Síntesis, Entrega y Celular<em&gt; En vivo</em&gt; Aplicación de sensores de pH basadas en dendrímeros

Resumen

Sensores de fluorescencia son herramientas poderosas en ciencias de la vida. Aquí se describe una metodología para sintetizar y utilizar sensores fluorescentes basadas en dendrímeros para medir el pH en las células vivas e in vivo. El andamio dendríticas mejora las propiedades de los tintes fluorescentes conjugados que conducen a propiedades mejoradas de detección.

Resumen

El desarrollo de indicadores fluorescentes representó una revolución para las ciencias de la vida. Genéticamente codificados y fluoróforos sintéticas con capacidades de detección permite la visualización de las especies de importancia biológica con alta resolución espacial y temporal. Los colorantes sintéticos son de particular interés, gracias a su elevada capacidad de ajuste y la amplia gama de analitos medibles. Sin embargo, estas moléculas sufren varias limitaciones relacionadas con la pequeña molécula de la conducta (mala solubilidad, las dificultades en la selección, a menudo no hay imagen radiométrica permitido). En este trabajo presentamos el desarrollo de sensores basadas en dendrímeros y presentamos un procedimiento para la medición de pH in vitro, en células vivas y en vivo. Elegimos dendrímeros como plataforma ideal para nuestros sensores por sus muchas propiedades deseables (monodispersidad, propiedades sintonizables, multivalencia) que los de un andamio ampliamente utilizado por varios dispositivos biomédicos hechos. La conjugación del pH fluorescenteindicadores al andamio dendrímero condujeron a una mejora de sus actuaciones de detección. En particular, los dendrímeros presentan reduce las fugas de células, mejorando la orientación intracelular y permitir mediciones radiométricas. Estos nuevos sensores se emplean con éxito para medir el pH en las células HeLa que viven e in vivo en cerebro de ratón.

Introducción

El uso de moléculas fluorescentes para etiquetar moléculas biológicamente relevantes específicos ha cambiado completamente la forma en que estudiamos sistemas biológicos. Widefield y microscopía confocal permitió un tiempo real de alta resolución de visualización de procesos biológicos y en la actualidad se encuentran entre las técnicas más populares para estudiar los eventos biológicos in vitro, en células e in vivo. ¹ Una mejora relevante estuvo representado por el desarrollo de indicadores de fluorescencia , es decir, colorantes cuya fluorescencia es dependiente de la concentración de una entidad molecular específica. indicadores de pH y calcio, en particular, han tenido un impacto dramático en el estudio de la fisiología de las células debido a la enorme relevancia de H ⁺ y Ca ^{2 +} iones en la biología. ^2,3

Sin embargo, la mayoría de los tintes de detección presentan varias limitaciones intrínsecas relacionadas con su comportamiento pequeña molécula, tales como: i) dificultades en targeti subcelularng; ii) escasa solubilidad en agua y por lo tanto pobre biocompatibilidad;. y iii) la fuga de células y por lo tanto la falta de tiempo la capacidad de time-lapse ⁴ Por otra parte, la señal de muchas sondas no se puede corregir para la dependencia de la concentración de colorante (no radiométrica de imágenes) y, por lo tanto, una medida absoluta en células o in vivo no es posible.

Recientemente hemos descrito una metodología sencilla y eficaz para superar estas limitaciones, basado en la conjugación de los tintes de detección en un andamio dendrímero. ⁵ Los dendrímeros son polímeros hiperramificados monodispersas con propiedades muy atractivas para aplicaciones biológicas. ⁶ En particular, varias arquitecturas dendríticas se han desarrollado y utilizado de drogas ⁷ y la entrega de genes. ⁸ Sólo muy recientemente varios grupos comenzaron a explorar el potencial de estas moléculas como andamio para dispositivos de detección. ^9,10,11

Anteriormentese describe una ruta sintética fácil hacia la funcionalización de diferentes poliamidoamina (PAMAM) andamios sobre la base de ésteres activados-NHS. ¹² Los conjugados se pueden obtener en una sola etapa por medio de diálisis como sólo la purificación. Curiosamente este enfoque se puede aplicar fácilmente a una variedad de andamios dendríticas o poliméricos. ^13,14

Para lograr dendrímeros de formación de imágenes radiométricas fueron doble marcado con dos conjuntos de colorantes: i) un indicador de pH (es decir, fluoresceína) y ii) un resto fluorescente independiente del pH (es decir, la rodamina). Esto nos permitió realizar imágenes pH preciso como el cociente entre la fluoresceína y rodamina sólo depende del pH y no más de la concentración de la sonda. Otro enfoque interesante para este problema está representada por el uso de sondas basadas en toda la vida. ¹⁵ Como el tiempo de vida no depende de la concentración de la sonda estas mediciones no necesitan una corrección radiométrica. Sin embargo, LIFmediciones Etime requieren una configuración de instrumento más complicado y su resolución temporal es sub-óptimo para los procesos fisiológicos rápidos, lo que limita sus posibles aplicaciones.

Con el fin de realizar las imágenes de intracelular, la sonda tiene que ser entregado a través de la membrana plasmática en el citosol. Como los dendrímeros no están membrana permeable debido a su tamaño y la hidrofilia, la administración intracelular podría lograrse mediante electroporación. Por medio de esta técnica, ampliamente utilizado en biología para la transfección, macromoléculas marcadas se pueden entregar de manera efectiva en las células para realizar las imágenes de alta calidad. Por otra parte, con la electroporación las complicaciones relacionadas con la endocitosis dendrímero se pueden evitar como las macromoléculas son entregados directamente al citoplasma. Curiosamente después de electroporación diferentes dendrímeros muestran localizaciones distintas dentro de las células, incluso en ausencia de una secuencia de acceso específica. ⁵ Este passive focalización, sólo se debe a las propiedades físico-químicas del dendrímero, se puede aprovechar para lograr imágenes pH-orgánulo específico.

Radiométrico de imágenes se puede realizar utilizando microscopía confocal. Fluoresceína y rodamina, covalentemente conjugado con el andamio dendríticas, se obtuvieron imágenes por separado y una relación de mapa píxel por píxel se ha creado. Se informó de varios procedimientos para controlar el pH intracelular en las células vivas mediante ionóforos. Los ionóforos son pequeñas moléculas hidrófobas capaces de transportar iones a través de la membrana plasmática; ionóforos de iones H ^+, tales como nigericina, están disponibles y se puede utilizar para calibrar sensores basados ​​en dendrímeros ¹⁶ Estas mediciones revelaron una respuesta lineal a pH de manera similar a lo observado. in vitro. Sobre la base de que el pH intracelular de calibración podría ser medido con precisión. Estas mediciones demostraron que el sensor basado en dendrímero puede ser una herramienta valiosa en el estudio de H ⁺ homeostasis en las células vivas y los procesos patológicos que implican un mal funcionamiento de regulación de pH.

Recientemente hemos demostrado que los sensores de pH basados ​​en dendrímeros también se pueden aplicar in vivo, la realización de imágenes de pH en el cerebro de los ratones anestesiados. ¹⁷ Debido a la complejidad del entorno de los tejidos vivos de una alta calidad en la detección in vivo es técnicamente difícil. Aquí se muestra una descripción detallada del procedimiento experimental para obtener imágenes de pH in vivo con énfasis de los temas cruciales que deben abordarse para realizar una imagen precisa del pH en el cerebro. Microscopía de dos fotones ha sido empleado por dos razones principales: i) el uso de la luz infrarroja permite superar la falta de penetración en el tejido de la microscopía confocal estándar; ii) la amplia absorción de dos fotones de fluoresceína y rodamina permite evitar su excitación simultánea del complicaciones relacionadas con el uso de dos longitudes de onda para la excitación. mediciones de pH en el cerebro de ratones fueronllevaron a cabo con éxito; sensores responden fácilmente a la hipoxia induce el cambio de pH en el espacio extracelular del cerebro. Estas mediciones demuestran que los indicadores basados ​​en dendrímeros pueden ser utilizados con éxito para resaltar cambio fisiológico y patológico de pH in vivo en un modelo animal.

Protocolo

1. Síntesis de los Sensores

1. En la siguiente sección, se proporciona un procedimiento para la conjugación de indicadores de pH a dendrímeros PAMAM. El mismo protocolo se puede aplicar con modificaciones mínimas a dendrímeros de amina de soporte de alternativas. ^5,17,13,14 dendrímeros y colorantes comercialmente disponibles pueden ser utilizados sin más purificaciones.
2. Disolver el dendrímero en DMSO anhidro (concentración final 50 mM). Preparar soluciones madre 10 mM de fluoresceína-NHS y tetrametil-rodamina-NHS (TMR) en DMSO anhidro.
3. Añadir a la solución dendrímero la cantidad deseada de fluoresceína y TMR. La relación molar en la mezcla reflejará la cantidad de colorantes cargados en el dendrímero. Típicamente 1 ml de solución de dendrímero PAMAM G4 en un tubo de microcentrífuga se hace reaccionar con 8 eq (40 mu l) de fluoresceína y 8 eq (40 mu l) de TMR. Se agita la solución a temperatura ambiente durante 12 h.
4. Diluir 1:10 con agua desionizada y cargar la reacciónmezcla en una bolsa de diálisis (MWCO = 10 kDa). Se dializa durante 24 horas frente a agua desionizada reemplazar con frecuencia el agua en el depósito.
5. Transfiera la solución a un vial y se liofiliza durante 24 horas. Un polvo de color púrpura se debe obtener. Peso del sólido obtenido y se disuelven en agua MilliQ a una concentración final de 10 mM. Alícuota de la solución y se almacenan a -20 ° C.

2. In Vitro de pH Las mediciones

1. Para la calibración in vitro preparar una solución 500 nM de dendrímero en PBS (fosfato 2 mM) en una cubeta de cuarzo. Se recomienda el uso de un tampón de PBS muy diluidas (2 mM) para evitar cambios bruscos de pH durante la valoración.
2. Medir los espectros de emisión de la fluoresceína (exc 488 nm) y TMR (exc 550 nm) y optimizar la configuración ópticas del fluorímetro para lograr una buena relación señal-ruido.
3. Realizar una valoración del pH mediante la adición de pequeñas cantidades de NaOH 0,1 N y HCl 0,1 N. Después de cada adición agitar la cubetapara mezclar, esperar 1 min para el equilibrio y medir el pH por medio de un microelectrodo de pH. Espectros de emisión de la fluoresceína y TMR debe registrarse para cada paso sin ningún cambio en la configuración óptica.
4. Trazar la intensidad de fluorescencia vs pH para la titulación. La señal de rodamina no debería verse afectada por el pH (<10%). La señal de fluoresceína debe ser una curva sigmoidal y debe ser equipado con un modelo de una sola unión con pK = 6,4.

3. Cultivo celular y electroporación

1. Cultivar las células HeLa en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina (Invitrogen). Mantener el cultivo de células a 37 ° C en el 5% de CO ₂ humidificado atmósfera.
2. Para la electroporación dendrímero, cuando las células son confluentes, extraiga el soporte y lavar las células mediante DPBS (fosfato de Dulbecco-Buffered Saline). Retire el DPBS y añadir tripsina-EDTA. Neutralizar el tryppecar mediante la adición de un medio que contiene suero, pero no antibióticos. Centrifugar a 900-1.200 rpm durante 2 min a temperatura ambiente. Retire el papel y enjuague el pellet con DPBS.
3. Contar las células y tomar 4 * 10 ⁶ células. Centrifugar a 1.200-1.500 rpm durante 2 min a temperatura ambiente.
4. Resuspender el sedimento de células en 200 l de tampón de microporos (proporcionado por el fabricante microporator) y transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
5. Añadir solución acuosa dendrímero en células resuspendidas. La cantidad de dendrímero requerido por muestra es dependiente del tipo PAMAM (típicamente 250 nM para catiónico y 2 M durante dendrímeros neutros).
6. Añadir tampón de electroporación (proporcionado por el fabricante microporator) en un tubo de microporos. Pipetear las células y los dendrímeros mezclas con punta de electroporación de 100 l de volumen de tamaño. Inserte la pipeta microporator en la estación de la pipeta. Establecer la condición de impulsos para microporación: tensión de impulso = 1005 V; wid pulsoth = 35 ms, el número de pulsos = 2.
7. Después de que las células de transferencia de impulsos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar las células durante 5 min a 1200 rpm para eliminar el exceso de dendrímero en el medio. Placa de 10 l de células sometidas a electroporación en 35 mm platos con fondo de cristal (Willco plato GWSt-3522) con un nuevo medio w / o antibióticos.

4. Detección de pH en las células vivas HeLa

1. Celdas de imagen con un microscopio confocal de 12 horas después de la electroporación.
2. Conjunto de filtros estándar de fluoresceína y rodamina se puede utilizar. Si los filtros sintonizables están disponibles un conjunto de canal verde 500-550 nm y un canal rojo de 580 nm a 650 nm. La excitación a 488 nm es óptimo para la fluoresceína mientras rodamina podría ser reflejado ya sea con el 543nm o la línea de láser 561.
3. Enfoque la muestra y ajustar la energía láseres y detectores de ganar para maximizar la relación señal-ruido. Si la electroporación fue el de células exitosos deben ser fluorescentes brillantes en ambos canales. Lala localización depende del tamaño y la carga del dendrímero utilizado. A menudo, algunos de localización lisosomal (pequeñas vesículas perinuclear) está presente debido a la endocitosis o la compartimentación. Si la localización lisosomal es predominante, es decir, la mayor parte de la fluorescencia se localiza en el interior de las vesículas y se observa mala señal en el citosol, esto significa la toxicidad y la medición deben ser desechados. Adquirir secuencialmente los dos canales, si es necesario adquieren varias imágenes y un promedio de las imágenes para mejorar la calidad de la imagen.
4. Para abrazadera de calibración de pH celular utilizando tampones con ionóforos a diferentes pH y adquirir al menos 20 células por pH como se describe anteriormente. Para una descripción detallada del procedimiento y la composición de los tampones consulte Bizzarri y compañeros de trabajo. ¹⁶ Sugerimos para medir al menos 5 puntos de pH = 5,5 a pH = 7,5. pH inferior a 6 son tóxicos para las células, pero tolerada por poco tiempo, le sugerimos adquirir las imágenes lo más rápido posible. Si las célulasdemostrar signos de apoptosis, desechar las células y se reinicie.
5. Utilice ImageJ o software similar para el análisis de datos. Importe las imágenes del canal verde y rojo, restar fondo y crear un pixel por pixel ratio de la imagen con la herramienta "Calculadora de la imagen".
6. Dibujar una región de interés (ROI) seleccionar la celda deseada y medir la proporción de verde a rojo intracelular. Analizar todas las imágenes obtenidas y luego trazar la relación frente al pH. En el rango de 5,5 a 7,5 la tendencia debe ser lineal. El ajuste lineal de los puntos obtenidos dará la curva de calibración que se utiliza para convertir la relación de verde a rojo a pH.
7. Como un control adicional adquirir varias células no tratadas (no ionóforos) y tratar de calcular el pH con la curva de calibración obtenida. Se debe obtener un valor de entre 7,2 y 7,4.

5. In Vivo Preparación de la muestra

1. Los experimentos se realizaron en C57Bl/6J (hombres y mujeres) entre postnatal day 28 y 70. Anestesiado el ratón con una inyección intraperitoneal de uretano (es decir, carbamato de etilo) (20% w / v en solución salina fisiológica, 20 mg / kg de uretano). Los animales fueron sacrificados después de experimentar con una sobredosis de uretano seguido de una inyección intracardiaca de la misma anestesia.
2. Realice una inyección intramuscular de dexametasona fosfato de sodio (2 mg / kg de peso corporal) para reducir la respuesta al estrés cortical y el edema cerebral durante la cirugía.
3. Afeitarse la cabeza del animal y aplicar 2,5% en gel de lidocaína al cuero cabelludo.
4. Utilice unas tijeras para cortar el colgajo de piel que cubre el cráneo de ambos hemisferios
5. Lave el hueso expuesto con solución salina y retire suavemente el periostio utilizando fórceps. Esto proporcionará una mejor base para el pegamento y el cemento dental que se adhieran con.
6. Aplique un poste de acero de cabeza a medida con una cámara de imágenes central y pegarlo con cianoacrilato en un plano aproximadamente paralelo al cráneo sobre la región cortical del il interés y fijar en su lugar con cemento dental blanca (Paladur).
7. Fijar la cabeza del ratón con el fin de realizar una craneotomía de 2-3 mm de diámetro perforado más de la región de interés.
8. Trate de minimizar el calentamiento de la corteza durante la cirugía, desgarros durales o sangrado.
9. Mantenga la corteza superfused con ACSF estéril (NaCl 126 mM, 3 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,3 mM MgSO _4, 26 mM NaHCO _3, 2,4 mM CaCl _2, glucosa 15 mM, 1,2 mM HEPES en H ₂ O destilada , pH = 7,4).

6. imágenes pH en cerebro de ratón

1. Durante la respiración animal ayuda experimento proporcionar O aire _{enriquecido-2.} El oxígeno es enriquecido hasta el 80%. Presión parcial de _O2 y el flujo se ajusta con frecuencia para obtener una ayuda a la respiración adecuada. Mantener la temperatura constante del cuerpo a 37 ° C con una manta de calefacción realimentación controlada.
2. Fijar el animal a través del poste de acero bajo el objetivo de una foto de dosconfiguración n de imagen.
3. Con el fin de inyectar el sensor en la corteza cerebral cargar una pipeta de vidrio que contiene un electrodo AgCl (diámetro de la punta de 4 mm) con la solución de dendrímero (1 M). El electrodo permitirá grabar los potenciales de campo extracelulares.
4. Con una configuración de microinyección insertar la pipeta en la corteza a unos 150 m de profundidad. Inyectar durante 1-2 min a una presión de 0,5 psi.
5. Optimizar la configuración óptica para obtener imágenes. Potencia del láser debe ser ajustado para minimizar fotoblanqueo y fotodaño. Típicamente la potencia del láser empleado es de alrededor de 20 mW y la ganancia de PMT se mantuvo constante a 667 V ya calibraciones anteriores mostraron que esta tensión ofrece la mejor relación S / N.
6. Para imágenes excitar el sensor a 820 nm y detectar simultáneamente fluoresceína y rodamina a través de filtros de fluorescencia FITC y TRITC estándar.
7. Para el tiempo de las mediciones resueltas adquieren serie lapso de tiempo a 2 Hz.
8. Para la corrección de fondo adquiere un marco oscuro con la laser obturador cerrado para medir el ruido térmico promedio que surge en los PMT y el pedestal normalmente añadidos por el sistema electrónico.
9. Para el análisis de los datos siga el mismo procedimiento indicado en el apartado 4.

Resultados

La figura 1 muestra una representación esquemática de la conjugación de detección de colorantes a diferentes andamios dendríticas. Los indicadores resultantes se pueden obtener en una etapa sintética fácil a partir de productos disponibles comercialmente. -Dendrímeros que llevan amina se hacen reaccionar con colorantes activada con NHS en DMSO y se purificaron por diálisis. Este procedimiento general ha sido ya utilizado con éxito para el etiquetado de varios dendrímeros: i) generación del d...

Discusión

Los pasos críticos para formación de imágenes de pH éxito con sensores basados ​​en dendrímeros son: i) la selección del andamio dendríticas correcta y el número de indicadores conjugados a la misma y ii) la optimización de protocolo de entrega sensor en células o in vivo.

El procedimiento de síntesis es bastante fácil y se puede aplicar prácticamente a cada polímero hiperramificado amina-cojinete. Los sensores se pueden obtener de dendrímeros disponibles comercia...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500