В сочетании Анализы для мониторинга рефолдинг Белок в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Резюме

В этой статье описывается использование люциферазы светляков-GFP слитого белка для расследования В естественных условиях Сворачивания белка в Saccharomyces CEREVISIAE. Используя этот реагент, повторную укладку модели тепловой денатурации белка может быть одновременно контролировали с помощью флуоресцентной микроскопии и ферментативного количественного анализа, чтобы исследовать роль компонентов proteostasis сети белок контроль качества.

Аннотация

Proteostasis, определяемый как комбинированный процесс складывания белка / биогенезе, укладку / ремонта, и деградацию, это тонкий клеточный баланс, который должен быть сохранен, чтобы избежать вредных последствий ^1. Внешних или внутренних факторов, которые разрушают этот баланс может привести к агрегации белка, токсичность и гибели клеток. У людей это является одним из основных факторов, способствующих симптомы, связанные с нейродегенеративных расстройств, таких как Гентингтона, Паркинсона и болезни Альцгеймера ^10. Поэтому очень важно, что белки, участвующие в поддержании proteostasis быть идентифицированы с целью разработки методов лечения этих изнурительных болезней. Этой статье описываются методы для мониторинга в естественных условиях укладка белков в близком к реальному времени разрешение с помощью модели белка люциферазы светляков слит с зеленого флуоресцентного белка (GFP FFL-). FFL-GFP представляет собой уникальную модель химерных белков как FFL фрагмент чрезвычайно чувствительна к стресс-индуцированной мisfolding и агрегации, которая инактивирует фермент ^12. Активность люциферазы контролируется с использованием ферментативного количественного анализа, а остаток GFP обеспечивает способ визуализации растворимый или агрегированные нулевой отметки с использованием автоматизированных микроскопии. Эти методы включают сочетание двух параллельных и технически независимых подхода для анализа и повторной укладки и функциональные реактивации фермента после стресса. Восстановление активности может быть непосредственно связано с кинетикой разукрупнения и повторного растворения, чтобы лучше понять, как белка контроль качества факторов, таких как белок шаперонами кооперируются для выполнения этих функций. Кроме того, ген делеции или мутации могут быть использованы для проверки вклады специфических белков или белковых субъединиц в этот процесс. В этой статье мы рассмотрим вклад белка disaggregase Hsp104 ^13, известного партнера с Hsp40/70/nucleotide фактором бирже (NEF) рефолдинга системы ^5, с белком рефолдинга для проверки этого подхода.

Введение

У людей нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона были связаны с неправильного сворачивания белка и агрегации ^10. Клетки используют молекулярные шаперонами для предотвращения захвата кинетической клеточных белков в неактивной неправильно упакованных структур ^6. Шаперонов участие в сложной сети взаимодействий в клетке, но это не совсем понял, как суммы этих взаимодействий способствует организменную proteostasis. Одним из основных шаперонов ответственны за большинство цитозольных складной белок 70 кДа белка теплового шока (Hsp70) семейство ^19. Было показано, что в дрожжах потери Hsp70 уменьшается обеспечения возможности сгибать возникающий гетерологично выражены нулевой отметки и повторной укладки эндогенный протеин, орнитин transcarbamoylase, в ¹⁸ живом ^{организме, 7.} Умение анализировать складывающиеся с почти в реальном времени разрешение будет способствовать пониманию того, как дополнительные факторы сотовых продолжениеribute этому Hsp70-зависимый процесс. Кроме того, раскладной / рефолдинга реакции не может быть полностью зависимыми от этих белков способствует, поэтому анализы должны быть достаточно чувствительными, чтобы обнаруживать как крупные, так и небольшие изменения в кинетику и эффективность.

Disaggregase дрожжевой клетки, Hsp104, играет жизненно важную роль в ремонте агрегированных неправильно упакованных белков. Хотя Hsp104 гомологов были выявлены у грибов и растений, эта семья, кажется, отсутствуют в многоклеточные. Было высказано предположение, что другие шаперонов, такие как семейства Hsp110 выполнять некоторые из известных Hsp104 деятельности у млекопитающих ^16. Hsp104 является AAA +, гексамерные белковый комплекс, который функционирует в дрожжах, чтобы реконструировать агрегаты белка, способствуя укладку и ремонт ^13. Hsp104, вместе с дрожжами Hsp70, SSA1 и дрожжи Hsp40, Ydj1, необходимо для восстановления денатурированного нулевой отметки в дрожжевых клетках, ^{5, 8.} Малый белок теплового шока, Hsp26, также было показано, что requiкрасный для Hsp104-опосредованной дезагрегацию FFL ^2.

Лит состоит из двух доменов белок, который связывается субстрат люциферин в активном сайте и после конформационное изменение, которое требует АТФ и кислорода, декарбоксилирует подложки выпуска оксилюциферин, диоксида углерода (СО _2), аденозин монофосфат (АМФ) и ^{11 света, 9, 3.} Коммерчески доступные нулевой отметки подложки, D-люциферин, приводит светового излучения между 550-570 нм, которые могут быть обнаружены с помощью фотометра ^15. FFL исключительно чувствительна к денатурации химической или термической обработки и агрегатов на быстро разворачивается. Под воздействием температуры от 39-45 ° C FFL обратимо развернулась и инактивированные ^12. В противоположность этому, GFP и его производные обладают высокой устойчивостью к разворачивания белка напряжений ^14. Поэтому сплав этих двух белков позволяет нулевой отметки, чтобы функционировать в качестве экспериментального лабильный фрагмент, способный нацеливание функциональный GFP к внутриклеточным депозитов, которые могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии и население, и одного уровня ячейки. Применение ферментного анализа в полуавтоматическом многомодовых ридере в сочетании с автоматизированной микроскопии позволяет беспрецедентную одновременной оценки кинетики и выход рефолдинга реакций. Кроме того, легкий молекулярной генетики эукариот модели CEREVISIAE Saccharomyces позволяет и точное манипулирование сети управления качеством белка и возможность для открытия подходы к идентификации новых игроков способствует клеточной реакции стресса и proteostasis.

В этом исследовании дикого типа (WT) и Hsp104 удаления штаммы, экспрессирующие лит-GFP подлежат денатурации белка теплового шока. FFL-GFP рефолдинга контролируется через обе ферментного анализа и микроскопии в качестве прокси для считывания ремонт выразил протеомом за ходом времени восстановления. По сравнению с WT клетках, мы показываем йэлектронной Hsp104 удаления деформации ~ 60% менее эффективны при повторной укладки FFL-GFP, поддерживая предыдущие выводы создании Hsp104 роль в реактивации денатурированного FFL ^2.

протокол

1. Строительство штаммов, содержащих FFL-GFP плазмиды

Для этого исследования штамма Saccharomyces CEREVISIAE BY4741 (MAT, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) использовалась наряду с штаммом Hsp104 удаления из коллекции дрожжей нокаутом (Открытое биосистем / Thermo Scientific). Удаление была подтверждена с помощью Hsp104-специфических антител для Вестерн-блоттинга.

FFL-GFP было высказано от p426MET25-FFL-GFP, построенных из LEU2 основе источника плазмиды, полученной из лаборатории Гловер в Университете Торонто ¹⁷ и получить по запросу авторов. Экспрессия лит-GFP плазмиды слитого белка контролируется МЕТ25 метионин-репрессируемый промотора. Плазмиду трансформировали в каждой линии, используя протокол был адаптирован из Gietz и. др., 1995:

1. Центрифуга 25 мл о F логарифмической фазе клеток в 50 мл коническую трубку при 4400 оборотах в минуту в течение 2 мин, промывают 500 мкл бидистиллированной H ₂ 0 (Ddh ₂ O), и отбросить супернатант.
2. Ресуспендируют клеток в 250 мкл TE / LiAc (Трис-HCl 10 мМ, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 0,1 М ацетата лития). Инкубируют при 30 ° С без перемешивания в течение 20 мин.
3. Передача 50 мкл компетентных клеток в новую пробирку вместе с 5 мл (50 мкг) ДНК-носитель и 5 мкл (0,1-5 мкг) плазмидной ДНК. Добавить 300 мкл ПЭГ / TE / LiAc (то же, TE / LiAc плюс 40% полиэтиленгликоля) этой смеси, и клетки инкубируют при 30 ° С в течение еще 30 мин.
4. Добавить 1/10 объема (объем / объем), ДМСО (36 мкл) к этой смеси и теплового шока при 42 ° С в течение 6 мин.
5. Центрифуга смеси при 6000 оборотах в минуту в течение 30 сек и удалить супернатант. Ресуспендируют клеток в 100 мкл стерильной DDH ₂ 0 и пластины клеток на синтетической полной среде, не содержащей урацил (SC-URA).

2. Индукция FFL-GFP

нт "> лит-GFP индуцируется как только клетки в логарифмической фазе поэтому большинство белков до теплового шока заново, чтобы избежать белки, которые неизлечимо объединены с течением времени из-за возрастного сотовой недостатков.

1. День 1: инкубируют клетки в 5 мл SC-УПА при 30 ° С вращающейся O / N.
2. День 2: Измерение OD ₆₀₀ и прививку свежих культур в 5 мл SC-УРА OD ₆₀₀ ~ 0,2.
3. Выдержите культур с поворотом на 30 ° C, пока не достигнут логарифмической фазе OD ₆₀₀ ~ 0,8-1,0.
4. Центрифуга клеток в 15 мл конические пробирки при 4400 оборотах в минуту в течение 3 минут, надосадочную жидкость декантируют и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл DDH ₂ 0; передачу решения микроцентрифужных трубки.
5. Центрифуга при 6000 оборотов в минуту и ​​отбросить супернатант.
6. Ресуспендируют клеток в 5 мл SC-УРА-MET. Клетки должны быть инкубированы вращающихся в этой среды в течение 1 часа при 30 ° С.
7. Центрифуга клетки и повторите промывку в Ddh ₂ 0 и отбросить супернатант.
8. Resuspeй клетки в 5 мл SC-УРА средах, содержащих 100 мкг / мл циклогексимида ингибировать экспрессию белка, и немедленно приступить к шагу 3.

3. Ферментативный FFL-GFP Восстановление анализа

Этот анализ количественный подход для определения уровней активного фермента в популяции.

1. Подготовка к этому анализ:
   1. Измерить OD ₆₀₀ для каждого образца.
   2. Подготовьте необходимое количество D-люциферин нуждалась в зависимости от количества образцов и необходимое количество повторов плюс приблизительно 1200 мкл для труб. Конечная концентрация D-люциферин составляет ~ 23 мкг на 100 мкл клеток. Первоначально она растворяется в воде при концентрации исходного раствора 7,5 мг / мл и разбавляли до 455 мкг / мл в SC до эксперимента. На рисунке 2, трех повторов для каждого образца анализировали в результате чего в общей сложности 2,4 мл D-люциферин используется.
   3. Программа ридер для флеш-люлюминесценции анализа (адаптировано из BioTek Gen5 "вспышки люминесценции Проба с инъекций", для других инструментов следовать инструкциям производителя)
      1. Установка температуры до 30 ° C
      2. Установить ридер добавить D-люциферином, трясти, и читать каждую лунку индивидуально.
      3. Читайте люминесценции (конечная точка чтении, 5 секунд времени интегрирования, 180 уровня чувствительности)
      4. Для восстановления анализа между каждым чтением дрожания в течение 5 мин, задержка 20 мин, и встряхните еще 5 мин.
      5. Добавьте 50 мкл D-люциферин из инжектора.
2. Предварительный нагрев шока люминесценции измеряется непосредственно после клеткам добавляют в средах, содержащих циклогексимид, чтобы остановить синтез белка.
   1. Передача 100 мкл клеток для каждого образца с желаемое количество повторов в твердый белый 96-луночный планшет.
   2. Контроль должен включать пустой воды и клеток, содержащих пустой вектор.
   3. Начните чтение с тем SPEcifications перечисленных выше.
3. Для денатурации нулевой отметки фрагмент лит-GFP, инкубировать 5 мл культуры в пробирку с культурой стекла при 42 ° С встряхивания в течение 25 мин.
4. Восстановление показаний анализа люминесценции начинается сразу после того как клетки извлекали из термостата, которая равна нулю момент времени. Измерение люминесценции же, как описано выше для первого момент времени, и каждые 30 мин в течение 90 мин.
5. Нормализация образцы для подогрева-шок люминесценции значения, которые были скорректированы на основе OD ₆₀₀ (поделите Разогреть шока значений OD _600).

4. Флуоресцентной микроскопии

Этот анализ полуколичественный метод определения растворимости агрегатов с течением времени в популяции клеток.

1. Индукционные так же, как описано в разделе 2, стадии 1-8 протоколов.
2. То же моменты времени принимаются как описано выше (Раздел 3, стадия 4), но для микрофонаroscopy собирают 1 мл клеток при подогрева шока и каждой точке времени восстановления, и инкубируют образцы вращающихся при 30 ° С в культуре трубки.
3. Визуализация:
   1. Центрифуга 1 мл клеток при 6000 оборотах в минуту в течение 30 сек и удалить надосадочную жидкость.
   2. Ресуспендируют осадок клеток в 2 мкл DDH ₂ O.
   3. Смешайте 2 мкл клеток плюс 2 мкл 2% с низкой температурой плавления агарозы на слайде и добавить покровного стекла. Для того чтобы получить одну плоскость клеток слегка нажмите пальцем в центре крышки скольжения и поворота, пока покровное стекло не трудно двигаться.
   4. Клетки визуализированы с помощью 100X цель масла флуоресцентного микроскопа; DIC использовать для визуализации клеток и FITC фильтр для визуализации флуоресценции GFP.
   5. Возьмите несколько изображений для каждого штамма в каждый момент времени для количественного определения. Поля для картин должна содержать ~ 15-30 клеток для количественной пост-экспериментального анализа.
   6. Чтобы вычислить процент клеток, содержащих агрегаты, количество 50-100 Клетки полной и разделить количество клеток, содержащих агрегаты.

5. Одноместный микроскопии сотовых

Этот способ используется следовать солюбилизации отдельных агрегатов в одной ячейке с течением времени.

1. Вызвать FFL-GFP выражение, как описано в разделе 2, стадии 1-8.
2. После теплового шока, центрифуги клеток в 15 мл коническую трубку при 4400 оборотах в минуту в течение 2 минут.
3. Мытье клеток с 500 мкл воды и ресуспендируют в 20 мкл DDH ₂ O.
4. Для каждого штамма, вырезать 5x5 разделе мм SC-URA агаром и используя поверхность, которая была в контакте с чашки Петри, пипетки 4 мкл клеток и распространение вокруг поверхности агара с кончиком пипетки. Дайте постоять в течение ~ 1 мин.
5. Используйте пинцет, чтобы поместить раздел агар куб лицевой стороной вниз на ~ 55 мм 0 номер со стеклянным дном блюдо и слегка надавите.
6. Визуализация:
   1. См. I-III в разделеионный 4.
   2. Задать координаты в течение 2-4 координационные центры для каждого штамма в зависимости от плотности культуры.
   3. Установите камеру делать снимки с Z-стек с соответствующего диапазона (- / + 15 мкм с толщиной среза 0,5-1,0 мкм) каждые 5 мин в течение 90 мин периода.

Результаты

Дрожжи зависит от disaggregase, Hsp104 эффективно повторной укладки тепловой денатурации белков. Активность лит-GFP контролировали после теплового шока 25 мин, с использованием анализа люминесценции флэш рисунке 1. Результаты этого автоматизированного анализа показан на рисунке 2

Обсуждение

В этой статье модель белка FFL-GFP был использован, чтобы показать, что дрожжи disaggregase, Hsp104 способствует белка повторного растворения и ремонт. Ферментативный анализ и микроскопии дифференциально опрошенных состояния одного и того же белкового субстрата для определения повторной укладки...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Synergy MX Microplate Reader	BioTek
Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope	Olympus, Tokyo Japan
Lumitrac 200 white 96-well plates	USA Scientific
SlideBook 5.0 digital microscopy software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA
Equipment
Tris Base	Fisher	BP152-1
(LiAc) Lithium Acetate	Sigma	L6883
PEG (polyethelene glycol)	Fisher	BP233-1
EDTA	Fisher	BP120-1
DMSO	Malinckrodt	4948
SC	Sunrise	1300-030
SC-URA	Sunrise	1306-030
cycloheximide	Acros Organics	357420050
D-luciferin	Sigma	L9504
low melt agarose	NuSieve	50082
immersion oil	Cargille	16484