La alimentación de las garrapatas de los animales para Transmisión y xenodiagnóstico en Lyme Investigación de Enfermedades

Resumen

La enfermedad de Lyme es la enfermedad transmitida por vectores más comúnmente reportados en América del Norte. El agente causante, Borrelia burgdorferi es una bacteria espiroqueta transmitida por garrapatas ixódidas. Transmisión y detección de la infección en modelos animales se optimiza mediante el uso de la alimentación de la señal, que se describe aquí.

Resumen

La transmisión del agente etiológico de la enfermedad de Lyme, Borrelia burgdorferi, se produce por la unión y la alimentación de la sangre de la especie Ixodes garrapatas en huéspedes mamíferos. En la naturaleza, este patógeno bacteriano zoonótico puede utilizar una variedad de reservorios, pero el ratón de patas blancas (Peromyscus leucopus) es el principal reservorio de larvas de garrapatas y de ninfas en América del Norte. Los seres humanos son huéspedes accidentales más frecuentemente infectados con B. burgdorferi por la picadura de garrapatas en la etapa de ninfa. B. burgdorferi se adapta a sus anfitriones durante todo el ciclo enzoótica, por lo que la capacidad de explorar las funciones de estas espiroquetas y sus efectos en huéspedes mamíferos requiere el uso de la alimentación de la garrapata. Además, la técnica de xenodiagnóstico (utilizando el vector natural para la detección y la recuperación de un agente infeccioso) ha sido útil en los estudios de la infección críptica. Con el fin de obtener de ninfa garrapatas que puerto B. burgdorferi,garrapatas se alimentan espiroquetas vivas en la cultura a través de tubos capilares. Dos modelos animales, ratones y primates no humanos, son los más utilizados para los estudios de la enfermedad de Lyme que involucran la alimentación de la garrapata. Demostramos los métodos por los cuales estas garrapatas pueden ser alimentados en, y se recuperaron de los animales, ya sea para una infección o xenodiagnóstico.

Introducción

En 2011, la enfermedad de Lyme es la sexta enfermedad de declaración obligatoria a nivel nacional más común en América del Norte ( http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi es un microbio versátil, tanto genética y antigénicamente (revisado en ^1). Su constitución genética incluye un grande (> 900 kB) cromosoma y hasta 21 plásmidos (12 lineales, circulares 9), con un contenido variable plásmido entre los aislados. Hay mucho que aprender acerca de esta espiroqueta, ya que más del 90% de los marcos de lectura abierta de plásmidos no están relacionados con ninguna de las secuencias bacterianas conocidas ^2,3. B. burgdorferi presenta una amplia variedad de antígenos como posibles objetivos de la inmunidad del huésped. Sin embargo, una infección no tratada a menudo persiste. La interacción de las espiroquetas con el medio de la garrapata y el medio ambiente hospedador vertebrado exige una adaptación de B. burgdorferi en todo el proceso de infección. Codificada-plásmido Varioslos genes son conocidos por ser expresadas diferencialmente en respuesta a cambios en la temperatura, el pH, la densidad celular e incluso etapa del ciclo de vida de garrapata ^4-8.

El estudio de B. adaptación burgdorferi lo largo de su ciclo de enzoótica, y las respuestas del huésped después de la infección por la ruta natural se basa en la capacidad de alimentar las garrapatas en modelos animales apropiados. Este tipo de estudios se reunieron con los retos técnicos de la generación de garrapatas que albergan B. burgdorferi, y garantizar el transporte y / o alimentación eficiente de garrapatas en el modelo de acogida. Además, la contención y la recuperación de las garrapatas infectadas es esencial. Entre los modelos utilizados son ratones y primates no humanos, cada uno de los cuales sirve como una herramienta valiosa en la investigación de la enfermedad de Lyme. Al igual que con el ratón de patas blancas, que es un huésped reservorio natural para B. burgdorferi, el ratón de laboratorio es un anfitrión muy susceptibles que apoya la infección persistente por parte B. burgdorferi ^9. FolLowing infección de ratones susceptibles de enfermedades, como la cepa C3H, las espiroquetas difunden a varios tejidos, incluyendo la piel, la vejiga, los músculos, las articulaciones y el corazón. Las respuestas inflamatorias a la infección conducen al corazón enfermo y el tejido articular. Mientras que las espiroquetas persisten en este host y siguen siendo infecciosas, lesiones inflamatorias pueden llegar a ser intermitente, no muy diferente del proceso en los seres humanos. Así pues, el modelo de ratón ha proporcionado mucha información sobre B. la patología inducida por burgdorferi, incluyendo la artritis y la carditis y respuestas inmunes del huésped ^10-12. Desde la perspectiva del patógeno, ciertos genes expresados ​​diferencialmente durante la infección de mamíferos se han caracterizado, como tener algún necesario para la transmisión a partir del vector garrapata ^13-21.

Aunque varias especies de animales se han utilizado para estudiar la enfermedad de Lyme ^22, macacos rhesus imitan más de cerca el carácter multi-órgano de la enfermedad humana ^23. A diferencia de otrosmodelos animales, la amplitud de manifestaciones de la enfermedad tales como eritema migratorio, la carditis, la artritis, la neuropatía y de los sistemas nerviosos periférico y central se observaron en macacos. En ratones, el huésped reservorio de B. burgdorferi, la enfermedad varía según la cepa de ratón y ^{los 24} años, mientras que las manifestaciones tempranas y tardías diseminada son infrecuentes ^9. Además, otros roedores, lagomorfos, y caninos todos fallan en exhibir enfermedad neurológica de B. burgdorferi infección ^25. Es importante destacar que los macacos muestran signos característicos de las tres fases de la borreliosis de Lyme, a saber,,-diseminada temprana temprana localizada, y la enfermedad de Lyme en etapa tardía ^26-28. Eritema migrans (EM) se cree que ocurre en el 70-80% de los casos en humanos ^29, y también se observaron en macacos rhesus ^28,30. Después de la infección, las espiroquetas difunden desde el sitio de la inoculación a múltiples órganos. ADN espiroquetas se ha detectado en MU esqueléticoscles, corazón, la vejiga, los nervios periféricos y del plexo, así como en el sistema nervioso central (cerebro, tronco cerebral y cerebelo, médula espinal, y duramadre) ^31.

Marque alimentándose de ratones ha sido utilizada por nosotros y otros equipos de investigación para la propagación de las colonias de garrapatas, en competencia como reservorio estudia ^32-36 y en los estudios de B. burgdorferi patogenia ^37-40. Esta técnica también se ha utilizado para xenodiagnóstico y pruebas de eficacia de la vacuna en ratones ^41-44. Hemos alimentado Ixodes garrapatas en primates no humanos para el desarrollo del modelo ^28, un estudio de la eficacia de la vacuna ^{de 45 años,} y para el xenodiagnóstico en la evaluación de la persistencia del tratamiento post-antibiótico ^46. Las garrapatas que puerto B. burgdorferi se puede mantener en un ciclo enzoótico naturales por la alimentación de las larvas en los ratones infectados y el uso de las ninfas de los estudios, como las espiroquetas se transmiten a través de las etapas de la vida. En este informe, Instruimos sobre cómo generar garrapatas infectadas con el tipo salvaje o mutante B. burgdorferi, con alimentación por tubo capilar. Esto también se puede lograr mediante microinyección ⁴⁷ y por inmersión ^48. El propósito de la introducción artificial de B. burgdorferi en las garrapatas pueden ser para estudiar cepas mutantes cuya transmisibilidad es desconocido, para generar un grupo de garrapatas con una alta tasa de infección, y para reducir el potencial de error mediante el mantenimiento de una colonia garrapata limpio y de lo contrario no infectada. Además, demostramos marcar la alimentación en ratones y primates no humanos, así como para asegurar la contención y recuperación de las garrapatas repletas. El uso de marcar la alimentación es esencial para futuros estudios de la respuesta inmune a B. burgdorferi infección, el potencial de eficacia de la vacuna de Lyme y xenodiagnóstico para la detección de infecciones ocultas.

Protocolo

Un esquema experimental de la inoculación de la garrapata y la alimentación de los animales para la investigación La enfermedad de Lyme se representa en la figura 1.

1. Inocular ninfas Ixodes garrapatas con B. burgdorferi Uso Capilar-La alimentación por sonda

Al realizar manipulaciones con las garrapatas, se usan batas blancas con mangas elásticas, guantes y gorras bouffant desechables.

1. Nuestra técnica es una versión modificada de la reportada por Broadwater et al. ^49. Preparar tubos capilares calentando y tirando pipetas Pasteur para romper la delgadez con un extractor pipeta. Con unas pinzas de disección y alcance, romper los consejos para el diámetro óptimo (aproximadamente 0,2 mm). Un tubo estandarizado para el tamaño mouthpart garrapata se utiliza como guía de tallas. Un protector de la cara debe ser usado en la preparación de las pipetas.
2. Crecer B. burgdorferi a entre 2-8 x 10 ⁷ / ml (fase semilogarítmica) en BSK-H medio (Sigma) CONconteniendo 6% de suero de conejo.
3. Utilice las garrapatas ninfa que se han almacenado a 23 ° C durante 4-6 semanas después de la muda de las larvas. Marque, a un pequeño de 60 x 15 mm placa de Petri con cinta de doble cara en la superficie inferior externa del plato. Coloque el lado ventral garrapatas hacia arriba.
4. Sumerja la punta del tubo capilar en el B. tubo de cultivo burgdorferi después de la mezcla. Coloque el tubo capilar sobre el hipostoma de las partes de la boca garrapata con un microscopio de disección. Utilice la arcilla de moldeo para fijar el tubo en su lugar, como se muestra en la Figura 2A.
5. Coloque las placas de Petri con las garrapatas Colocada en el interior de una gran bañera de plástico transparente para un mayor nivel de contención. Se añaden las toallas de papel húmedas para proporcionar la humedad. Coloque las garrapatas en un incubador térmica 37 ° C durante 30 h min-2 hasta la defecación es aparente. Esto indica que los medios de comunicación que contienen espiroquetas ha pasado a través de la garrapata.
6. Descanse las garrapatas durante 2-4 semanas a 23 ° C para permitir la adaptación al medio de garrapatas antes de alimentarellos en animales.

2. La infección de ratones con B. burgdorferi por Tick

1. Diluir ketamina Stock 1:10 en agua estéril. Se anestesia cada ratón con 100 mg / kg de ketamina por inyección intraperitoneal con una jeringa de tuberculina
2. Una vez que el ratón está totalmente anestesiado, afeitarse el ratón de los oídos a la media de la espalda utilizando una multa (Remington suave y sedoso) condensador de ajuste eléctrico.
3. En una cacerola blanca con ningún otro objeto cercano, transfiera las garrapatas ninfa (aquel puerto B. burgdorferi) por un pincel humedecido a la zona sin pelo del ratón. Alternativamente, las garrapatas no infectadas se pueden colocar en los ratones para xenodiagnóstico de ratones con infección sospechoso. El uso de una superficie limpia y blanco para la colocación de garrapata ayuda a asegurar que las garrapatas no unidas se verán fácilmente.
4. Coloque el ratón en jaulas especializada (Allentown introducción en jaula, Allentown, PA). La introducción en jaula consiste en una parrilla de acero inoxidable elevado desde el fondo de la jaula. Tél cima de la jaula fue modificada por nuestro propio taller de máquinas para elevar el soporte para botellas de agua suficiente como para permitir el libre movimiento del ratón debajo. La bandeja está llena de alrededor de ½ pulgada de agua para atrapar cualquier garrapata que se caen de los ratones (Figura 3A). Para minimizar el riesgo de hipotermia, almohadillas de calor reutilizables, cocinados en el microondas antes de su uso, se colocan debajo de las jaulas hasta que los ratones despiertan completamente de la anestesia. Los animales son a menudo atáxica mientras se recupera de la anestesia y rozar la alimentación y bandejas de agua, por lo que estos deben ser removidos. El nivel del agua es lo suficientemente baja para evitar las extremidades de los ratones de la sumersión.
5. Coloque la jaula dentro de una bandeja que se ha alineado con la trampa de Maraña pasta (Contech, Victoria, BC, Canadá) y cinta adhesiva para asegurar el atrapamiento de los artrópodos. Los ratones se enjaularon individualmente y se observaron continuamente durante el período de la anestesia.
6. Dentro de 2 horas, cuando los ratones son completamente despierto de la anestesia, la bandeja de la comida y la botella de agua son reemplazados a la jaula. Después de 24 horas, se sustituye el enriquecimiento de la vivienda que consta de una cabaña de plástico y Nylabone.
7. Después de 3, 4 y 5 días, verifique el ratón, la jaula y el agua jaula por garrapatas alimentadas. El agua jaula se tamiza a través de un recipiente de metal blanco (es decir, "el lavado de oro"). Enjuague alimentado las garrapatas en agua limpia y almacena en frascos de plástico (Figura 3B). En los días 3 y 4, reemplazar el agua en la jaula con agua limpia. El día 5, comprobar no sólo la jaula, pero el ratón a fondo en busca de garrapatas. Por lo general, a estas alturas todas las garrapatas han alimentado y los ratones pueden ser vuelto a introducir en la jaula regular.
8. Coloque todos los residuos de las jaulas de ratones, incluyendo líquidos, en cajas de seguridad para el autoclave y la eliminación. Mantenga un registro del número de garrapatas colocados en los ratones y los recuperados en todo momento.

3. La alimentación de las garrapatas en primates no humanos para la infección por B. burgdorferi o xenodiagnóstico

1. Prepare el dispositivo de contención de garrapata: Cortar un círculo de diámetro 1 ¾ de pulgada de la pulgada x 33 pulgadas LeFlap (colgajo), utilizando un bisturí limpio y la guía de medición. Utilice la corte como una plantilla para cortar círculos del mismo tamaño en la espuma Biatane y Duoderm. La espuma se usa para elevar solapa sobre la superficie de la piel y evitar la posible aplastamiento de garrapata. El Duoderm añade otra capa de amortiguación y se superpone a los bordes del dispositivo de contención para mayor seguridad de escapar de la garrapata. Un diagrama del dispositivo de contención se representa en la Figura 4.
2. El personal veterinario anestesiar al animal con 5-8 mg / kg de Telazol por inyección intramuscular.
3. Clip el pelo del animal usando condensador de ajuste eléctrico (Oster) equipado con el tamaño de 40 cuchillas. Todas las áreas que serán cubiertas por la chaqueta se recortan: espalda, frente, brazos. El uso de la crema de afeitar y maquinillas de afeitar desechables de doble cuchilla, afeitado de cerca un área de aproximadamente 25 cm x 20 cm vertical, horizontal. Limpie con toallas de papel húmedas y secar con calor bajo para secar la piel.
4. Coloque la tapa en tél de animales dorso, justo debajo de la escápula, a cada lado de la columna vertebral. Use un marcador para trazar el círculo en ese lugar. Prepare el área de la piel alrededor del círculo frotándola con SkinPrep. Esto elimina el aceite en la piel que podrían afectar a la adhesión de los dispositivos de pegamento y contención. Dejando alrededor de una circunferencia de 1 cm de espacio alrededor del círculo, aplicar una capa de pegamento de la piel (SkinBond) con un ancho de ~ 4 cm.
5. Retire el adhesivo de la espuma Biatane y colocar sobre la piel en el lugar apropiado. Los animales son nuevamente anestesiados por el personal veterinario con 5 mg / kg Telazol. Selle los bordes con pegamento de la piel y la cinta Hypafix. Retire el adhesivo de la solapa y colocar en la parte superior de la Biatane. Coloque cinta Hypafix alrededor de los bordes de la LeFlap, a continuación, con cinta adhesiva la solapa de malla de la solapa y colocar la chaqueta en el animal. Pasta de cinta y Trampa Maraña se aplica al suelo en un perímetro que rodea a la introducción en jaulas de primates no humanos para mayor seguridad.
6. Para minimizar los efectos de chemicals utilizados en Step 3,4 sobre la alimentación de garrapatas, las garrapatas se añaden 24 horas después de que el dispositivo de contención está en su lugar. En este punto, la seguridad del dispositivo también es inspeccionado y reforzado si es necesario. Por lo general, se añaden 20 ninfas sin alimentar (muda 4-8 semanas post-larval) a la piel en el dispositivo utilizando un pincel.
7. Retire el adhesivo de la malla de la tapa y el sello en su lugar. Por último, retire el respaldo Duoderm para exponer el adhesivo y colocar en la parte superior del dispositivo de contención. Añadir un trozo de cinta Hypafix a través del círculo de malla abierta, y vuelva a colocar la cubierta. El dispositivo de contención completado se muestra en la Figura 5A.
8. Después de 5 días, anestesiar a los animales como anteriormente y se eliminan las chaquetas. Retire la cinta primero para inspeccionar marcar la alimentación a través de la malla (Figura 5B). Retire con cuidado el Duoderm lejos de la solapa.
9. Tire hacia atrás de la porción de malla en los bordes para facilitar el acceso a las garrapatas. Garrapatas de la Fed se encuentran con frecuencia cerca o debajo deel círculo de espuma (Figura 5 C) y se retiran y se colocan en agua limpia con un pincel. Retire el dispositivo una vez que se recogen todas las garrapatas alimentadas visibles (Figura 5D).

Nota: A menudo, el dispositivo de contención simplemente se puede despegar de la piel. Si la adherencia es fuerte y potencialmente podría dañar la piel, Unisolve disolvente se aplica a la zona para la eliminación suave. La piel se limpia con isopropanol y garrapatas se almacenan a 23 ° C. Si se utiliza para la infección, las garrapatas pueden ser aplastados para confirmar el número que contenía B. burgdorferi. Si se utiliza para el xenodiagnóstico, las garrapatas se mantienen durante 1-3 semanas antes del análisis del contenido del intestino medio.

Resultados

Tras la finalización de la alimentación capilar, las garrapatas son típicamente descansaban a 23 ° C durante 2-3 semanas antes de que se alimentan de animales para la transmisión. El uso de la técnica de alimentación capilar, se ha encontrado que más del 90% de la Fed garrapatas puerto B. burgdorferi. El porcentaje de las garrapatas positivas se determina mediante lavado garrapatas en peróxido y etanol, y luego aplastarlas en PBS estéril con una mano de mortero en forma de tubo de microcentrífuga. Lo...

Discusión

Con el fin de obtener las garrapatas que puerto B. burgdorferi para estudios posteriores, las garrapatas pueden ser: (1) que se nutre de los ratones infectados en la etapa larval, (2) sumergido en B. culturas burgdorferi, ya sea en la etapa de larva o ninfa; ⁴⁸ (3) microinyectaron con B. burgdorferi ^47; o (4) alimentado-tubo capilar B. burgdorferi ^49. Aunque cada uno de estos métodos tiene su propósito, para asegurar que una gran porción de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSK-H	Sigma	B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste	Ladd research	T-131
SkinPrep	Allegro Medical Supplies	177364
LeFlap, 3" x 3"	Monarch Labs
Hypafix tape	Allegro Medical Supplies	191523
SkinBond	Allegro Medical Supplies	554536
UniSolve	Allegro Medical Supplies	176640
Biatane Foam, adhesive 4"x4"	Coloplast	3420
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border	Convatec	187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom	Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Dark field microscope	Leitz Wetzlar	Dialux
Dissecting microscope	Leica	Zoom 2000
Mouse caging	Allentown caging