Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines Leuchtkäfer-Luciferase-GFP-Fusionsprotein zu untersuchen, In vivo Proteinfaltung in Saccharomyces cerevisiae. Mit diesem Reagenz Rückfaltung eines Modells Hitze-denaturiertes Protein gleichzeitig durch Fluoreszenzmikroskopie und einem enzymatischen Assay, um die Rollen von Proteostase Netzkomponenten Proteinqualitätskontrolle Sonde überwacht werden.

Zusammenfassung

Proteostasis, da die kombinierten Prozesse der Proteinfaltung / Biogenese definiert ist Rückfaltung / Reparatur und Abbau, ein empfindliches Gleichgewicht, das zelluläre gehalten, um zu vermeiden schädliche Folgen ¹ werden muss. Externe oder interne Faktoren, die dieses Gleichgewicht stören können, um Protein-Aggregation, Toxizität und Zelltod führen. Beim Menschen ist ein wichtiger Faktor, um die Symptome, die mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Chorea Huntington, Parkinson-und Alzheimer-Krankheiten ¹⁰ verbunden. Es ist daher wichtig, dass die Proteine ​​in der Instandhaltung von Proteostase beteiligt identifiziert werden, um Behandlungen für diese schwächenden Krankheiten zu entwickeln. Dieser Artikel beschreibt Techniken zur Überwachung in vivo Proteinfaltung in Quasi-Echtzeit Auflösung mit dem Modell Protein Glühwürmchenluciferase fusioniert mit grün fluoreszierende Protein (GFP-FFL). FFL-GFP ist ein einzigartiges Modell chimären Proteins als die FFL-Einheit ist extrem empfindlich auf Stress-induzierten misfolding und Aggregation, die das Enzym inaktiviert ^12. Die Luciferase-Aktivität überwacht wird unter Verwendung eines enzymatischen Assay, und das GFP-Einheit stellt ein Verfahren zur Visualisierung von löslichen oder aggregierten FFL mit automatisierten Mikroskopie. Diese Methoden gekoppelt sind mit zwei parallel und technisch unabhängige Ansätze, sowohl Rückfaltung und funktionellen Reaktivierung eines Enzyms nach Stress zu analysieren. Aktivität Erholung können direkt mit Kinetik der Disaggregation und Re-Solubilisierung korreliert werden, um besser zu verstehen, wie Protein-Qualitätskontrolle Faktoren wie Protein Chaperone um diese Funktionen auszuführen zusammenarbeiten. Darüber hinaus können Deletionen oder Mutationen zur Beiträge von spezifischen Proteinen oder Protein-Untereinheiten diesem Verfahren getestet werden. In diesem Artikel untersuchen wir die Beiträge des Proteins disaggregase Hsp104 ^13, bekannt, eine Partnerschaft mit der Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) Rückfaltung System ^5, zu Proteinrückfaltung, diesen Ansatz zu validieren.

Einleitung

Beim Menschen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Huntington-Krankheit haben Proteinfehlfaltungen und Aggregation ¹⁰ verbunden. Cells beschäftigen molekulare Chaperone, um kinetische Trapping von zellulären Proteinen in misfolded inaktiven Strukturen ⁶ zu verhindern. Chaperone Teilnahme in komplizierten Wechselwirkung Netzwerke innerhalb der Zelle, aber es ist nicht vollständig geklärt, wie die Summe dieser Wechselwirkungen organismal Proteostase beiträgt. Eines der wichtigsten Chaperone für die Mehrheit der cytosolischen Proteinfaltung ist die 70 kD Hitzeschockprotein (Hsp70) Familie ^19. Es hat sich gezeigt, dass in der Hefe Verlust von Hsp70 verringert die Fähigkeit, entstehende heterolog exprimiert FFL zu falten und das endogene Protein, Ornithin transcarbamoylase, in vivo ^{18, 7} falten. Die Fähigkeit zur Analyse mit nahezu Echtzeit Auflösung Faltung erleichtern das Verständnis, wie zusätzliche zelluläre Faktoren contribute dieser Hsp70-abhängigen Prozess. Darüber hinaus Falten / Umfaltungsreaktionen möglicherweise nicht völlig abhängig von diesen Beitrag Proteine, so Assays muss empfindlich genug, um sowohl große als auch kleine Veränderungen in der Kinetik und Effizienz zu erfassen.

Die Hefezelle disaggregase, Hsp104, spielt eine wichtige Rolle bei der Reparatur von aggregierten Proteinen misfolded. Obwohl Hsp104 Homologe in Pilzen und Pflanzen identifiziert worden sind, erscheint diese Familie zu sein, in Metazoen abwesend. Es wurde vorgeschlagen, dass andere Chaperone wie denen des Hsp110 Familie einige der bekannten Hsp104 Aktivitäten in Säugetieren ¹⁶ durchzuführen. Hsp104 ist ein AAA +, hexameren Protein-Komplex, dass die Funktionen in der Hefe zu renovieren Proteinaggregaten, einen Beitrag zur Rückfaltung und Reparatur ^13. Hsp104, zusammen mit der Hefe Hsp70, Ssa1 und der Hefe Hsp40, Ydj1, zur Verwertung von denaturiertem FFL in Hefezellen ^{5, 8} erforderlich. Die kleinen Hitzeschock-Protein, Hsp26, hat auch gezeigt, dass requi seinrot für Hsp104-vermittelte Aufschlüsselung der FFL ^2.

FFL ist ein Zwei-Domänen-Protein, das das Substrat Luciferin in der aktiven Stelle und infolge einer Konformationsänderung, ATP und Sauerstoff decarboxyliert erfordert bindet das Substrat und setzt Oxiluciferin, Kohlendioxid (CO _2), Adenosinmonophosphat (AMP), und Licht ^{11, 9, 3.} Die im Handel erhältlichen FFL Substrat, D-Luciferin, Ergebnisse in Lichtemission zwischen 550-570 nm, die unter Verwendung eines Luminometer ¹⁵ werden kann. FFL ist außerordentlich empfindlich auf Denaturierung von chemischen oder Wärmebehandlungen und Aggregate schnell beim Entfalten. Bei Temperaturen zwischen 39-45 ° C ausgesetzt FFL reversibel entfaltet und inaktivierten ^12. Im Gegensatz dazu sind GFP und seinen Derivaten sehr widerstandsfähig gegen Proteinentfaltung Spannungen ^14. Daher Fusion dieser beiden Proteine ​​erlaubt FFL als experimentell labilen Rest, der Targeting-funktionelle Funktion gFP um intrazelluläre Ablagerungen, die visualisiert werden kann mittels Fluoreszenzmikroskopie in der Bevölkerung und der einzelnen Zelle Ebenen. Verwendung des enzymatischen Assay in einer halbautomatischen Multimode-Reader mit automatisierten Mikroskopie gekoppelt ermöglicht ungeahnte gleichzeitige Beurteilung der Kinetik und Ausbeute Umfaltungsreaktionen. Darüber hinaus ermöglicht die einfache Molekulargenetik des Modells Eukaryoten Saccharomyces cerevisiae sowohl präzise Manipulation des Proteins Qualitätskontrolle Netzwerk und die Möglichkeit für die Entdeckung Ansätze für neue Spieler einen Beitrag zur zellulären Stressantwort und Proteostase identifizieren.

In dieser Studie sind Wildtyp (WT) und Hsp104 Deletionsstämme Ausdruck FFL-GFP unterliegen Proteindenaturierungsmittel Hitzeschock. FFL-GFP Rückfaltung durch sowohl einen enzymatischen Test und Mikroskopie als Proxy Auslesen zur Reparatur des exprimierten Proteom in einer Erholzeit Verlauf überwacht. Wenn zu WT-Zellen im Vergleich zeigen wir the Hsp104 Deletionsstamm ist ~ 60% weniger effizient Rückfaltung FFL-GFP, die Unterstützung bisherigen Erkenntnisse über eine Rolle in Hsp104 Reaktivierung denaturierter FFL ^2.

Protokoll

1. Der Bau der Stämme, die FFL-GFP Plasmid

Für diese Studie wurde Saccharomyces cerevisiae-Stamm BY4741 (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) zusammen mit einem Hsp104 Deletionsstamm aus der Hefe Knockout Sammlung (Open Biosystems / Thermo Scientific) verwendet. Die Streichung wurde bestätigt mit einem Hsp104-spezifischen Antikörper für Western-Blot-Analyse.

FFL-GFP wurde aus p426Met25-FFL-GFP exprimiert, hergestellt aus einem LEU2-basierte Quelle Plasmid aus dem Glover Labor an der Universität von Toronto und ¹⁷ erhältlich erhalten auf Anfrage bei den Autoren. Expression der FFL-GFP-Plasmid-Fusionsprotein wird durch die MET25 Methionin-reprimierbare Promotor kontrolliert. Das Plasmid wurde in jedem Stamm unter Verwendung eines Protokolls von Gietz et angepasst umgewandelt wurde. al, 1995:

1. Zentrifuge 25 ml o f log-Phase-Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen bei 4.400 rpm für 2 min, mit 500 ul doppelt destilliertem H ₂ 0 (ddH ₂ O) zu waschen, und entsorgen Überstand.
2. Die Zellen in 250 ul TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M Lithium-Acetat). Inkubation bei 30 ° C ohne Mischen für 20 min.
3. Übertragen Sie 50 ul kompetente Zellen in ein neues Röhrchen zusammen mit 5 ml (50 ug) von Träger-DNA und 5 ul (0,1-5 ug) von Plasmid-DNA. In 300 ul PEG / TE / LiAc (wie TE / LiAc plus 40% Polyethylenglykol) zu dieser Mischung und Inkubation Zellen bei 30 ° C für weitere 30 min.
4. 1/10 Volumen (v / v) DMSO (36 ul) zu dieser Mischung und Hitzeschock bei 42 ° C für 6 min.
5. Zentrifuge Mischung bei 6.000 min für 30 sec und entfernen Überstand. Die Zellen in 100 ul sterilem ddH ₂ 0 und Platte Zellen auf synthetischem Komplettmedium ohne Uracil (SC-URA).

2. Induktion von FFL-GFP

nt "> FFL-GFP induziert wird, wenn Zellen in der log-Phase sind, so dass die Mehrheit des Proteins vor der Hitze-Schock neu durchgeführt wird, um Proteine, die terminal über die Zeit aufgrund altersbedingter zellulären Unzulänglichkeiten aggregiert vermeiden.

1. Tag 1: Inkubation Zellen in 5 ml SC-URA bei 30 ° C rotierend O / N.
2. Tag 2: Messen OD ₆₀₀ und impfen frische Kulturen in 5 ml SC-URA OD ₆₀₀ ~ 0,2.
3. Inkubieren Kulturen mit Drehung bei 30 ° C, bis sie log-Phase OD ₆₀₀ ~ 0,8-1,0 zu erreichen.
4. Zentrifuge Zellen in 15 ml konischen Röhrchen bei 4.400 rpm für 3 min, abgießen Überstand und Zellpellet in 500 ul ddH ₂ 0; Transfer-Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
5. Zentrifuge bei 6.000 rpm und entsorgen Überstand.
6. Die Zellen in 5 ml SC-URA-MET. Die Zellen sollten inkubiert Drehen in dieses Medium für 1 h bei 30 ° C werden
7. Zentrifuge Zellen und das Waschen wiederholen in ddH ₂ 0 und entsorgen Überstand.
8. Resuspend Zellen in 5 ml SC-URA Medium mit 100 ug / ml Cycloheximid, um die Proteinexpression zu hemmen, und fahren Sie sofort mit Schritt 3 fort.

3. Enzymatische FFL-GFP Recovery-Assay

Dieser Test ist ein quantitativer Ansatz, um die Konzentrationen von aktivem Enzym in einer Population zu bestimmen.

1. Vorbereitung für diesen Test:
   1. Messen OD ₆₀₀ für jede Probe.
   2. Vorbereitung der notwendigen Menge an D-Luciferin brauchte auf die Anzahl der Stichproben und der gewünschten Anzahl an Wiederholungen plus ca. 1.200 ul für die Schläuche. Endkonzentration von D-Luciferin ist ~ 23 g pro 100 ul der Zellen. Zunächst wird in Wasser bei einer Konzentration der Stammlösung von 7,5 mg / ml gelöst und auf 455 pg / ml in SC vor Experiment. In Fig. 2 drei Wiederholungen für jede Probe wurden analysiert, was in insgesamt 2,4 ml D-Luciferin verwendet.
   3. Programm-Reader für Flash lumizenz-Test (in Anlehnung an BioTek Gen5 "Flash-Lumineszenz-Assay mit Injection", für andere Instrumente Herstellerangaben beachten)
      1. Temperatur auf 30 ° C
      2. Set Platte Leser D-Luciferin hinzufügen, schütteln und lesen Sie jede auch einzeln.
      3. Lesen Lumineszenz (Endpunkt Lesung, 5 sec Integrationszeit, 180 Empfindlichkeit)
      4. Für Erholung Assay zwischen jeder Ablesung Shake für 5 min, 20 min zu verzögern, und schütteln Sie zusätzlich 5 min.
      5. Geben Sie 50 ul von D-Luciferin von einem Injektor.
2. Vorheizen-Schock Lumineszenz wird unmittelbar nach Zellen zu Medien mit Cycloheximid, die Proteinsynthese zu stoppen hinzugefügt gemessen.
   1. Übertragen Sie 100 ul der Zellen für jede Probe mit der gewünschten Anzahl an Wiederholungen in einem festen, weißen 96-Well-Platte.
   2. Kontrollen sollten Folgendes umfassen eine leere Wasser und Zellen mit einem leeren Vektor.
   3. Starten Sie den Schreibschutz mit dem spefikationen oben aufgeführt sind.
3. Um die Einheit der FFL FFL-GFP denaturieren, bebrüten die 5 ml Kultur in einem Glas Kultur Rohr bei 42 ° C für 25 min geschüttelt.
4. Recovery-Assay Lumineszenz Lesungen sofort zu starten, nachdem die Zellen aus dem Inkubator, der Zeitpunkt Null ist, werden entfernt. Messen Lumineszenz gleiche wie oben für den ersten Zeitpunkt und alle 30 Minuten während 90 min beschrieben.
5. Normalisieren Proben zur Vorwärmung-Schock-Lumineszenz-Werte, die auf der Grundlage der OD ₆₀₀ (unterteilen die Vorwärmung-Schock Werte von OD ₆₀₀₎ wurden angepasst.

4. Fluoreszenzmikroskopie

Dieser Assay ist eine semi-quantitative Verfahren zur Solubilisierung von Aggregaten im Laufe der Zeit in eine Population von Zellen zu bestimmen.

1. Induktion ist die gleiche wie in Abschnitt 2 beschrieben, werden die Schritte 1-8 von Protokollen.
2. Die gleichen Zeitpunkten getroffen werden wie oben beschrieben (Abschnitt 3, Schritt 4), aber für microscopy sammeln 1 ml der Zellen bei vorzuwärmen-Schock und jeden Wiederherstellungspunkt Zeitpunkt, und Inkubation Proben Drehen bei 30 ° C in Kultur Rohr.
3. Visualisierung:
   1. Zentrifuge 1 ml der Zellen bei 6000 rpm für 30 sec und entfernen Überstand.
   2. Zellpellet in 2 ul ddH ₂ O.
   3. Mix 2 ul Zellen sowie 2 ul 2% niedrig schmelzende Agarose auf dem Objektträger und fügen Sie ein Deckglas. Um eine einzelne Ebene der Zellen zu erhalten drücken Sie leicht den Finger in der Mitte des Deckglas und drehen, bis das Deckglas ist schwer zu bewegen.
   4. Zellen visualisiert werden mit 100X Öl-Objektiv am Fluoreszenzmikroskop; verwenden DIC zu den Zellen und die FITC-Filters zu visualisieren GFP-Fluoreszenz sichtbar zu machen.
   5. Nehmen mehrerer Bilder für jeden Stamm zu jedem Zeitpunkt zur Quantifizierung. Felder für Bilder sollte ~ 15-30 Zellen für quantitative post-experimentellen Analyse enthalten.
   6. Um Prozentsatz der Zellen, die Aggregate zu berechnen, zählen 50-100 Zellen insgesamt und teilen die Anzahl der Zellen, die Aggregate.

5. Single Cell Mikroskopie

Dieses Verfahren wird verwendet, um die Solubilisierung von einzelnen Aggregaten in einer einzigen Zelle im Laufe der Zeit zu folgen.

1. Induce FFL-GFP-Expression, wie in Abschnitt 2 beschrieben, werden die Schritte 1-8.
2. Nach Hitzeschock-, Zentrifugen-Zellen in 15 ml konischen Röhrchen bei 4.400 rpm für 2 min.
3. Waschen der Zellen mit 500 ul Wasser und resuspendieren in 20 ul ddH ₂ O.
4. Für jeden Stamm Ausschneiden eines 5x5 mm Abschnitt eines SC-URA-Agar-Platte und mit der Oberfläche, die in Kontakt mit Petrischale Pipette 4 ul Zellen und Verbreitung auf Oberfläche des Agar mit Pipettenspitze. Lassen Sie stehen für ~ 1 min.
5. Mit einer Pinzette Agar cube Abschnitt verdeckt platzieren auf einem ~ 55 mm Glasboden Gericht Nr. 0 und leicht andrücken.
6. Visualisierung:
   1. Siehe i-iii in Abschn.Ionen-4.
   2. Set-Koordinaten für 2-4 Anlaufstellen für jeden Stamm je nach Dichte der Kultur.
   3. Schalten Sie die Kamera, um Bilder mit einer Z-Stapel mit den entsprechenden Bereich zu nehmen (- / + 15 um mit einem 0,5-1,0 um Schichtdicke) alle 5 Minuten für eine 90-Minuten-Zeitraum.

Ergebnisse

Hefe ist abhängig von der disaggregase an Hsp104 effizient falten hitzedenaturierten Proteine. Die Aktivität der FFL-GFP wurde nach einer 25 min Hitzeschock überwacht, mit einem Lumineszenz-Assay Flash Abbildung 1. Die Ergebnisse dieser automatisierten Assays in 2 gezeigt ergab eine schrittweise Erhöhung der Aktivität über 90 min, die letztlich zu einer> 80% Ausbeute in WT-Zellen führte. Die hsp104Δ Stamm gewonnen 19% der ursprünglichen Aktivität gegenüber dem gle...

Diskussion

In diesem Artikel wird das Modell Protein FFL-GFP wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Hefe disaggregase, Hsp104 zu Protein re-Solubilisierung und Reparatur trägt. Die enzymatische Assays und Mikroskopie differentiell den Status des gleichen Substrats Protein Rückfaltung Effizienz und Ausbeute zu bestimmen abgefragt. Ergebnisse der enzymatischen Assays Erholung vermuten, dass nicht nur der maximalen Erholung der hsp104D Mutantenstamm ineffizient, aber die anfängliche Größe der Entfaltung Spannung größ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Synergy MX Microplate Reader	BioTek
Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope	Olympus, Tokyo Japan
Lumitrac 200 white 96-well plates	USA Scientific
SlideBook 5.0 digital microscopy software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA
Equipment
Tris Base	Fisher	BP152-1
(LiAc) Lithium Acetate	Sigma	L6883
PEG (polyethelene glycol)	Fisher	BP233-1
EDTA	Fisher	BP120-1
DMSO	Malinckrodt	4948
SC	Sunrise	1300-030
SC-URA	Sunrise	1306-030
cycloheximide	Acros Organics	357420050
D-luciferin	Sigma	L9504
low melt agarose	NuSieve	50082
immersion oil	Cargille	16484