Sentez, Hücresel Teslimat ve<em&gt; In vivo</em&gt; Dendrimer tabanlı pH Sensörlerin Uygulamaları

Özet

Floresan sensörler yaşam bilimleri güçlü araçlardır. Burada sentez ve canlı hücreler içerisinde ve in vivo olarak pH ölçmek için dendrimer bazlı flöresanlı sensörleri kullanmak için bir yöntem tarif eder. Dendritik iskele gelişmiş algılama özelliklere yol açmaktadır konjuge floresan boyaların sağlayıcı özelliklerini de arttırır.

Özet

Floresan göstergelerin geliştirme yaşam bilimleri için bir devrim niteliğindeydi. Genetik olarak kodlanmış ve algılama yetenekleri ile sentetik flüoroforlar yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip biyolojik ilgili türlerin görselleştirme izin verdi. Sentetik boyalar yüksek Ayarlanabilirliğin ve ölçülebilir Analitlerin geniş özellikle faiz sayesinde vardır. Ancak, bu moleküller (zayıf çözünürlük, hedefleme zorluklar, genellikle hiçbir rasyometrik görüntüleme izin) küçük molekül davranışı ile ilgili çeşitli sınırlamalar muzdarip. Bu çalışmada, biz dendrimer bazlı sensörler gelişimini tanıtmak ve canlı hücreler ve in vivo, in vitro olarak pH ölçümü için bir yöntem sunulmaktadır. Biz onları birkaç biyomedikal cihazlar için yaygın olarak kullanılan iskele yaptıkları çok arzu edilen özellikleri (monodispersiteye, ayarlanabilir özellikleri, çok değerlilik) için bizim sensörler için ideal bir platform olarak dendrimerlerinde seçin. Floresan pH konjugasyondendrimer iskele için göstergeler kendi algılama performansları bir donanıma yol açtı. Özellikle dedrimerler sergi hücre kaçağı, gelişmiş hücre içi hedefleme ve rasyometrik ölçümlerine izin azalır. Bu yeni sensörler başarılı bir HeLa canlı hücreler ve fare beyninde in vivo olarak pH ölçmek için kullanılmıştır.

Giriş

Belirli biyolojik ilgili molekülleri etiketlemek için floresan moleküllerin kullanımı tamamen biz biyolojik sistemlerin çalışma şeklini değiştirdi. Widefield ve günümüzde gerçek zamanlı yüksek çözünürlüklü biyolojik süreçlerin görselleştirme ve izin konfokal mikroskopi hücrelerinde in vivo ve in vitro biyolojik olayları incelemek için en popüler teknikleri arasında yer almaktadır. ¹ A İlgili iyileştirme floresan göstergelerin geliştirilmesi tarafından temsil edildi , olan floresan belirli bir moleküler varlığın konsantrasyonuna bağlıdır, yani boyalar. Özellikle pH ve kalsiyum göstergeleri nedeniyle H ⁺ ve Ca biyoloji ^{2 +} iyonları büyük alaka hücre fizyolojisinin çalışmanın üzerinde dramatik bir etkisi vardı. ^2,3

Hücre içi targeti i) zorlukları: Bununla birlikte, bu algılama boyaların çoğu birkaç iç sınırlamaları gibi, küçük molekül davranışa ilişkinng; su ve dolayısıyla fakir biyouyumluluktaki ii) kötü çözünürlüğü;. ve iii) hücre kaçak ve uzun zaman atlamalı görüntüleme yeteneği ⁴ böylece eksikliği Ayrıca, birçok prob sinyal boya konsantrasyonuna bağımlılığı için düzeltilmiş olamaz (non- rasyometrik görüntüleme) ve bu yüzden, hücreler ya da in vivo mutlak ölçüm mümkün değildir.

Yakın zamanda bir dendrimer iskele üzerinde algılama boyaların konjugasyonu göre, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için, basit ve etkili bir yöntem tarif. Dendrimerler ⁵ biyolojik uygulamalar için çok çekici özellikleri olan tek dağılımlı aşırı dallı polimerlerdir. Özellikle ⁶ birkaç dendritik yapılanma da gelişmekte ve kullanılmış olan İlacın ⁷ ve gen teslimat için. ⁸ Sadece çok yakın birkaç grup algılama cihazları için iskele olarak bu moleküllerin potansiyelini keşfetmeye başladım. ^9,10,11

Daha önceNHS-aktive edilmiş esterler ile ilgili olarak farklı poliamidoamin fonksiyonelleştirilmesi karşı kolay sentetik yol (tein) iskeleler tarif. ¹² konjugatları, sadece saflaştırma gibi diyaliz vasıtasıyla tek bir aşamada elde edilebilir. İlginç bir şekilde bu yaklaşım kolayca dendritik ya da polimerik iskelelerinin çeşitli uygulanabilir. ^13,14

I) bir pH göstergesi (örneğin fluoresein) ve ii) bir pH-bağımsız bir floresan parçası (örneğin rodamin): rasyometrik dendrimerlerinden görüntüleme elde etmek için, çift etiketli boyaların iki grup idi. Bu bizi flöresin ve rodamin arasındaki oran pH değerine sadece bağlıdır ve daha fazla prob konsantrasyonuna kadar doğru pH görüntüleme gerçekleştirmek için izin verdi. Ömür boyu bu ölçümler bir rasyometrik düzeltme gerekmez prob konsantrasyonuna bağlı değildir gibi bu konuya bir başka ilginç yaklaşım, yaşam boyu-temelli probların kullanımı. ^15. tarafından temsil edilmektedir. Bununla birlikte, lifetime ölçümleri daha karmaşık bir enstrümantal kurulum gerektirmeyen ve zamansal çözünürlük böylece bunların potansiyel uygulamalarını sınırlayıcı, hızlı fizyolojik süreçler için alt uygunudur.

Hücre içi görüntüleme gerçekleştirmek için, sonda sitozolüne plazma zarından teslim edilmesi gerekmektedir. Dendrimerler nedeniyle boyut ve hidrofiliklik için geçirgen zar değildir gibi, hücre içi dağıtım elektroporasyon yoluyla elde edilebilir. Yaygın olarak transfeksiyon için biyolojide kullanılan bu tekniğin, vasıtasıyla, işaretlenmiş makro moleküller etkili bir yüksek kaliteli görüntüleme gerçekleştirmek için hücre içine teslim edilebilir. Makromoleküller direkt olarak sitoplazmaya gönderilir Dahası, elektroporasyon ile dendrimer endositoz ile ilişkili komplikasyonlar önlenebilir. Elektroporasyon farklı dendrimerler da herhangi bir hedef dizinin yokluğunda hücre içinde ayrı lokalizasyonu gösterir İlginç sonra. ^5. Bu pasife nedeniyle sadece dendrimere fizikokimyasal özellikleri, hedef organel-spesifik pH görüntüleme elde etmek için istismar edilebilir.

Oranlı metrik görüntüleme konfokal mikroskopi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Kovalent olarak dendritik iskele konjüge floresan ve rodamin, ayrı ayrı görüntülendi ve bir piksel-piksel oranı harita oluşturuldu. Ionofor vasıtasıyla canlı hücrelerde hücre içi pH değerini kontrol etmek için çeşitli prosedürler bildirilmiştir. İyonoforlar plazma zarından iyonları taşıma mümkün küçük hidrofobik moleküller olan, H ⁺ iyonu için iyonoforlar, örneğin nigerisin gibi, kullanılabilir ve dendrimer bazlı sensörler kalibre etmek için kullanılabilen ¹⁶ Bu ölçümler görülmektedir ne benzer pH'ye doğrusal bir tepki tespit edildi. in vitro. Kalibrasyon hücre içi pH'ın temelinde doğru olarak ölçülebilir. Bu ölçümler dendrimer-tabanlı sensör çalışma H ⁺ Homeost değerli bir araç olabilir göstermiştirasis canlı hücreler ve patolojik süreçlerde pH düzenleme arızaları içerdiğini.

Son zamanlarda dendrimer bazlı pH sensörler de anestezi uygulanmış farelerin beyninde pH görüntüleme yapmak, in vivo olarak uygulanabilir olduğunu göstermiştir. ¹⁷ nedeniyle in vivo algılamada yüksek kaliteli bir teknik olarak zor olduğu canlı dokuların karmaşık çevreye. Burada beyinde doğru bir pH görüntüleme gerçekleştirmek için ele alınması gereken önemli konulardan vurgu ile in vivo pH görüntüleme için deneysel işlemin ayrıntılı bir açıklamasını gösterir. İki-foton mikroskopi iki ana nedenden dolayı istihdam edilmiştir: i) kızılötesi ışık kullanımı standart konfokal mikroskopi doku penetrasyon eksikliği aşmak için izin verir; ii) floresein ve rodaminin geniş iki-foton soğurma onların eşzamanlı uyarma kaçınarak izin uyarım dalga boyu için iki kullanımına ilişkin komplikasyonlar. fare beyninde pH ölçümleri edildibaşarıyla yürütülen, sensörler kolayca beyin hücre dışı boşlukta pH değişimine neden hipoksi yanıt. Bu ölçümler, dendrimer tabanlı göstergeleri başarılı bir hayvan modelinde in vivo olarak pH fizyolojik ve patolojik değişiklik vurgulamak için kullanılabileceğini göstermektedir.

Protokol

1.. Sensörler sentezi

1. Aşağıdaki bölümde tein Dendrimerlerde pH göstergelerin bağlanması için bir prosedür sağlamaktadır. Aynı protokol, alternatif amin taşıyan dendrimerler minimum değişiklik ile de uygulanabilir. ^5,17,13,14 Ticari olarak mevcut dendrimerler ve boyalar ayrıca saflaştırma olmadan kullanılabilir.
2. Susuz DMSO (50 uM nihai konsantrasyon) 'de dendrimer çözülür. Susuz DMSO floresein-NHS ve tetra-rodamin-NHS (TMR) içinde 10mM stok çözümleri hazırlayın.
3. Dendrimer çözeltiye floresein ve TMR istenilen miktarda ekleyin. Karışım içinde molar oranı dendrimer yüklenen boya miktarını yansıtır. Tipik haliyle, bir mikrosantrifüj tüpü içinde G4 tein dendrimer çözeltisi 1 ml fluoresein 8, denklem (40 ul) ve TMR 8, denklem (40 ul) ile reaksiyona sokulur. 12 saat boyunca oda sıcaklığında çözelti karıştırılır.
4. Iyonu giderilmiş su ile 1:10 seyreltin ve reaksiyon yükbir diyaliz torbası (MWCO = 10 kDa) içinde karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Rezervuardaki su sık sık değiştirme ve iyonu giderilmiş suya karşı 24 saat boyunca Dialyze.
5. Bir şişeye aktarın ve çözelti dondurularak kuru 24 saat karıştırıldı. Mor bir toz elde edilmelidir. Ağırlık katı madde elde edilir ve 10 uM bir nihai konsantrasyonda MiliQ suyu içinde çözülür. -20 ° C'de çözelti ve mağaza alikotu

2.. In Vitro pH Ölçümleri

1. In vitro kalibrasyon için bir kuartz küvet içinde, PBS içinde dendrimer bir çözelti, 500 nm (2 mM fosfat) hazırlar. Titrasyon sırasında pH ani değişikliklerin önüne geçmek için bir çok seyreltik PBS tamponu (2 mM) kullanılması tavsiye edilmektedir.
2. Floresan emisyon spektrumunu (exc 488 nm) ve TMR (exc 550 nm) ölçülür ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için fluorimetre optik ayarlarını optimize eder.
3. Her ilave küvetini sallamak sonra NaOH 0.1 N HCI ve 0.1 N. küçük hacimli ekleyerek pH titrasyonu gerçekleştirinKarıştırma için, dengeleme için 1 dakika bekleyin ve bir pH mikroelektrot vasıtasıyla pH'ı ölçün. Floresein ve TMR emisyon spektrumları optik ayarlarında herhangi bir değişiklik olmaksızın, her adım için kayıt edilmelidir.
4. Titrasyon için pH vs floresan çizilir. Rodamin sinyal pH (<% 10) etkilenmez olmalıdır. Floresein sinyali bir sigmoidal eğri olmalı ve pK = 6.4 olan bir tek bağlama modeli ile donatılmış olmalıdır.

3. Hücre Kültürü ve Elektroporasyon

1. % 10 fetal sığır serumu ve 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin (Invitrogen) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) içinde HeLa hücrelerini yetiştirmek. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° C'de hücre kültürü tutun.
2. Dendrimer elektroporasyon için, hücreler birleştirilebilmeli zaman, medya kaldırmak ve DPBS (Dulbecco Fosfat tamponlu salin) kullanarak hücreleri yıkayın. DPBS çıkarın ve tripsin-EDTA ekleyin. Tryp Neutralizeortamı içeren serum, fakat antibiyotik ekleyerek sin. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 900-1,200 rpm'de santrifüj. Ortamı çıkarın ve DPBS kullanarak pelet durulayın.
3. Hücrelerin sayısı ve 4 * 10 ⁶ hücreleri almak. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1,200-1,500 rpm'de santrifüj.
4. (Microporator üretici tarafından sağlanan) mikro-gözeneklendirme tampon 200 ul hücre pelletini ve bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne hücreleri aktarın.
5. Yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücrelere dendrimer sulu bir solüsyonu eklenir. Örnek başına gerekli dendrimer miktarı tein türü (katyonik ve nötr dendrimerler 2 uM için tipik olarak 250 nM) bağlıdır.
6. Bir mikro-gözeneklendirme tüp içinde (microporator üretici tarafından sağlanan), elektroporasyon tamponu ekleyin. 100 ul hacim ölçekli elektroporasyon ucu ile hücreleri ve dedrimerler karışımları Pipet. Pipet istasyonuna microporator pipet takın. Mikrogözeneklendirmesinin için nabız koşulunu ayarlayın: darbe gerilimi = 1.005 V; darbe width 35 msn =; nabız sayısı = 2.
7. 1200 rpm'de 5 dakika boyunca bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj hücrelere sinyal aktarım hücreler ortam içinde dendrimer fazlalığını uzaklaştırmak için. Taze ortam ile plakası 35 mm cam alt yemekler üzerine Electroporated hücrelerin 10 ul (WillCo-çanak GWSt-3522) w / antibiyotik o.

4. Yaşam HeLa Hücreleri pH Algılama

1. Elektroporasyondan sonra, bir eş odaklı mikroskop 12 saat ile görüntü hücreleri.
2. Floresein ve rodaminin için standart filtre seti kullanılabilir. 550 nm ve 580 nm 650 nm kırmızı kanal - ayarlanabilir filtreler 500 yeşil bir kanal mevcuttur kümesi varsa. Rhodamine ya 543nm veya 561 lazer hattı ile görüntülü olabilir iken 488nm uyarma flöresin için en uygunudur.
3. Numune odaklanın ve lazerler gücü ayarlamak ve dedektörler sinyal-gürültü oranını maksimize etmek kazanmak. Elektroporasyon ise başarılı hücreler iki kanal pırıl floresan olmalıdır.Lokalizasyon kullanılan dendrimer büyüklüğüne ve şarj bağlıdır. Genellikle bazı lizozomal yerelleştirme (küçük perinükleer kesecikleri) nedeniyle endositoz veya bölümlendirme için mevcuttur. Lizozomal yerelleştirme baskın ise, örneğin, floresan çoğu kesecikler içine lokalize edilir ve zayıf sinyal sitosol görülmektedir, bu anlamına toksisite ve ölçüm atılmalıdır. Acquire birkaç görüntü gerekirse, sırayla iki kanal Edinme ve görüntü kalitesini artırmak için görüntüleri ortalama.
4. Kalibrasyon kelepçe hücre pH farklı pH ionofor ile tamponlar kullanılarak ve yukarıda tarif edildiği gibi, pH başına en az 20 hücreleri elde etmek için. Prosedürün ayrıntılı bir açıklama ve tamponların bileşimi için Bizzarri ve arkadaşları, bakınız. ¹⁶ Biz, pH = 5.5 'den pH = 7.5' e, en az 5 puan ölçmek için göstermektedir. 6'nın altında pH hücreleri için toksik ama zaman kısa süre için tolere, biz mümkün olduğunca çabuk görüntüler elde etmek öneririz. Eğer hücrelerapoptoz belirtileri göstermek, hücreleri atmak ve yeniden başlatın.
5. ImageJ veya veri analizi için benzer yazılımı kullanın. Yeşil ve kırmızı kanalının görüntüleri içe, arka plan çıkarma ve aracı "Resim hesap makinesi" ile piksel oranı görüntüleme ile bir pikseli oluşturmak.
6. Istenen hücreyi seçerek ilgi alanları (ROI) bir bölge çizin ve hücre içi yeşil-to-kırmızı oranını ölçmek. Elde edilen tüm görüntüleri analiz ve pH'ya oranını arsa. 5,5-7,5 aralığında eğilim doğrusal olmalıdır. , Elde edilen noktaların doğrusal uygun pH yeşil-to-red oranını dönüştürmek için kullanılacak kalibrasyon eğrisi verecektir.
7. Daha fazla kontrolü gibi çeşitli tedavi edilmezse hücreleri (yok iyonoforlar) kazanmak ve elde edilen kalibrasyon eğrisi ile pH hesaplamak için deneyin. 7.2 ve 7.4 arasında bir değer elde edilmelidir.

5. In Vivo Numune Hazırlama

1. Deneyler sonrası d arasında C57Bl/6J (erkek ve kadın) üzerinde yapıldıBugün 28 ve 70. Üretan bir intraperitoneal enjeksiyon (örneğin, etil karbamat) (% 20 serum fizyolojik içinde w / v, 20 mg / kg üretan) ile fare anestezi uygulandı. Hayvanlar aynı anestezik bir kalp içi enjeksiyonu takiben üretan aşırı dozda deney sonra kurban edilmiştir.
2. Ameliyat sırasında kortikal stres tepkisi ve beyin ödemi azaltmak için, deksametazon sodyum fosfat (2 mg / kg vücut ağırlığı) bir kas içi enjeksiyon yapın.
3. Hayvanın başını tıraş ve saç derisine% 2.5 lidokain jel uygulayın.
4. Her iki yarımkürede kafatasını kaplayan deri kapak kesmek için makas kullanın
5. Tuzlu su ile maruz kemik yıkayın ve yavaşça forseps kullanarak periost çıkarın. Bu tutkal ile bağlı diş çimento için iyi bir temel sağlayacaktır.
6. Merkezi bir görüntüleme odası ile bir ısmarlama çelik kafa yazıyı uygulayın ve bir düzlemde siyanoakrilatın ile tutkal yaklaşık i kortikal bölge üzerinde kafatası ile paralelnterest ve beyaz diş çimento (Paladur) ile yerine sabitleyin.
7. Ilgili bölge boyunca delinmiş çapı 2-3 mm olan bir kranyotomi gerçekleştirmek için fare baş düzeltildi.
8. Cerrahi, dural gözyaşı, ya da kanama sırasında korteksin ısınmasını en aza indirmek için deneyin.
9. Steril ACSF (126 mM NaCI, 3 mM KCI, 1.2 mM KH ₂ PO _4, 1.3 mM MgSO _4, 26 mM NaHCO _3, 2.4 mM _CaCl2 ile süperfüze korteks Ol, 15 mM glükoz, 1.2 mM HEPES damıtık H ₂ O , pH = 7.4).

6. Fare Beyin pH görüntüleme

1. O _{2-zenginleştirilmiş} hava sağlayan deneme yardım hayvan solunum sırasında. Oksijen% 80 kadar zenginleştirilir. O ₂ kısmi basıncı ve akış sık sık uygun bir solunum cihazı elde etmek üzere ayarlanır. Bir geri besleme kontrollü bir ısıtma battaniyesi ile 37 ° C 'de vücut sıcaklığı sabit tutmak.
2. Iki fotoğrafın hedefi altında çelik posta yoluyla hayvan Fixn görüntüleme kurulumu.
3. Beyin korteksinde sensörü enjekte amacıyla dendrimer çözeltisi (1 uM) ile bir AgCl elektrodu (uç çapı 4 mm) ihtiva eden bir cam pipet yükleyin. Elektrot dışı potansiyellerini kaydetmek için izin verecek.
4. Bir mikroenjeksiyon kurulum ile yaklaşık 150 um derinliğinde korteksteki pipet yerleştirin. 0.5 psi'lik bir basınçta, 1-2 dakika boyunca enjekte edilir.
5. Görüntüleme için optik kurulum optimize. Lazer güç photobleaching ve fotohasar en aza indirmek için ayarlanabilir olmalıdır. Istihdam Genellikle lazer güç önceki kalibrasyonları bu gerilim en iyi S / N oranı verdiğini göstermiştir beri mW ve PMT kazanç 667 V sabit tutulmuştur 20 civarında.
6. Görüntüleme için 820 nm 'de sensör heyecan ve standart FITC ve TRITC filtreler aracılığıyla flüoresein ve rodamin floresan aynı anda tespit eder.
7. Süre çözüme ölçümler 2 Hz time lapse serisi elde.
8. Arka plan düzeltme Lase ile karanlık bir çerçeve elde içinr deklanşör genellikle elektronik tarafından eklenen PMT ve kaide doğan ortalama termal gürültüyü ölçmek için kapalı.
9. Veri analizi için bölüm 4 bildirilen aynı prosedürü uygulayın.

Sonuçlar

Şekil 1, farklı dendritik iskeleleri için boyalar algılama bağlanmasının şematik bir temsilini göstermektedir. Elde edilen göstergeler ticari olarak temin edilebilen ürünlerden kolay bir sentetik adımda elde edilebilir. Amin taşıyan dendrimerler DMSO içinde NHS-aktif boyalar ile reaksiyona sokulmuş ve diyaliz ile saflaştırılır. Bu genel prosedür başarıyla çeşitli dendrimerler etiketlenmesi için kullanılmıştır: i) tein dendrimer kuşak 2, 4 ve 6, ¹² pegile tein d...

Tartışmalar

Dendrimer bazlı sensörler ile başarılı bir pH görüntüleme için kritik adımlar şunlardır: i) doğru dendritik skafoldun seçimi ve buna konjüge edilmiş göstergelerin sayısı ve hücrelerinde ya da in vivo olarak teslim sensor protokol ii) optimizasyonu.

Sentetik prosedür oldukça kolay olan ve her amin taşıyan aşırı dallı polimer hemen hemen uygulanabilir. Sensörler, tek bir aşamada ticari olarak temin edilebilir, dendrimerler ve NHS-aktif boyalar el...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500