Synthesis, Cellular Lieferung und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Anwendung der Dendrimer-basierten pH-Sensoren

Zusammenfassung

Fluoreszenz-Sensoren sind mächtige Werkzeuge in Life Science. Hier beschreiben wir eine Methode zu synthetisieren und zu verwenden Dendrimerbasis Fluoreszenzsensoren auf pH in lebenden Zellen und in vivo zu messen. Die dendritische Gerüst verbessert die Eigenschaften von konjugierten Fluoreszenzfarbstoffe, die zu verbesserten Sensoreigenschaften.

Zusammenfassung

Die Entwicklung von Fluoreszenzindikatoren eine Revolution für die Lebenswissenschaften. Genetisch kodierte und synthetische Fluorophore mit Sensor Fähigkeiten erlaubt die Visualisierung von biologisch relevanten Spezies mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Synthetische Farbstoffe sind von besonderem Interesse, dank ihrer hohen Abstimmbarkeit und das breite Spektrum der messbaren Analyten. Allerdings sind diese Moleküle leiden mehrere Einschränkungen auf kleine Molekül Verhalten bezogen (schlechte Löslichkeit, Schwierigkeiten bei der Targeting, oft nicht ratiometrische Bildgebung erlaubt). In dieser Arbeit wird die Entwicklung der Dendrimer-basierten Sensoren führen wir und stellen ein Verfahren für die pH-Messung in vitro, in lebenden Zellen und in vivo. Wir wählen Dendrimere als ideale Plattform für unsere Sensoren für ihre viele wünschenswerte Eigenschaften (Monodispersität, einstellbaren Eigenschaften, Multivalenz), die ihnen eine weit verbreitete Gerüst für verschiedene biomedizinische Geräte gemacht. Die Konjugation von fluoreszierenden pH-WertIndikatoren für die Dendrimer-Gerüst führte zu einer Verbesserung ihrer Leistungen Erfassungs. Insbesondere Dendrimere eine verminderte Zell Leckage, verbesserte intrazelluläre Targeting und erlauben ratiometrische Messungen. Diese neuartigen Sensoren wurden erfolgreich eingesetzt, um pH-Wert in lebenden HeLa-Zellen und in vivo im Gehirn der Maus zu messen.

Einleitung

Die Verwendung von fluoreszierenden Molekülen zu bestimmten biologisch relevanten Molekülen Etikett vollständig, wie biologische Systeme untersuchen wir verändert. Widefield und konfokale Mikroskopie für eine Echtzeit hochauflösende Visualisierung biologischer Prozesse und heute erlaubt zählen zu den beliebtesten Techniken der biologischen Ereignisse in vitro, in Zellen und in vivo zu untersuchen. ¹ Eine relevante Verbesserung wurde durch die Entwicklung von Fluoreszenzindikatoren dargestellt , dh Farbstoffe, deren Fluoreszenz ist abhängig von der Konzentration eines spezifischen molekularen Einheit. pH-und Calcium-Indikatoren insbesondere hatte einen dramatischen Einfluss auf die Untersuchung der Zellphysiologie aufgrund der enormen Bedeutung von H ⁺ und Ca ^{2 +-Ionen} in der Biologie. ^2,3

I) Schwierigkeiten bei der subzellulären targeti: Allerdings sind die meisten der anwesenden Erkundung mehrere Farbstoffe immanente Grenzen ihrer kleinen Molekül Verhalten wie im Zusammenhangng, ii) schlechte Löslichkeit in Wasser und damit schlechte Biokompatibilität;. iii) Zell Leckage und damit der Mangel an lang Zeitraffer-Bildgebung Fähigkeit ⁴ Darüber hinaus wird das Signal von vielen Sonden kann nicht für die Abhängigkeit von der Farbstoffkonzentration korrigiert werden (nicht ratiometrische Bildgebung), und daher ist keine absolute Messung in Zellen oder in vivo möglich.

Wir haben kürzlich eine einfache und effektive Methode, um diese Einschränkungen zu überwinden, bezogen auf die Konjugation von Sensor Farbstoffe auf einem Dendrimer-Gerüst. ⁵ monodispersen Dendrimere sind hochverzweigte Polymere mit sehr ansprechenden Eigenschaften für biologische Anwendungen. ⁶ Insbesondere mehreren dendritischen Architekturen entwickelt und verwendet Drogen ⁷ und Gen-Lieferung. ⁸ Erst in jüngster Zeit einige Gruppen begonnen, das Potenzial der Moleküle als Gerüst für die Erfassungsvorrichtungen zu erforschen. ^9,10,11

Wir haben vorherbeschrieben, einen einfachen Syntheseweg zur Funktionalisierung von verschiedenen Polyamidoamin (PAMAM)-Gerüst basierend auf NHS-Aktivester. ¹² Konjugate können in einem einzigen Schritt durch Dialyse als nur Reinigung erhalten werden. Interessanter dieser Ansatz leicht zu einer Vielzahl von dendritischen oder polymere Gerüste angewendet werden. ^13,14

Um ratiometrische Bildgebung Dendrimere zu erreichen waren doppelt markierte mit zwei Sätzen von Farbstoffe: i) ein pH-Indikator (z. B. Fluorescein) und ii) eine pH-unabhängige fluoreszierende Gruppe (dh Rhodamin). Dies erlaubte uns, eine genaue pH-Bildgebung als das Verhältnis zwischen Fluorescein und Rhodamin ist nur abhängig von dem pH-Wert und nicht mehr von der Konzentration der Sonde durchzuführen. Ein weiterer interessanter Ansatz für dieses Problem wird durch die Verwendung von Lebenszeit-basierte Sonden. Vertreten ¹⁵ Da die Lebensdauer nicht von Sondenkonzentration hängen diese Messungen müssen nicht ein ratiometrisches Korrektur. Jedoch LIFetime Messungen erfordern eine kompliziertere Instrumental Setup und deren zeitliche Auflösung für schnelle physiologische Prozesse suboptimal, was ihre Einsatzmöglichkeiten einschränkt.

Um intrazelluläre Bildgebung durchzuführen, muss die Sonde durch die Plasmamembran in das Cytosol abgegeben werden. Da die Dendrimere nicht durchlässige Membran aufgrund ihrer Größe und Hydrophilie, die intrazellulären Abgabe durch Elektroporation erreicht werden. Mit Hilfe dieser Technik, die weithin in der Biologie zur Transfektion verwendet werden, können markierte Makromoleküle effektiv in Zellen geliefert hohe Bildqualität durchzuführen. Außerdem mit der Elektroporation werden die Komplikationen Dendrimer Endozytose Zusammenhang kann vermieden werden, da die Makromoleküle werden direkt in das Zytoplasma geliefert. Interessanter nach der Elektroporation verschiedenen Dendrimere zeigt deutliche Lokalisation innerhalb der Zellen auch in Abwesenheit von spezifischen Zielsequenz. ⁵ Dieses passive Targeting, nur aufgrund der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Dendrimers kann genutzt werden, um Organellen-spezifische pH-Bildgebung zu erzielen.

Ratiometrische Bildgebung können mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie werden. Fluorescein und Rhodamin, die kovalent an das dendritische Gerüst konjugiert ist, wurden separat abgebildet wird und ein Pixel-für-Pixel-Verhältnis der Karte erstellt wurde. Mehrere Verfahren zur intrazellulären pH in lebenden Zellen durch Ionophore steuern berichtet. Ionophore sind kleinen hydrophoben Molekülen, die Ionen über die Plasmamembran zu transportieren; Ionophore für H ^+-Ionen, wie Nigericin, sind verfügbar und können verwendet werden, um Dendrimer-Sensoren zu kalibrieren ^16. Diese Messungen zeigten eine lineare Reaktion auf pH-Wert ähnlich zu dem, was beobachtet. in vitro. Auf der Grundlage der Eichintrazellulären pH-Wert genau gemessen werden konnte. Diese Messungen zeigen, dass Dendrimer-basierten Sensor kann ein wertvolles Werkzeug in der Studie H ⁺ homeost seinasis in lebenden Zellen und pathologischen Prozesse, die Fehlfunktionen beinhalten pH-Regulierung.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Dendrimer-basierten pH-Sensoren können auch in vivo angewendet werden, die Durchführung pH-Bildgebung im Gehirn von betäubten Mäusen. ^17. Aufgrund der komplexen Umgebung von lebendem Gewebe eine hohe Qualität in vivo-Mess ist technisch anspruchsvoll. Hier zeigen wir eine detaillierte Beschreibung des experimentellen Verfahren zur In-vivo-Bildgebung mit Schwerpunkt pH-Wert der entscheidenden Fragestellungen im Hinblick auf eine genaue pH-Bildgebung im Gehirn durchzuführen. Zwei-Photonen-Mikroskopie hat aus zwei Gründen eingesetzt: i) die Verwendung von Infrarotlicht ermöglicht es, den Mangel an Gewebepenetration von Standard-konfokale Mikroskopie überwinden, ii) die breite Zwei-Photonen-Absorption von Fluorescein und Rhodamin zulassen, dass ihre gleichzeitige Anregung der Vermeidung Komplikationen die Verwendung von zwei Wellenlängen zur Anregung stehen. pH-Messungen in Maushirn warenerfolgreich durchgeführt; Sensoren leicht auf Hypoxie reagieren induzieren Änderung des pH-Wertes im Gehirn extrazellulären Raum. Diese Messungen zeigen, dass die Dendrimer-basierten Indikatoren können erfolgreich verwendet werden, um physiologische und pathologische Veränderung des pH in vivo in einem Tiermodell hervorzuheben.

Protokoll

1. Synthese der Sensoren

1. Im folgenden Abschnitt stellen wir ein Verfahren für die Konjugation von pH-Indikatoren, um PAMAM-Dendrimere. Das gleiche Protokoll können mit minimalen Änderungen auf alternative Lager Amin-Dendrimere angewendet werden. ^5,17,13,14 Handel erhältliche Dendrimere und Farbstoffe können ohne weitere Reinigungen verwendet werden.
2. Löse das Dendrimer in wasserfreiem DMSO (50 &mgr; M Endkonzentration). Bereiten 10 mM Stammlösungen von Fluorescein-NHS und Tetramethyl-Rhodamin-NHS (TMR) in wasserfreiem DMSO.
3. In den Dendrimer-Lösung die gewünschte Menge an Fluorescein und TMR. Das Molverhältnis in der Mischung die Menge an Farbstoffen auf dem Dendrimer geladen reflektieren. Typischerweise 1 ml G4-PAMAM-Dendrimer-Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 8 eq (40 ul) von Fluorescein und 8 eq (40 ul) des TMR umgesetzt. Man rührt die Lösung bei Raumtemperatur für 12 Stunden.
4. Verdünnen 1:10 mit VE-Wasser und laden Sie die ReaktionMischung in einem Dialysebeutel (MWCO = 10 kDa). Dialyse für 24 Stunden gegen deionisiertes Wasser häufig Ersetzen des Wassers in dem Behälter.
5. Die Lösung wird in einem Glasfläschchen und gefriertrocknen 24 Stunden. Ein lila Pulver erhalten werden sollte. Gewicht der erhaltene Feststoff zu und löse es in Milli-Q-Wasser bei einer Endkonzentration von 10 uM. Aliquot der Lösung und bei -20 ° C

2. In-vitro-pH-Messungen

1. Für die in vitro-Kalibrierung bereiten eine Lösung von Dendrimer 500 nM in PBS (2 mM Phosphat) in einer Quarzküvette. Die Verwendung einer sehr verdünnten PBS-Puffer (2 mM), um plötzliche Änderungen des pH-Wertes während der Titration zu vermeiden, wird empfohlen.
2. Messung der Emissionsspektren der Fluorescein (exc 488 nm) und TMR (exc 550 nm) und die Optimierung der optischen Einstellungen des Fluorimeters um ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erreichen.
3. Führen Sie eine pH-Titration durch Zugabe geringer Mengen von NaOH 0,1 N und 0,1 N HCl Nach jeder Zugabe schütteln Sie die Küvettezum Mischen, 1 min warten zur Äquilibrierung und Messung der pH mit Hilfe eines pH-Mikroelektrode. Emissionsspektren von Fluorescein und TMR sollte für jeden Schritt ohne irgendeine Änderung der optischen Einstellungen aufgezeichnet werden.
4. Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität vs pH-Wert für die Titration. Die Rhodamin-Signal sollte von pH-Wert (<10%) davon unberührt. Die Fluorescein-Signal sollte eine sigmoidale Kurve sein und sollte mit einer einzigen Bindungsmodell mit pK = 6.4 ausgestattet werden.

3. Zellkultur und Elektroporation

1. Kultivieren HeLa-Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin (Invitrogen) ergänzt. Halten der Zellkultur bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO ₂ Atmosphäre.
2. Für Dendrimer Elektroporation, wenn die Zellen konfluent, entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen mit DPBS (Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung). Entfernen Sie die DPBS und fügen Trypsin-EDTA. Neutralisieren Sie das TRYPsündigen, indem Medium mit Serum, jedoch keine Antibiotika. Zentrifuge bei 900-1200 Umdrehungen pro Minute für 2 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Medien und spülen Sie die Pellets mit DPBS.
3. Zählen Sie die Zellen und nehmen 4 * 10 ⁶ Zellen. Zentrifuge bei 1200-1500 rpm für 2 min bei Raumtemperatur.
4. Zellpellet in 200 ul Mikroporation Puffer (durch Mikroporator Hersteller) und übertragen Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
5. In Dendrimer wässrigen Lösung in resuspendierten Zellen. Die Menge des Dendrimer pro Probe erforderlich ist, ist abhängig von der PAMAM-Typ (typischerweise 250 nm für die kationische und 2 uM für neutrale Dendrimere).
6. In Elektroporationspuffer (von Mikroporator Hersteller) in einer Mikroporation Röhre. Pipettieren Sie die Zellen und Dendrimere Gemische mit Elektroporation Spitze von 100 ul Volumen-Größe. Legen Sie die Mikroporator Pipette in die Pipettenstation. Stellen Sie die Puls Bedingung für Mikroporation: Impulsspannung = 1,005 V; Puls width = 35 ms, Pulszahl = 2 ist.
7. Nachdem die Impulsübertragungszellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und Zellen für 5 min bei 1200 UpM um den Überschuss an Dendrimer in dem Medium zu entfernen. Die Platte 10 ul Elektroporation von Zellen auf 35 mm Glasbodenschalen (WillCo Schale GWSt-3522) mit frischem Medium w / o Antibiotika.

4. pH Sensing in Wohn HeLa-Zellen

1. Bildzellen mit einem konfokalen Mikroskop 12 h nach der Elektroporation.
2. Standard-Filtersatz für Fluorescein und Rhodamin verwendet werden. Wenn abstimmbaren Filter sind ein Satz grünen Kanal 500 bis 550 nm und eine rote Kanal von 580 nm bis 650 nm auf. Anregung bei 488 nm ist optimal für Fluorescein während Rhodamin könnte entweder mit dem 543nm oder 561 Laserlinie abgebildet werden.
3. Konzentrieren Sie sich auf die Probe und stellen Laser und Detektoren Macht zu gewinnen, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu maximieren. Wenn die Elektroporation erfolgreich war hell fluoreszierende Zellen sollten in beiden Kanälen sein. DieLokalisierung hängt von der Größe und Ladung des Dendrimer verwendet. Oft einige lysosomale Lokalisation (kleine perinukleären Vesikeln) vorhanden ist, durch Endozytose oder Abschottung. Wenn die lysosomale Lokalisierung wiegt, dh die meisten der Fluoreszenz innerhalb Vesikeln lokalisiert und schlechten Signal im Cytosol beobachtet, so bedeutet dies, Toxizität und Messung verworfen werden sollte. Erwerben Sie nacheinander die beiden Kanäle, bei Bedarf mehrere Bilder erwerben und der Mittelwert der Bilder, um die Bildqualität zu verbessern.
4. Zur Kalibrierung Klemmzelle unter Verwendung von Puffern mit pH-Ionophoren bei verschiedenen pH und erwerben mindestens 20 Zellen pro pH-Wert wie oben beschrieben. Für eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens und der Zusammensetzung der Puffer bitte Bizzarri und Mitarbeiter beziehen. ^16. Wir empfehlen, mindestens 5 Punkte von pH = 5,5 bis pH = 7,5 zu messen. pH-Wert unter 6 sind giftig für Zellen, sondern für kurze Zeit geduldet, schlagen wir vor, um die Bilder so schnell wie möglich zu erwerben. Wenn Zellenzeigen Anzeichen von Apoptose, entsorgen Sie die Zellen und neu zu starten.
5. Verwenden Sie ImageJ oder analoge Software für die Datenanalyse. Importieren Sie die Bilder von der grünen und roten Kanal, subtrahieren Hintergrund und erstellen Sie eine Pixel für Pixel Ratio Imaging mit dem Werkzeug "Bild-Taschenrechner".
6. Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) Auswahl der gewünschten Zelle und Messung der intrazellulären Grün-zu-Rot-Verhältnis. Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder zu zeichnen und dann das Verhältnis gegenüber dem pH-Wert. Im Bereich von 5,5 bis 7,5 ist der Trend linear sein. Die lineare Anpassung der erhaltenen Punkte der Eichkurve, die verwendet werden, um grün zu rot-Verhältnis auf pH-Wert konvertieren, werden zu geben.
7. Als weitere Kontrolle zu erlangen mehreren unbehandelten Zellen (keine Ionophore) und versuchen, pH-Wert mit der erhaltenen Eichkurve zu berechnen. Ein Wert zwischen 7,2 und 7,4 erhalten werden sollte.

5. In-vivo-Probenvorbereitung

1. Die Experimente wurden auf C57Bl/6J (Männer und Frauen), die zwischen der postnatalen d durchgeführtay 28 und 70. Betäubt die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Urethan (dh Ethylcarbamat) (20% w / v in physiologischer Kochsalzlösung, 20 mg / kg Urethan). Die Tiere wurden nach dem Versuch mit einer Überdosis Urethan, gefolgt von einer intrakardialen Injektion der gleichen Narkose getötet.
2. Ausführen einer intramuskulären Injektion von Dexamethason-Natriumphosphat (2 mg / kg Körpergewicht) die kortikale Stressantwort und Hirnödem während der Operation zu verringern.
3. Rasieren Sie den Kopf des Tieres und gelten 2,5% Lidocain-Gel auf die Kopfhaut.
4. Mit einer Schere, um die Klappe der Haut, die den Schädel beider Hemisphären geschnitten
5. Waschen Sie die freiliegenden Knochen mit Kochsalzlösung und entfernen Sie vorsichtig die Knochenhaut mit einer Pinzette. Dadurch wird eine bessere Basis für Klebstoff und Zahnzement mit haften.
6. Tragen Sie eine maßgeschneiderte Stahlkopf Post mit einem zentralen Bildraum und kleben Sie es mit Sekundenkleber in einer Ebene etwa parallel mit dem Schädel über den kortikalen Bereich von interest und fixieren Sie ihn mit weißen Zahnzement (Paladur).
7. Befestigen Sie den Kopf der Maus, um eine Kraniotomie von 2-3 mm Durchmesser über der Region von Interesse gebohrt durchzuführen.
8. Versuchen, die Erwärmung des Cortex während der Operation, Dura Tränen oder Blutung zu minimieren.
9. Halten die Rinde mit sterilem ACSF (126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,3 mM MgSO _4, 26 mM NaHCO _3, 2,4 mM CaCl ₂ strömt, 15 mM Glucose, 1,2 mM HEPES in destilliertem H ₂ O , pH = 7,4).

6. pH-Bildgebung in der Maus-Gehirn

1. Während des Experiments Hilfe tierischen Atmung Bereitstellen O _{2-angereicherter} Luft. Sauerstoff wird bis zu 80% angereichert. O _{2-Partialdruck} und Fluss wird häufig angepasst werden, um eine richtige Atmung Hilfe zu erhalten. Halten der Körpertemperatur konstant bei 37 ° C mit einer rückkopplungsgesteuerten Heizdecke.
2. Befestigen Sie das Tier durch den Stahlpfosten unter dem Ziel einer Zwei-Foton Bildaufbau.
3. Um den Sensor in der Hirnrinde zu injizieren laden einer Glaspipette, die ein AgCl-Elektrode (Spitzendurchmesser 4 mm) mit der Dendrimer-Lösung (1 uM). Die Elektrode wird es ermöglichen, die extrazelluläre Feldpotentiale zu erfassen.
4. Mit einer Mikroinjektion Setup legen Sie die Pipette in der Hirnrinde bei etwa 150 um Tiefe. Injizieren für 1-2 Minuten bei einem Druck von 0,5 psi.
5. Optimieren Sie den optischen Aufbau für die Bildgebung. Laserleistung sollte so eingestellt werden, Bleichen und Lichtschäden zu minimieren. Typischerweise Laserleistung eingesetzt wird, ist etwa 20 mW und PMT-Verstärkung wurde bei 667 V konstant gehalten, da Kalibrierungen ergab, dass diese Spannung gibt die beste S / N-Verhältnis.
6. Für die Bildgebung erregt den Sensor bei 820 nm und erkennen gleichzeitig Fluorescein und Rhodamin-Fluoreszenz durch FITC und TRITC Standardfilter.
7. Für zeitaufgelöste Messungen erwerben Zeitserie mit 2 Hz.
8. Für Hintergrundkorrektur erwerben einen dunklen Rahmen mit dem laser Verschluß geschlossen, um den mittleren thermischen Rauschens sich in den PMTs und dem Sockel in der Regel von der Elektronik hinzugefügt messen.
9. Für die Datenanalyse nach dem gleichen Verfahren in Abschnitt 4 angegeben.

Ergebnisse

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der Konjugation des Erfassens Farbstoffe, verschiedene dendritischen Gerüste. Die resultierenden Indikatoren können in einem einzigen Syntheseschritt aus kommerziell erhältlichen Produkten erhalten werden. Amin-tragende Dendrimere mit NHS-aktivierten Farbstoffe in DMSO umgesetzt und durch Dialyse gereinigt. Dieses allgemeine Verfahren wurde bereits erfolgreich für die Kennzeichnung von mehreren Dendrimere verwendet: i) PAMAM-Dendrimer der Generation 2, 4 u...

Diskussion

Die kritischen Schritte zur erfolgreichen pH-Bildgebung mit Dendrimer-Sensoren sind: i) die Auswahl der richtigen dendritischen Gerüsts und der Anzahl von Indikatoren, die es konjugiert ist, und ii) die Optimierung der Sensorübermittlungsprotokoll in Zellen oder in vivo.

Das synthetische Verfahren ist relativ einfach und kann praktisch zu jedem Amin-tragenden hyperverzweigten Polymeren aufgebracht werden. Die Sensoren können aus kommerziell erhältlichen Dendrimere und NHS-aktivi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500