proteínas, tales como chaperones de la proteína colaboran para llevar a cabo estas funciones. Además, las supresiones de genes o mutaciones se pueden usar para probar las contribuciones de proteínas específicas o subunidades de proteínas a este proceso. En este artículo se reflexiona sobre las aportaciones de la proteína disaggregase Hsp104 ^13, conocido por colaborar con el factor de cambio Hsp40/70/nucleotide (NEF) Sistema ⁵ replegado, con el replegamiento de proteínas para validar este enfoque.

Introducción

En los seres humanos trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, y las enfermedades de Huntington se han relacionado con el mal plegamiento y la agregación de la proteína ^10. Las células emplean chaperones moleculares para prevenir atrapamiento cinética de las proteínas celulares en las estructuras inactivas mal plegadas ^6. Los acompañantes que participen en redes de interacción complejas dentro de la célula, pero no se conocen con exactitud cómo la suma de estas interacciones contribuye a proteostasis organismo. Uno de los principales chaperonas responsables de la mayoría de plegamiento de la proteína citosólica es la proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) de la familia ^19. Se ha demostrado que en la pérdida de la levadura de Hsp70 disminuye la capacidad de doblar naciente de FFL heteróloga expresada y para replegar la proteína endógena, ornitina transcarbamilasa, in vivo ^{18, 7.} La capacidad de analizar plegable con resolución de tiempo casi real, facilitará la comprensión de cómo los factores celulares cont adicionalribute a este proceso de Hsp70-dependiente. Además, plegado / replegamiento reacciones no puede ser completamente dependiente de estas proteínas que contribuyen, por lo que los ensayos deben ser lo suficientemente sensible como para detectar tanto los cambios grandes y pequeños en la cinética y la eficiencia.

El disaggregase célula de levadura, Hsp104, juega un papel vital en la reparación de las proteínas mal plegadas agregados. Aunque Hsp104 homólogos han sido identificados en hongos y plantas, esta familia parece estar ausente en metazoos. Se ha propuesto que otras chaperonas tales como los de la familia Hsp110 realizan algunos de los conocidos Hsp104 actividades en mamíferos ^16. Hsp104 es un +, complejo de proteínas hexameric AAA que funciona en la levadura de proteínas remodelación de agregados, que contribuyen a replegado y reparación ^13. Hsp104, junto con la levadura Hsp70, ssa1, y la levadura Hsp40, Ydj1, se requiere para la recuperación de FLE desnaturalizado en células de levadura ^{5, 8.} La pequeña proteína de choque térmico, Hsp26, también se ha demostrado que es Requirojo para la desagregación Hsp104 mediada OFF ^2.

FFL, es una proteína de dos dominios que se une el sustrato luciferina en el sitio activo y después de un cambio conformacional que requiere ATP y el oxígeno, descarboxila el sustrato liberando oxiluciferina, dióxido de carbono (CO _2), monofosfato de adenosina (AMP), y la luz ^{11, 9, 3.} El sustrato disponible comercialmente FFL, D-luciferina, resulta en la emisión de luz entre 550-570 nm que pueden ser detectados usando un luminómetro ^15. FLE es exquisitamente sensible a la desnaturalización de los tratamientos químicos o calor y agregados rápidamente al despliegue. Cuando se expone a temperaturas entre 39-45 ° C OFF se desarrolló reversible e inactivadas ^12. Por el contrario, GFP y sus derivados son altamente resistentes a desplegamiento de la proteína tensiones ^14. Por lo tanto, la fusión de estas dos proteínas permite OFF para funcionar como un resto experimentalmente lábil capaz de dirigirse funcional TFP a intracelular de depósitos que se pueden visualizar mediante microscopía de fluorescencia a la población y de los niveles de células individuales. Aplicación del ensayo enzimático en un lector de placas multimodo semi-automatizado junto con microscopía automatizada permite la evaluación simultánea sin precedentes de la cinética y el rendimiento de replegamiento reacciones. Además, la genética molecular fáciles del modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae permite tanto la manipulación precisa de la red de control de calidad de la proteína y la oportunidad para que los enfoques basados ​​en descubrimientos para identificar nuevos jugadores que contribuyen a la respuesta al estrés celular y proteostasis.

En este estudio, las cepas de tipo salvaje (WT) y HSP104 eliminación expresan FFL-GFP están sujetos a la desnaturalización de proteínas de choque térmico. FFL-GFP replegamiento se controla a través tanto de un ensayo enzimático y microscopía como una lectura de proxy para la reparación del proteoma expresado sobre un curso de tiempo de recuperación. En comparación con las células WT, mostramos ªsupresión cepa e Hsp104 es de ~ 60% menos eficientes en el replegamiento FFL-GFP, el apoyo a los hallazgos previos establecen un rol para Hsp104 en la reactivación de desnaturalizado OFF ^2.

Protocolo

1. Construcción de las cepas que contienen FFL-GFP plásmido

Para este estudio, Saccharomyces cerevisiae cepa BY4741 (MAT una, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) se utiliza junto con una supresión cepa HSP104 de la colección nocaut levadura (Open Biosystems / Thermo Scientific). La deleción se confirmó utilizando un anticuerpo Hsp104-específico para el análisis de Western blot.

FFL-GFP se expresa a partir de p426MET25-FFL-GFP, construido a partir de una fuente LEU2 plásmido basado obtenido por el laboratorio Glover en la Universidad de Toronto ¹⁷ y obtenible a petición de los autores. Expresión de la proteína de fusión plásmido FFL-GFP es controlado por el promotor MET25 metionina-reprimible. El plásmido se transformó en cada cepa usando un protocolo fue adaptado de Gietz et. al, 1995:

1. Centrifugar 25 ml o f células en fase de registro en un tubo cónico de 50 ml a 4.400 rpm durante 2 min, se lavan con 500 l de doble destilada H ₂ 0 (ddH ₂ O), y descartar sobrenadante.
2. Resuspender las células en 250 l de TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, EDTA 1 mM, acetato de litio 0,1 M). Incubar a 30 ° C sin mezclar durante 20 min.
3. Transferir 50 l de células competentes a un nuevo tubo junto con 5 ml (50 g) de ADN portador y 5 l (0,1-5 g) de ADN plásmido. Añadir 300 l de PEG / TE / LiAc (igual que el% de polietilenglicol TE / LiAc más 40) a esta mezcla, y las células se incuban a 30 ° C durante otros 30 min.
4. Añadir 1/10 volumen (v / v) de DMSO (36 l) a esta mezcla y choque térmico a 42 ° C durante 6 min.
5. Se centrifuga la mezcla a 6.000 rpm durante 30 segundos y quitar sobrenadante. Resuspender las células en 100 l de ddH ₂ 0 y células de la placa estériles en medios completos sintéticos que carecen de uracilo (SC-URA).

2. La inducción de la FFL-GFP

nt "> FFL-GFP es inducida una vez que las células están en la fase de registro por lo que la mayoría de la proteína antes de choque térmico se hace para evitar recién proteínas que se han agregado terminalmente con el tiempo debido a las insuficiencias celulares relacionadas con el envejecimiento.

1. Día 1: Se incuban las células en 5 ml de SC-ura a 30 ° C giratoria O / N.
2. Día 2: Medida OD ₆₀₀ y cultivos frescos inocular en 5 ml de SC-URA OD ₆₀₀ ~ 0,2.
3. Incubar los cultivos con rotación a 30 º C hasta que alcanzan la fase de registro OD ₆₀₀ ~ 0,8-1,0.
4. Centrifugar las células en tubos cónicos de 15 ml a 4400 rpm durante 3 min, decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 500 l de ddH ₂ 0; solución de transferencia a un tubo de microcentrífuga.
5. Centrifugar a 6000 rpm y descartar sobrenadante.
6. Resuspender las células en 5 ml de SC-URA-MET. Las células deben ser incubadas rotación en este medio durante 1 hora a 30 ° C.
7. Centrifugar las células y de lavado se repiten en ddH ₂ 0 y descartar sobrenadante.
8. Resuspend células en 5 medios SC-URA ml conteniendo 100 mg / ml de cicloheximida para inhibir la expresión de la proteína, y proceder de inmediato al paso 3.

3. Ensayo enzimático Recuperación FFL-GFP

Este ensayo es un enfoque cuantitativo para determinar los niveles de enzima activa en una población.

1. Preparación para este ensayo:
   1. Mida OD ₆₀₀ para cada muestra.
   2. Prepare la cantidad necesaria de D-luciferina necesaria basada en el número de muestras y el número de repeticiones más aproximadamente 1200 l para el tubo deseado. La concentración final de D-luciferina es ~ 23 g por 100 l de células. Inicialmente se disuelve en agua a una concentración de solución madre de 7,5 mg / ml y se diluyó hasta 455 g / ml en SC antes del experimento. En la Figura 2, tres repeticiones para cada muestra fueron analizados resultando en un total de 2,4 ml de D-luciferina que se utiliza.
   3. Lector de placas Programa para el flash lumiensayo nescence (adaptado de BioTek Gen5 "luminiscencia flash ensayo con inyección", para otros instrumentos sigan las instrucciones del fabricante)
      1. Ajustar la temperatura a 30 ° C
      2. Establecer lector de placas para añadir D-luciferina, agitar y leer cada pozo individual.
      3. Leer luminiscencia (lectura de punto final, 5 segundos de tiempo de integración, 180 niveles de sensibilidad)
      4. Para el ensayo de recuperación entre cada movimiento de la lectura durante 5 min, 20 min retrasar, y agitar un adicional de 5 min.
      5. Dispensar 50 l de D-luciferina de un inyector.
2. Luminiscencia Precaliente-shock se mide inmediatamente después las células se añaden a los medios de comunicación que contienen cicloheximida para detener la síntesis de proteínas.
   1. Transferir 100 l de células para cada muestra con el número deseado de repeticiones en un blanco placa de 96 pocillos sólida.
   2. Los controles deberán incluir un blanco de agua y las células que contienen un vector vacío.
   3. Inicie la lectura con el SPEcificaciones mencionados anteriormente.
3. Para desnaturalizar el resto de FFL de FFL-GFP, se incuba el cultivo de 5 ml en un tubo de cultivo de vidrio a 42 ° C con agitación durante 25 min.
4. Lecturas de luminiscencia de ensayo de recuperación comienzan inmediatamente después de las células se retiran de la incubadora, que es punto de tiempo cero. Medida luminiscencia mismo como se describe anteriormente para el primer punto de tiempo y cada 30 min durante 90 min.
5. Normalizar las muestras a los valores de luminiscencia de choque de precalentamiento que se han ajustado en base a la OD ₆₀₀ (dividir los valores de precalentamiento de choque por OD _600).

4. Microscopía de fluorescencia

Este ensayo es un método semi-cuantitativo para determinar la solubilización de los agregados con el tiempo en una población de células.

1. La inducción es la misma como se describe en la Sección 2, Etapas 1-8 de protocolos.
2. Los mismos puntos de tiempo se toman como se ha descrito anteriormente (Sección 3, Paso 4), pero para micrófonoroscopy recoger 1 ml de células en precalentar-choque y cada punto de tiempo de recuperación, y las muestras se incuban que giran a 30 ° C en tubo de cultivo.
3. Visualización:
   1. Centrifugar 1 ml de células a 6000 rpm durante 30 segundos y quitar sobrenadante.
   2. Resuspender el sedimento celular en 2 l de ddH ₂ O.
   3. Mezcle 2 l de células más 2 l de 2% de agarosa de baja fusión en la diapositiva y agregue una hoja de cubierta. Con el fin de obtener un solo plano de células presione ligeramente el dedo en el centro de la hoja de la cubierta y gire hasta que la hoja de la cubierta es difícil de mover.
   4. Las células se visualizaron utilizando aceite objetivo de 100X microscopio de fluorescencia, el uso de DIC para visualizar las células y el filtro FITC para visualizar la fluorescencia de GFP.
   5. Tome varias imágenes para cada cepa en cada punto de tiempo para la cuantificación. Los campos para los cuadros deben contener ~ 15 a 30 células para el análisis post-experimental cuantitativa.
   6. Para calcular el porcentaje de células que contienen agregados de la talla 50Células -100 suman y dividen el número de células que contienen agregados.

5. Soltero Microscopía Celular

Este método se utiliza para seguir la solubilización de los agregados individuales en una sola celda con el tiempo.

1. Inducir la expresión FFL-GFP como se describe en la Sección 2, los pasos 1-8.
2. Después de choque térmico, las células de centrifugación en tubo cónico de 15 ml a 4400 rpm durante 2 min.
3. Lavar las células con 500 l de agua y volver a suspender en 20 l de ddH ₂ O.
4. Para cada cepa, cortar una sección de 5x5 mm de una placa de agar SC-URA y el uso de la superficie que estaba en contacto con una placa de Petri, pipeta de 4 l de células y se extendió alrededor de la superficie de agar con la punta de la pipeta. Deje reposar durante aproximadamente 1 min.
5. Use pinzas para colocar la sección del cubo agar boca abajo en un ~ 55 mm con fondo de cristal plato n º 0 y presione ligeramente hacia abajo.
6. Visualización:
   1. Ver i-iii en la Secciónion 4.
   2. Set coordina por 2-4 puntos focales para cada cepa en función de la densidad de la cultura.
   3. Ajuste la cámara al tomar fotografías con una Z-stack con el rango adecuado (- / + 15 m con un grosor de 0,5 a 1,0 micras slice) cada 5 minutos durante un período de 90 min.

Resultados

La levadura es dependiente de la disaggregase, Hsp104 se repliegue de manera eficiente las proteínas desnaturalizadas por el calor. La actividad de FFL-GFP se controló después de un choque 25 min calor, utilizando un ensayo de luminiscencia flash de la Figura 1. Los resultados de este ensayo automatizado se muestra en la Figura 2 revelaron un aumento gradual en la actividad de más de 90 min que finalmente condujo a una recuperación> 80% en las células WT. La cepa hsp104Δ

Discusión

En este artículo la proteína modelo FFL-GFP se utilizó para demostrar que el disaggregase levadura, Hsp104 contribuye a la proteína re-solubilización y reparación. Los ensayos enzimáticos y microscopía interrogados diferencialmente el estado de la misma proteína sustrato para determinar la eficiencia y el rendimiento de replegamiento. Resultados de los ensayos de recuperación enzimáticos sugieren que no sólo es la recuperación máxima en la cepa mutante hsp104D ineficiente, pero la magnitud inicial...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Synergy MX Microplate Reader	BioTek
Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope	Olympus, Tokyo Japan
Lumitrac 200 white 96-well plates	USA Scientific
SlideBook 5.0 digital microscopy software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA
Equipment
Tris Base	Fisher	BP152-1
(LiAc) Lithium Acetate	Sigma	L6883
PEG (polyethelene glycol)	Fisher	BP233-1
EDTA	Fisher	BP120-1
DMSO	Malinckrodt	4948
SC	Sunrise	1300-030
SC-URA	Sunrise	1306-030
cycloheximide	Acros Organics	357420050
D-luciferin	Sigma	L9504
low melt agarose	NuSieve	50082
immersion oil	Cargille	16484