Alimentazione di zecche su animali per trasmissione e Xenodiagnosis a Lyme Disease Research

Riepilogo

La malattia di Lyme è la più comunemente riportati vector-borne malattia in Nord America. L'agente eziologico, Borrelia burgdorferi è un batterio spirocheta trasmessa da zecche ixodid. Trasmissione e rilevamento di un'infezione in modelli animali è ottimizzata dall'utilizzo di alimentazione tick, che descriveremo qui.

Abstract

La trasmissione dell'agente eziologico della malattia di Lyme, Borrelia burgdorferi, avviene l'attacco e l'alimentazione del sangue di specie Ixodes zecche su host mammiferi. In natura, questo patogeno batterico zoonotici possono utilizzare una varietà di host di giacimento, ma il topo bianco-footed (Peromyscus leucopus) è il serbatoio principale per le zecche larvali e ninfali in Nord America. Gli esseri umani sono padroni incidentali più frequentemente infettati da B. burgdorferi dal morso di zecche in fase di ninfa. B. burgdorferi adatta ai suoi ospiti durante tutto il ciclo di leucosi, quindi la capacità di esplorare le funzioni di queste spirochete e dei loro effetti sui ospiti mammiferi richiede l'uso di alimentazione tick. Inoltre, la tecnica di Xenodiagnosis (utilizzando il vettore naturale per il rilevamento e il recupero di un agente infettivo) è utile in studi di infezione criptica. Per ottenere nymphal zecche che porto B. burgdorferi,zecche sono alimentati spirochete vivi in ​​cultura attraverso tubi capillari. Due modelli animali, topi e primati non umani, sono più comunemente utilizzati per gli studi di malattia di Lyme che coinvolgono alimentazione tick. Dimostriamo le modalità con cui queste zecche possono essere alimentati al momento, e recuperato dagli animali sia per infezione o Xenodiagnosis.

Introduzione

Nel 2011, la malattia di Lyme è stato il sesto più comune malattia a livello nazionale Notifiable in Nord America ( http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi è un microbo versatile, sia geneticamente e antigenicamente (rivisto in ^1). La sua costituzione genetica comprende una grande (> 900 kB) cromosoma e fino a 21 plasmidi (12 lineari, circolari 9), con contenuto plasmide variabile tra gli isolati. Molto può essere imparato su questi spirochete, superiore al 90% del plasmide open reading frames estranei a qualsiasi sequenze batteriche conosciuti ^2,3. B. burgdorferi presenta una grande varietà di antigeni come potenziali bersagli di immunità dell'ospite. Tuttavia, un'infezione non trattata spesso persiste. L'interazione del spirochete con l'ambiente tick e l'ambiente ospite vertebrato richiede adattamenti in B. burgdorferi tutto il processo di infezione. Diversi plasmidicageni sono noti per essere differenzialmente espressi in risposta alle variazioni di temperatura, pH, densità cellulare e persino fase del ciclo di vita tick ^4-8.

Lo studio di B. adattamento burgdorferi tutto il suo ciclo leucosi e risposta dell'ospite dopo l'infezione per via naturale si basa sulla capacità di alimentare zecche su modelli animali appropriati. Tali studi sono soddisfatti con le sfide tecniche di generazione di zecche che ospitano B. burgdorferi, e garantire la trasmissione efficiente e / o l'alimentazione delle zecche sul modello di accoglienza. Inoltre, il contenimento e il recupero di zecche infette è essenziale. Tra i modelli utilizzati sono topi e primati non umani, ognuno dei quali funge da strumento prezioso nella ricerca sulla malattia di Lyme. Come con il mouse zampe bianche, che è un host serbatoio naturale per B. burgdorferi, il topo di laboratorio è un host altamente sensibile che supporta l'infezione persistente da parte di B. burgdorferi ^9. Folsivo infezione di topi suscettibili alla malattia, come il ceppo C3H, le spirochete diffondere a più tessuti, compresa la pelle, della vescica, i muscoli, le articolazioni e il cuore. Risposte infiammatorie alle infezioni portano a cuore malato e tessuti articolari. Mentre le spirochete persistono in questa struttura e rimangono contagiosi, lesioni infiammatorie possono diventare intermittente, non diversamente dal processo negli esseri umani. Il modello di topo ha quindi fornito molte informazioni su B. burgdorferi patologia indotta, tra cui l'artrite e cardite e ospitare le risposte immunitarie ^10-12. Dal punto di vista del patogeno, alcuni geni differenzialmente espressi durante l'infezione mammiferi sono stati caratterizzati, come avere qualche necessaria per la trasmissione della zecca vettore ^13-21.

Sebbene diverse specie animali sono stati utilizzati per studiare la malattia di Lyme ^22, macachi rhesus più strettamente imitare il carattere multi-organo di malattia umana ^23. A differenza di altrimodelli animali, l'ampiezza delle manifestazioni della malattia, quali eritema migrans, cardite, artrite, e la neuropatia del sistema nervoso centrale e periferico sono osservate nei macachi. Nei topi, l'ospite serbatoio per B. burgdorferi, malattia varia da ceppo di topi e ²⁴ anni, mentre le precoci e tardive diffuse manifestazioni sono infrequenti ^9. Inoltre, altri roditori, lagomorfi, e canini tutti riescono a esporre malattia neurologica da B. burgdorferi ^25. È importante sottolineare che, macachi mostrano segni che sono caratteristici di tutte e tre le fasi della borreliosi di Lyme, vale a dire, precoce localizzata, precoce disseminata e in fase avanzata della malattia di Lyme ^26-28. L'eritema migrante (EM) è pensato per verificarsi nel 70-80% dei casi umani ^29, e si vede anche nei macachi rhesus ^28,30. Dopo l'infezione, le spirochete diffondere dal sito di inoculazione di organi multipli. DNA spirochetal è stato rilevato in mu scheletricoscles, cuore, vescica, dei nervi periferici e del plesso, nonché nel sistema nervoso centrale (cervello, cervelletto e tronco cerebrale, midollo spinale, e dura madre) ^31.

Spunta nutrendosi di topi è stato utilizzato da noi e da altri gruppi di ricerca per la moltiplicazione delle colonie di zecche, in competenza serbatoio studia ^32-36 e negli studi di B. burgdorferi patogenesi ^37-40. Questa tecnica è stata utilizzata anche per Xenodiagnosis e test di efficacia del vaccino nei topi ^41-44. Abbiamo nutrito zecche Ixodes su primati non umani per il modello di sviluppo ^28, uno studio di efficacia del vaccino ^45, e per Xenodiagnosis nella valutazione della persistenza trattamento post-antibiotico ^46. Le zecche che porto B. burgdorferi può essere mantenuta in un ciclo leucosi naturale nutrendosi di larve sui topi infetti e con le ninfe per gli studi, le spirochete sono trasmessi attraverso le fasi della vita. In questo rapporto, Ci spiegherà come generare zecche infettate con wild type o mutante B. burgdorferi, utilizzando capillare tubo di alimentazione. Questo può anche essere realizzato mediante microiniezione ⁴⁷ e ⁴⁸ per immersione. Lo scopo della introduzione artificiale di B. burgdorferi nelle zecche possono essere di studiare ceppi mutanti la cui trasmissibilità è sconosciuto, per generare un gruppo di zecche, con un alto tasso di infezione, e per ridurre il rischio di errore mantenendo un segno di spunta colonia pulito e altrimenti non infetto. Inoltre, dimostriamo alimentazione segno di spunta su topi e primati non umani, in modo da assicurare il contenimento e il recupero delle zecche piene. L'uso di alimentazione tick è essenziale per gli studi futuri di risposte immunitarie a B. burgdorferi, potenziale efficacia del vaccino di Lyme, e Xenodiagnosis a rilevare le infezioni occulte.

Protocollo

Uno schema sperimentale di zecca inoculazione e di alimentazione su animali per la ricerca della malattia di Lyme è illustrato in Figura 1.

1. Inoculando nymphal zecche Ixodes con B. burgdorferi Uso capillare Tube-alimentazione

Quando si esegue manipolazioni con le zecche, camice bianco con maniche elastici, guanti e cappellini bouffant usa e getta sono usurati.

1. La nostra tecnica è una versione modificata di quella riportata da Broadwater et al. ^49. Preparare tubi capillari da riscaldamento e tirando pipette Pasteur a rompere magrezza con un estrattore pipetta. Utilizzando una pinza e sezionare la portata, rompere le punte al diametro ottimale (circa 0,2 mm). Un tubo standardizzato rispetto alla dimensione tick mouthpart viene utilizzato come guida dimensionamento. La visiera deve essere indossato durante la preparazione delle pipette.
2. Crescere B. burgdorferi a tra 2-8 x 10 ⁷ / ml (fase mid-log) in BSK-H medio (Sigma) concontenenti siero di coniglio 6%.
3. Utilizzare zecche ninfa che sono stati conservati a 23 ° C per 4-6 settimane molt post-larvale. Luogo zecche su un piccolo piatto di mm 60 x 15 Petri con nastro biadesivo sulla superficie inferiore esterna del piatto. Posizionare il lato ventrale zecche rivolto verso l'alto.
4. Immergere la punta capillare in B. burgdorferi provetta di coltura dopo la miscelazione. Posizionare il tubo capillare sul ipostoma delle parti tick bocca utilizzando un ambito dissezione. Utilizzare argilla stampaggio per fissare il tubo in posizione, come mostrato nella Figura 2A.
5. Porre le capsule di Petri con le zecche appositi all'interno di una grande vasca di plastica trasparente per un ulteriore livello di contenimento. Asciugamani di carta bagnati sono aggiunti per fornire umidità. Collocare le zecche in un incubatore termica 37 ° C per 30 minuti-2 ore fino defecazione è evidente. Ciò indica che i supporti contenenti spirochete è passato attraverso il segno di spunta.
6. Appoggiare le zecche per 2-4 settimane a 23 ° C per consentire l'adattamento all'ambiente tick prima della poppatali su animali.

2. Infettando topi con B. burgdorferi by Tick

1. Diluire ketamina magazzino 01:10 in acqua sterile. Anestetizzare ciascun topo con 100 mg / kg di ketamina mediante iniezione intraperitoneale con una siringa da tubercolina
2. Una volta che il mouse è completamente anestetizzato, radere il topo dalle orecchie a metà schiena con una multa (Remington liscia e setosa) trimmer elettrico.
3. In una padella bianco senza altri oggetti vicini, trasferire le zecche ninfali (che porto B. burgdorferi) da un pennello inumidito per la zona glabra del mouse. In alternativa, zecche infetti possono essere messi sui topi per Xenodiagnosis di topi con sospetta infezione. L'utilizzo di una superficie bianca pulita per il posizionamento tick aiuta a garantire che eventuali zecche slegati saranno facilmente visibili.
4. Posizionare il mouse in gabbie specializzata (Allentown Ingabbiare, Allentown, PA). La gabbia è costituito da una griglia in acciaio inox elevato dal fondo della gabbia. Tegli top gabbia è stata modificata dalla nostra officina in-house per elevare il supporto della bottiglia di acqua sufficiente a consentire il libero movimento del mouse sotto. Il piatto è riempito con circa ½ centimetro di acqua per trattenere eventuali zecche che cadono fuori i topi (Figura 3A). Per ridurre al minimo il rischio di ipotermia, cuscinetti termici riutilizzabili, scaldati prima dell'uso, sono posti sotto le gabbie fino a quando i topi si svegliano completamente dall'anestesia. Gli animali sono spesso atassica come recuperare da anestesia e strofinare contro il cibo e vaschette, per cui questi devono essere rimossi. Il livello dell'acqua è abbastanza basso per prevenire membra di topi da sommersione.
5. Posizionare la gabbia all'interno di un vassoio che è stato rivestito con trappola groviglio di pasta (Contech, Victoria, BC, Canada) e nastro per garantire l'intrappolamento degli artropodi. I topi sono in gabbia singolarmente e osservati continuamente durante il periodo di anestesia.
6. Entro 2 ore, quando i topi sono completamente svegli dall'anestesia, il vassoio di cibo e una bottiglia d'acqua sono sostituiti alla gabbia. Dopo 24 ore, l'arricchimento custodia costituito da una capanna di plastica e Nylabone viene sostituito.
7. Dopo 3, 4, e 5 giorni, controllare il mouse, gabbia e acqua gabbia per zecche fed. L'acqua gabbia setacciata attraverso un tegame di metallo bianco (vale a dire "cercatore d'oro"). Sciacquare alimentato zecche in acqua pulita e conservare in vasetti di plastica (Figura 3B). Nei giorni 3 e 4, sostituire l'acqua in gabbia con acqua pulita. Il giorno 5, controllare non solo la gabbia, ma il mouse accuratamente per le zecche. Di solito a questo punto tutte le zecche hanno alimentato ed i topi possono essere restituiti a ingabbiamento regolare.
8. Collocare tutti i rifiuti dalle gabbie del mouse, inclusi i liquidi, in contenitori a rischio biologico per autoclave e smaltimento. Tenere un registro del numero di zecche fatti su topi e quelli recuperati in ogni momento.

3. Nutrire zecche su primati non umani per l'infezione con B. burgdorferi o Xenodiagnosis

1. Preparare il dispositivo di zecca di contenimento: Tagliare un cerchio di 1 ¾ di pollice di diametro nel 3 pollici x3 pollici LeFlap (lembo) utilizzando un bisturi pulito e la guida di misura. Utilizzare il cut-out come modello per tagliare i cerchi di dimensioni identiche nella Biatane schiuma e Duoderm. La schiuma viene utilizzato per elevare lembo sulla superficie della pelle e prevenire possibili frantumazione di zecca. Il Duoderm aggiunge un altro strato di ammortizzazione e sovrappone i bordi del dispositivo di contenimento per una maggiore sicurezza dal tick fuga. Lo schema del dispositivo di contenimento è mostrata in Figura 4.
2. Personale veterinario sarà anestetizzare l'animale con 5-8 mg / kg Telazol per iniezione intramuscolare.
3. Agganciare il pelo dell'animale con trimmer elettrico (Oster) dotato di dimensioni 40 lame. Tutte le aree che saranno oggetto della giacca sono ritagliati: posteriore, anteriore, parte superiore delle braccia. Utilizzo di crema da barba e dual-blade rasoi usa e getta, strettamente radere una superficie di circa 25 centimetri in verticale x 20 cm orizzontale. Pulire con tovaglioli di carta umidi e asciugare a bassa temperatura per asciugare la pelle.
4. Posizionare l'aletta sul tegli animale del dorso, appena sotto la scapola, su entrambi i lati della colonna vertebrale. Usare un pennarello per tracciare il cerchio in quel punto. Preparare la zona di pelle intorno al cerchio strofinandola con SkinPrep. Questo rimuove l'olio in pelle che potrebbero influenzare l'adesione dei dispositivi di colla e di contenimento. Lasciando circa 1 cm circonferenza di spazio intorno al cerchio, applicare uno strato di colla pelle (SkinBond) con una larghezza di circa 4 cm.
5. Rimuovere la pellicola adesiva dalla schiuma Biatane e apporre la pelle nel punto appropriato. Gli animali sono di nuovo anestetizzati dal personale veterinario con 5 mg / kg Telazol. Sigillare i bordi con colla di pelle e nastro Hypafix. Rimuovere la protezione adesiva dal lembo e apporre sulla parte superiore del Biatane. Luogo nastro Hypafix intorno ai bordi del LeFlap, poi il nastro lungo il lembo di maglia del lembo e posizionare la giacca sull'animale. Tape ed aggroviglia Trappola pasta viene applicata al pavimento in un perimetro che circonda la gabbia dei primati non umani per una maggiore sicurezza.
6. Per ridurre al minimo gli effetti della chemicals utilizzati nella Fase 3.4 sull'alimentazione tick, le zecche sono aggiunti 24 ore dopo che il dispositivo di contenimento è a posto. A questo punto, la sicurezza del dispositivo è anche controllato e rinforzato se necessario. Tipicamente, 20 ninfe unfed (molt 4-8 settimane post-larvale) vengono aggiunti alla pelle all'interno del dispositivo con un pennello.
7. Rimuovere il foglio adesivo dalla maglia del lembo e sigillare in posizione. Infine, rimuovere il supporto Duoderm per esporre l'adesivo, e posto sulla parte superiore del dispositivo di contenimento. Aggiungere un pezzo di nastro Hypafix attraverso il cerchio maglie aperte, e sostituire la giacca. Il dispositivo di contenimento è mostrato nella figura 5A.
8. Dopo 5 giorni, anestetizzare gli animali come sopra e le giacche vengono rimossi. Rimuovere il nastro prima di ispezionare l'alimentazione tick attraverso la rete (Figura 5B). Facendo attenzione la Duoderm lontano dal lembo.
9. Tirare indietro la parte di rete ai bordi per fornire l'accesso alle zecche. Zecche Fed si trovano spesso vicino o sottoil cerchio di schiuma (Figura 5C) e sono rimosso e collocato in acqua pulita con un pennello. Rimuovere il dispositivo una volta tutte le zecche alimentati visibili sono raccolti (Figura 5D).

Nota: Spesso, il dispositivo di contenimento può essere semplicemente staccato dalla pelle. Se l'adesione è forte e potrebbe potenzialmente danneggiare la pelle, Unisolve solvente viene applicato all'area per la rimozione delicata. La pelle viene pulita con isopropanolo e zecche sono conservati a 23 ° C. Se utilizzato per le infezioni, le zecche possono essere schiacciati per confermare il numero che conteneva B. burgdorferi. Se utilizzato per Xenodiagnosis, le zecche sono conservati per 1-3 settimane prima dell'analisi del contenuto dell'intestino medio.

Risultati

A seguito del completamento di alimentazione capillare, le zecche sono tipicamente riposato a 23 ° C per 2-3 settimane prima di essere alimentati su animali per la trasmissione. Utilizzando la tecnica capillare al seno, abbiamo scoperto che oltre il 90% della Fed zecche porto B. burgdorferi. La percentuale di zecche positive viene determinata mediante lavaggio zecche in perossido ed etanolo, poi schiacciandoli in PBS sterile con un pestello a forma di provetta per microcentrifuga. Il contenuto dell'intesti...

Discussione

Al fine di ottenere le zecche che porto B. burgdorferi per studi a valle, le zecche possono essere: (1) alimentati con topi infettati allo stadio larvale, (2) immerso in B. culture burgdorferi alle due larvale o ninfale fase ^48; (3) microiniettati con B. burgdorferi ^47; o (4) capillare tubo-fed B. burgdorferi ^49. Mentre ciascuno di questi metodi ha il suo scopo, per assicurare che una gran parte delle zecche da utilizzare per porto infezione <...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSK-H	Sigma	B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste	Ladd research	T-131
SkinPrep	Allegro Medical Supplies	177364
LeFlap, 3" x 3"	Monarch Labs
Hypafix tape	Allegro Medical Supplies	191523
SkinBond	Allegro Medical Supplies	554536
UniSolve	Allegro Medical Supplies	176640
Biatane Foam, adhesive 4"x4"	Coloplast	3420
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border	Convatec	187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom	Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Dark field microscope	Leitz Wetzlar	Dialux
Dissecting microscope	Leica	Zoom 2000
Mouse caging	Allentown caging