ライム病研究における送信および外因診断法のために動物にダニの摂食

要約

ライム病は、北米で最も一般的に報告された媒介疾患である。原因物質、 ボレリア·ブルグドルフェリティックマダニによって送信されたスピロヘータ細菌である。動物モデルでの感染の伝播および検出は、我々はここで説明するダニ送り、使用することによって最適化されています。

要約

ライム病、 ボレリア·ブルグドルフェリの病原体の伝達は、哺乳動物宿主に目盛りマダニ種の付着および吸血によって起こる。自然界では、この人獣共通細菌性病原体は、リザーバ様々な宿主を使用することができますが、白い足マウス（ シロアシマウス ） は 、北米で幼虫と幼虫ダニの主要な貯水池である。人間は最も頻繁にBに感染した付随的な宿主である幼虫の段階でダニに咬まによるドルフェリ。B.ライム病は風土病サイクルを通じて、そのホストに適応するため、これらのスピロヘータの機能や哺乳類宿主への影響を調査する機能は、ダニの摂食を使用する必要があります。また、（検出および感染性物質の回収のための自然なベクターを用いて）外因診断法の技術が不可解な感染症の研究に有用であった。得るために、幼虫は、その港B.ダニライム病 、ダニは、キャピラリーチューブを通して文化の中で生きスピロヘータを与えている。 2つの動物モデルは、マウスおよびヒト以外の霊長類は、最も一般的にはダニ摂食を伴うライム病の研究のために使用される。我々は、これらのダニが上に供給され、感染または外因診断法のいずれかのために動物から回収することができる方法を実証する。

概要

2011年には、ライム病は、北米（第6回最も一般的な全国届出疾患だっhttp://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ）。B.ライム病は、両方の遺伝的および抗原的に^（1に概説されている）、汎用性の高い微生物である。その遺伝子構成は、大規模な（> 900 KB）染色体の分離株の間で様々なプラスミド含有量の21プラスミド（12線形、9円形）、までが含まれています。多くは、プラスミドのオープンリーディングフレームの90％がいずれかの既知の細菌配列^2,3とは無関係であるように、このスピロヘータについて学んだことです。B.ライム病は、宿主免疫の潜在的な標的として多種多様な抗原を提示する。しかし、未処理の感染がしばしば持続する。ダニの環境と脊椎動物宿主環境とスピロヘータの相互作用は、Bでの適応が必要となる感染過程を通してブルグドル 。いくつかのプラスミドにコードさ遺伝子が示差的温度、pH、細胞密度およびダニのライフサイクル^4-8の偶数段の変化に応答して発現することが知られている。

Bの研究自然経路による感染後のライム病の風土病サイクル全体での適応、および宿主応答は、適切な動物モデルでダニを養うための能力に依存しています。このような研究は、Bを抱くティックを生成する技術的な課題に満たされているライム病 、および効率的な伝送および/ ​​またはモデル·ホスト上のダニの供給を確実にする。また、感染したダニの封じ込めや回収が不可欠である。使用されるモデルの中ではライム病研究の貴重なツールとなって、それぞれがマウスとヒト以外の霊長類であり、。 Bの自然保有宿主である白い足マウスと同様に、 ライム病は 、実験用マウスは、Bで持続感染をサポートし、高度に感受性宿主であるブルグドル ^9。 FOLこのようなC3H株として疾患感受性マウスの感染をlowing、スピロヘータは、皮膚、膀胱、筋肉、関節や心臓を含む複数の組織に広める。感染に対する炎症反応は、病気にかかった心臓や関節組織につながる。スピロヘータは、このホストに固執し、感染まま、炎症性病変ではなく、ヒトでのプロセスとは異なり、断続的になることがあります。マウスモデルは、このようB.上の多くの情報を提供している関節炎や心炎を含むライム病誘発性の病理学、および免疫応答を^{10月12日を}開催。ダニベクトル^13-21からの送信のためのいくつかは、必要に応じて持っている病原体の観点からは、差動で、哺乳動物の感染時に発現特定の遺伝子は、特徴付けられている。

いくつかの動物種は²²ライム病^を研究するために使用されてきたが、アカゲザルに最も近いヒト疾患²³の多臓器文字を模倣する。他とは異なり、動物モデルは、例えば、遊走性紅斑、心炎、関節炎、および末梢および中枢神経系の神経障害などの疾患症状の幅は、マカクで観察される。 B.用マウスにおいて、リザーバホスト初期および後期-広め症状が⁹珍しくありながらライム病、疾患は、マウス系統、年齢²⁴によって異なります。また、他のげっ歯類、ウサギ、イヌとは、全てのB.神経疾患を示すことができないドルフェリ感染症^25。重要なのは、マカクはライムボレリア、すなわち、早期ローカライズされ、早期普及、および後期ライム病^26〜28 3段階に特徴的な兆候を示す。遊走性紅斑（EM）は、ヒトの場合²⁹の70〜80％に起こると考えられており、また、アカゲザル^28,30に見られる。感染後、スピロヘータは、複数の臓器に接種部位から発信。スピロヘータDNAは、骨格ムーで検出されているscles、心臓、膀胱、末梢神経や神経叢のほか、中枢神経系（大脳、脳幹や小脳、脊髄および硬膜^）31。

マウスを食べダニ貯水能力で^32〜36を研究^し 、Bの研究で、ダニのコロニーの増殖のために、私たちや他の研究チームによって利用されていますドルフェリ病因^37〜40。この技術は、マウス^41-44に外因診断法およびワクチンの有効性を試験するために使用されている。我々は、供給されたマダニはモデル開発^28、ワクチンの有効性⁴⁵の研究のため、および永続性抗生物質投与後の処置⁴⁶の評価において外因診断法のためにヒト以外の霊長類にダニがある。その港B.ティックライム病はスピロヘータがライフステージを介して送信されるように、感染したマウスに幼虫を供給し、研究のためのニンフを使って、自然の地方病のサイクルを維持することができる。本報告書で、我々は、野生型または変異型Bで感染ダニを生成する方法について指示するライム病 、毛細管送りを用いて、これはまた、マイクロインジェクション⁴⁷によって、浸漬⁴⁸によって達成することができる。 Bの人工導入の目的マダニにブルグドルフェリは 、その透過率は不明である変異株を研究するために、高い感染率とのダニ群を生成するために、すっきりとし、そうでなければ、非感染ダニのコロニーを維持することにより、エラーの可能性を低減することができる。封じ込め及び充満マダニの回収を確実にするように加えて、我々は、マウスおよびヒト以外の霊長類を餌ティ​​ックを示す。ダニ供給の使用は、Bに対する免疫応答の将来の研究のために不可欠であるライム病感染、潜在的なライムワクチンの有効性、およびオカルト感染の検出のための外因診断法。

プロトコル

ライム病の研究のための動物の際ダニ接種および給餌の実験的な概要を図1に示されている。

1。 Bと接種幼虫マダニティックキャピラリーチューブの供給を使用して、 ドルフェリ

ダニとの操作を行う際には、弾性スリーブ、手袋、使い捨てフワフワキャップ白い白衣を着用されています。

1. 我々の技術は、ブロードウォーターらによって報告されているものの修正版である^。49。ピペットプラーを使用して薄さを破るにパスツールピペットを加熱し、引いて毛細管を準備します。鉗子を使用してスコープを解剖して、最適な直径（約0.2mm）にヒントを破る。ダニの口器サイズに標準化管をサイジングガイドとして使用される。ピペットを準備する際にフェイスシールドを着用してください。
2. B.を育てるBSK-H培地中で10×2-8間⁷ / mlの（位相を中間対数）（シグマ）CONにドルフェリ6％ウサギ血清をtaining。
3. 4-6週間後、幼虫の脱皮のために23℃で保存されてきた幼虫ティックを使用してください。場所は、皿の外底面に両面テープで小さな60×15ミリメートルペトリ皿の上に刻みます。腹側を上に向けティックを配置します。
4. B.内に毛細管先端を浸し混合後のライム病培養管。解剖スコープを使用したダニの口の部分の口円錐の上に毛細管を配置します。 図2Aに示すように、適所に管を固定する成形粘土を使用する。
5. 封じ込めの追加のレベルの大規模な透明なプラスチック製の浴槽内に貼付ティックでペトリ皿を置きます。湿った紙タオルに水分を提供するために添加される。排便が明白になるまで、30分〜2時間37℃の熱インキュベーター内でダニを置きます。これはスピロヘータを含むメディアはダニを通過したことを示しています。
6. 授乳する前に、ダニの環境への適応を可能にするために23℃で2〜4週間ティックを休ま動物にそれら。

2。 B.をマウスに感染させるダニによるドルフェリ

1. 滅菌水にケタミン株式1:10に希釈する。ツベルクリン注射器で腹腔内注射によるケタミン100 mg / kgの各マウスを麻酔
2. マウスが完全に麻酔されると、バック（レミントンがスムーズ＆シルキー）電気トリマー罰金を使用して中央に耳からマウスを剃る。
3. 他のオブジェクトとの白パンに近く、マウスの毛のない部分に湿らせた絵筆で若ダニ（その港のB.ブルグドル ） を移す。または、感染していないダニは疑わしい感染によるマウスの外因診断法のためにマウスで配置することができます。ダニの配置のためのきれいな、白い表面の使用は、任意の未結合のダニが容易に理解されることを保証するのに役立ちます。
4. 専門的な監禁（アレン監禁、ペンシルバニア州アレンタウン）でマウスを置きます。監禁、ケージの底から上昇したステンレス鋼製のグリルで構成されています。 T彼はケージ上部が下にマウスの自由な動きを可能にするのに十分水のボトルホルダーを上昇させるために社内の機械工場によって変更された。パンは、トラップへの水の約2インチのマウス（ 図3A）から落下任意マダニが充填されている。マウスは、麻酔から完全に目覚めるまで低体温症の危険性を最小限に抑えるために、再利用可能なマイクロ波照射加熱パッドは、使用前に、ケージの下に配置されている。彼らは麻酔および食料や水トレー擦れから回復などの動物は、多くの場合、運動失調であるので、これらを削除する必要があります。水位が水没から​​のマウスの肢を防ぐのに十分に低い。
5. 節足動物の取り込みを確実にするために昆布トラップペースト（Contech、ビクトリア、BC州、カナダ）とテープが並んでてきたトレイの中にケージを置きます。マウスを単独でケージに入れ、麻酔の期間中に連続的に観察される。
6. マウスは麻酔から完全に目を覚ましている時に2時間以内に、食品トレーや水のボトルケージに置き換えられます。 2の後に4時間後、プラスチック製の小屋とnylaboneからなる筐体濃縮は置き換えられます。
7. 3、4、および5日後に、供給されたダニのためのマウス、ケージとケージの水を確認してください。ケージ水はホワイトメタルパン（ すなわち、「金のためにパンを」）を介してふるいにかけている。 FRBはきれいな水ですすいでダニやプラスチックの瓶（ 図3B）で保管してください。 3日目および4に、きれいな水でケージ内の水を交換してください。 5日目に、ケージが、ダニのために徹底的にマウスだけで確認してください。通常、この時点で、すべてのダニが送られてきたマウスは、通常の監禁に戻すことができます。
8. オートクレーブ滅菌および処分のためのバイオハザード容器に、液体を含む、マウスのケージからすべての廃棄物を配置します。マウス、常に回復したものに配置されたティック数のログを保管してください。

3。 Bと感染のヒト以外の霊長類でダニを供給ドルフェリまたは外因診断法

1. ダニ封じ込め装置を準備します。3インチXの1.75インチ径の円をカット清潔なメスで、測定ガイドを使用して3インチのLeFlap（フラップ）。 BiataneフォームとDuodermに同じ大きさの円をカットするためのテンプレートとして、カットアウトを使用してください。発泡体は、皮膚の表面上にフラップを高め、ダニの可能な破砕を防止するために使用される。 Duodermはクッション性の別の層を追加し、ダニのエスケープから追加されたセキュリティのための封じ込め装置のエッジをオーバーレイします。収容装 ​​置の図を図4に示されている。
2. 獣医スタッフは筋肉内注射により5-8 mg / kgのテラゾールで動物を麻酔します。
3. サイズ40のブレードを搭載した電気トリマー（オスター）を使用して、動物の毛クリップ。ジャケットでカ​​バーされるすべての領域が切り取られています。バック、フロント、二の腕を。シェービングクリームとデュアルブレードの使い捨てカミソリを使用して、密接×20センチ、横、縦約25cmの面積を剃る。湿ったペーパータオルで拭いてください、皮膚を乾燥させるために弱火で乾燥吹く。
4. Tにフラップを配置彼は動物の背部、ちょうど肩甲骨下の背骨の両側に。その場所に円をトレースするためのマーカーを使用しています。 SkinPrepでよく拭き取って円周上の皮膚の領域を準備します。これは、接着剤と封じ込め機器の付着に影響を与える可能性があり、皮膚に油を除去します。円の周りの空間の1cmの周囲に残して〜4cmの幅で皮膚接着剤（SkinBond）の層を適用します。
5. Biataneフォームから接着剤バッキングを取り外し、適切なスポットで皮膚に貼り付けます。動物は再び5 mg / kgのテラゾールで獣医スタッフによって麻酔する。皮膚接着剤とHypafixテープで端をシールします。フラップから接着剤バッキングを取り外し、Biataneの上に貼り付けます。 LeFlapのエッジの周りHypafixテープを置き、フラップのメッシュフラップを下にテープで固定し、動物にジャケットを置く。テープと昆布トラップペーストが追加されたセキュリティのための非ヒト霊長類監禁を取り巻く周囲の床に適用されます。
6. chemicの影響を最小限に収容装置が適所にある後ダニ摂食ステップ3.4において使用するalsは、目盛は24時間後に添加される。この時点で、デバイスのセキュリティも検査し、必要に応じて補強されている。通常は、20非給餌幼虫（4〜8週間後の幼虫脱皮）​​がペイントブラシを使用してデバイス内の皮膚に追加されます。
7. フラップのメッシュから接着剤バッキングを取り外し、所定の位置に密封する。最後に、接着剤を露出させDuodermバッキングを削除し、封じ込め装置の上に置きます。オープンメッシュサークル全体でHypafixテープの一部を追加し、ジャケットを交換してください。完成した収容装 ​​置は、 図5Aに示されている。
8. ジャケットが除去されている上記のように、5日後、動物を麻酔。メッシュ（ 図5B）を介して供給するダニを検査する最初のテープを取り外します。慎重にフラップからDuodermの皮をむく。
9. ダニへのアクセスを提供するためにエッジにメッシュ部分を引き戻す。 FRBのダニは頻繁に近くや下にあります泡のサークル（ 図5C）とは、ペイントブラシで除去し、きれいな水に配置されます。 （ 図5D）を1回表示されているすべてのFRBのダニが収集されたデバイスを削除します。

注：多くの場合、収容装置は、単に皮膚から剥離することができる。密着性が強く、潜在的に、皮膚に損傷を与えることができれば、Unisolve溶媒を穏やかな除去のための領域に適用される。肌をイソプロパノールで拭くとダニは23℃で保存する感染のために使用する場合、ダニはBを含まれている番号を確認するために粉砕することができますドルフェリ外因診断法のために使用した場合。、ダニ前腸内容物の分析に1-3週間保持されます。

結果

これらは、送信のために動物に供給される前に、毛管供給終了後、ダニは通常、2〜3週間、23℃で休息している。毛管給技術を用いて、我々は摂食の90％が港B.ダニことを見出したブルグドル。正ダニの割合は、洗浄することにより決定され、その後マイクロチューブ形乳棒で滅菌PBSでそれらを破砕、過酸化物及びエタノールに刻みます。スライド上に固定し、FITCコンジュゲート?...

ディスカッション

その港Bのティック得るために、下流の研究のためのライム病 、ダニ、（1）幼虫期に感染したマウスに与え、（2）Bに浸漬し幼虫や幼虫の段階⁴⁸のいずれかでのライム病の文化、（3）Bに顕微注入⁴⁷ ドルフェリ 、または（4）毛細管葉B.ブルグドル^49。これらの方法の各々は、ダニの大部分が感染ハーバーB.に使用さ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSK-H	Sigma	B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste	Ladd research	T-131
SkinPrep	Allegro Medical Supplies	177364
LeFlap, 3" x 3"	Monarch Labs
Hypafix tape	Allegro Medical Supplies	191523
SkinBond	Allegro Medical Supplies	554536
UniSolve	Allegro Medical Supplies	176640
Biatane Foam, adhesive 4"x4"	Coloplast	3420
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border	Convatec	187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom	Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Dark field microscope	Leitz Wetzlar	Dialux
Dissecting microscope	Leica	Zoom 2000
Mouse caging	Allentown caging