El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

Resumen

Células epiteliales nasales, obtenidas mediante biopsia raspadura superficial de voluntarios humanos, se expanden y se transfieren a insertos de cultivo de tejidos. Al llegar a la confluencia, las células se cultivan en la interfase aire-líquido, produciendo cultivos de células ciliadas y no ciliadas. Cultivos de células epiteliales nasales diferenciados proporcionan modelos experimentales viables para el estudio de la mucosa respiratoria.

Resumen

En modelos in vitro utilizando células epiteliales primarias humanas son esenciales en la comprensión de las funciones clave de la epitelio respiratorio en el contexto de infecciones microbianas o agentes inhalados. Las comparaciones directas de las células obtenidas de poblaciones enfermas nos permiten caracterizar diferentes fenotipos y diseccionar los mecanismos subyacentes que median cambios en la función de las células epiteliales. El cultivo de células epiteliales de la región traqueobronquial humano ha sido bien documentado, pero está limitada por la disponibilidad de tejido pulmonar humano o invasividad asociada con la obtención de los cepillos biopsias bronquiales. Células epiteliales nasales se obtienen a través de biopsias de raspado nasal superficiales mucho menos invasivas y los sujetos pueden hacer una biopsia varias veces sin efectos secundarios significativos. Además, la nariz es el punto de entrada para el sistema respiratorio y por lo tanto uno de los primeros sitios de estar expuestos a cualquier tipo de factor estresante transmitida por el aire, tales como agentes microbianos, contaminantes, o alérgenos.

Brevemente, las células epiteliales nasales obtenidas a partir de voluntarios humanos se expandieron en placas de cultivo de tejidos recubiertos, y luego se transfirieron a insertos de cultivo celular. Al llegar a la confluencia, las células continúan siendo cultivado en la interfase aire-líquido (ALI), durante varias semanas, lo que crea más fisiológicamente condiciones pertinentes. La condición de cultivo ALI utiliza medios definidos que conducen a un epitelio diferenciado que presenta características morfológicas y funcionales similares al epitelio nasal humano, con las células ciliadas y tanto moco produciendo. Insertos de cultivo de tejido con las células epiteliales nasales diferenciadas pueden ser manipulados en una variedad de formas dependiendo de las preguntas de investigación (tratamiento con agentes farmacológicos, la transducción con vectores lentivirales, la exposición a los gases, o la infección con agentes microbianos) y se analizaron para numerosos puntos finales diferentes que van desde vías celulares y moleculares, CH funcionalanges, morfología, etc

Los modelos in vitro de células epiteliales nasales humanas diferenciadas permitirá a los investigadores para abordar la novela y preguntas de investigación importantes mediante el uso de modelos experimentales organotypic que imitar en gran medida el epitelio nasal en vivo.

Introducción

Objetivo de la técnica

Las células epiteliales (ECS) en las vías respiratorias se encuentran entre los primeros sitios para ser expuestos directamente a los factores de estrés ambientales inhalados, tales como agentes patógenos, alérgenos o contaminantes del aire. Los CE son más que un obstáculo estructural: Actúan como un panel de control para iniciar y regular la respuesta inmune respiratoria ^1-3 a través de la liberación de mediadores solubles ^4-6 y la expresión de ligandos / receptores en sus superficies en ^7-9. Mientras que las líneas celulares inmortalizadas pueden ser utilizados como modelos para estudiar las EC respiratoria in vitro, no logran diferenciarse en poblaciones de células heterogéneas compuestas de ciliado polarizado y células productoras de moco, similar a lo que se observa in vivo. Para recapitular características importantes de la epitelio respiratorio observado in vivo, se pueden utilizar los CE de las vías respiratorias primarias. Por lo tanto, nuestro objetivo fue optimizar nuestro método utilizando nasal ECs (CNE) obtuvo de voluntarios humanos. Los CNE se expanden y se cultivan in vitro, produciendo un modelo de cultivo celular de CNE diferenciadas que imita muchas de las características de la epitelio nasal visto in vivo.

Razón fundamental

El uso de modelos in vitro con ECs primarios humanos que imitan en la situación in vivo - como se describe en este estudio - da posibilidades únicas para estudiar la enfermedad diferencias específicas de EC, parámetros fisiológicos asociados con el epitelio de las vías respiratorias, o las interacciones entre los ECs y otros tipos de células, tales como células dendríticas ^10, células asesinas naturales o macrófagos ^11. Varios métodos existentes utilizan ECs bronquiales, que se pueden obtener invasiva a través de biopsias de pincel durante broncoscopias, o de tejido pulmonar descartados ^12-17. Además, existen fuentes comerciales para obtener cultivos de células epiteliales de la vía aérea humana completamente diferenciadas (modelo EpiAirway de MatTek, Ashland, MA, CloneticsLonza, Basilea, Suiza, MucilAir de Epithelix Sars, Ginebra Suiza), donde los investigadores pueden elegir entre los diferentes donantes. Sin embargo, debido a la cantidad limitada de células epiteliales comercialmente disponibles, limitados o conjunto determinado de parámetros, el coste asociado a la obtención en el mercado de las vías respiratorias humanas primarias EC, y el limitado acceso a los tejidos de los pulmones descartado o recién obtenida tejido de la biopsia bronquial humano, prohíben muchos investigadores desde la realización de estudios en ECs vías respiratorias humanas completamente diferenciadas. Por lo tanto, nos propusimos desarrollar una técnica que 1) utilizan NECs humanos no invasiva obtenidos, 2) proporcionar un protocolo que permitiese culturas diferenciadas epitelio respiratorio humano, y 3) sea reproducible en la mayoría de los ajustes de laboratorio con una infraestructura de cultivo de tejido existente.

Las ventajas sobre las técnicas existentes / Modelos

La obtención de los CNE frescas, en comparación con bronquial o de la vía aérea pequeña EC, es mucho menos invasiva, individuos puede hacer una biopsia varias veces sin efectos secundarios significativos, y superficiales biopsias de raspado nasal puede llevar a cabo en las poblaciones de enfermos que de otro modo no serían elegibles para broncoscopias relacionados con la investigación. Biopsias de raspado superficial no invasivas para obtener NECs permiten al investigador para establecer la especificación de los donantes a priori, incluyendo edad, sexo, estado de la enfermedad, etc, de acuerdo con el objetivo de la investigación a realizar. Por lo tanto, en el diseño de estudios de investigación de los investigadores no están limitados por los tejidos clínicamente disponibles / muestras epiteliales, comprar costosos modelos de cultivos celulares diferenciados de los proveedores comerciales, o de diseño de los estudios de broncoscopia invasivos. Además, la facilidad para obtener los CNE aumenta la capacidad para llevar a cabo experimentos en células de diferentes donantes, lo que mejora la validación estadística de los resultados observados. Por último, la nariz es uno de los primeros sitios a ser expuestos a cualquier tipo de estrés transmitidas por el aire. Por lo tanto, la generación de organotípicos ensistemas de cultivo in vitro que imitan el epitelio nasal son útiles para el estudio de inhalación de partículas virales, contaminantes, alérgenos, o gases, que se pueden conseguir fácilmente mediante el uso de este sistema de cultivo celular.

Protocolo

1. Preparar Plastic Ware: Escudo Plate

1. Añadir 500 l PureCol (1:100 diluidos con agua estéril) a cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
2. Incubar a 37 ° C en una incubadora durante 30 minutos, retirar el PureCol y enjuague con HBSS justo antes de añadir las células a la placa (véase el paso 3.1 más abajo).

2. La obtención y el tratamiento previo de la biopsia de CNE Humano

1. Biopsia de raspado nasal
   1. Obtener ECs superficiales que recubren los cornetes nasales bajo visión directa a través de un espéculo nasal reutilizables de polipropileno 9 mm (modelo 22009) en un otoscopio operativo con espéculo (modelo 21700). Este dispositivo proporciona una visualización óptima de los cornetes nasales y flexibilidad de movimiento.
   2. Realice las biopsias con el sujeto sentado derecho en una silla de respaldo recto, con la cabeza ligeramente inclinada hacia atrás o acostado en posición supina sobre una mesa de examen.
   3. Introduzca el espéculo otoscopio en la fosa nasal y la turbi inferiornate visualizado con iluminación.
   4. Inserte una cureta termoplástico estéril a través del espéculo con la punta extendida distalmente a la parte posterior del cornete.
   5. El uso de una presión suave en la superficie inferior del cornete, la legra se dibuja a través de la superficie de la mucosa de 5x y retraído. Una recuperación exitosa de células de la mucosa en poder de la acción capilar será evidente en la copa de la cureta.
2. Colocar la muestra en un tubo cónico de 15 ml que contiene 8 ml de RPMI 1640, el transporte en hielo.
3. El uso de fórceps para recuperar la sonda, desalojar a los tejidos de la sonda rinoceronte con una pipeta P-1000, deseche la sonda
4. Se centrifuga para sedimentar (4 ° C, 400 x g, 5 min), se aspira el sobrenadante (atención: cuidado de no aspirar el pellet).
5. Resuspender el precipitado en 1 ml de BEGM con 10 l de 100x DNasa 1.
6. Incubar a TA durante 20 min.
7. Centrífuga (4 ° C, 400 x g, 5 min), no aspirar el sobrenadante!

3. SEED las células de plástico (día 0)

1. Retire la PureCol de la placa y enjuague con HBSS (véase también el paso 1.2).
2. Añadir un volumen mínimo de BEGM + Media + (80-100 mu l, hasta que aparezca un menisco de medios de comunicación en el centro del pozo) en los pozos 1-4 (dependiendo del tamaño de la biopsia) de la placa revestida.
3. Utilizar una pipeta P-1000 para quitar cuidadosamente el sedimento del tejido de la biopsia del tubo, sin aspiración demasiado medios de comunicación.
4. Transferir el sedimento en el medio de los pozos, mantener la biopsia juntos como un grupo de células, y no se rompen para hacer una suspensión de células individuales. A buenos rendimientos de biopsia hasta 4 pozos que pueden ser sembradas. Coloque la placa en el cultivo de tejidos incubadora (37 ° C, 5% de CO _2,> 90% humedad relativa).
5. Compruebe después de dos horas para asegurar que hay suficiente papel (sin perturbar el menisco).
6. Día 1, 24 horas después de la siembra: recoger todas las células no adherentes de todos los pozos (placa de inclinación y recoger los medios de comunicación con las células en un P-1000, collect todos los pocillos en un tubo de centrífuga de 1,5 ml).
7. Centrífuga (4 ° C, 400 x g, 5 min).
8. Mientras centrifugación suspensión de células: añadir alrededor de 250 l de BEGM + + y 250 l de mezcla de los medios de comunicación BEGM + para las células sembradas en el día 0.
9. Repita los pasos 3.1 a 3.5 para las células no adherentes.
10. Día 2-5: los medios de comunicación el cambio de las celdas diarias, añadir 500 medios mu l a cada pocillo, reducir la cantidad de BEGM + + gradual medios (día 2 después de la siembra: 125 l BEGM + + plus 375 l BEGM +, day3 después de la siembra y los siguientes días: 73 l BEGM + + Plus 427 l BEGM +).

4. La expansión de las células en los frascos

1. Monitorear las células diariamente, una vez que hayan alcanzado el 80-90% de confluencia (generalmente 5-7 días después de la biopsia, si se tarda más tiempo no van a crecer con éxito) las células del elevador lo siguiente: los medios de comunicación cuidadosamente aspirados, añadir 500 l de tripsina al 0,25% por pozo, a mantenerlos a 37 º C hasta que se separan las células (por lo general toma 2-3 min).
2. Preparar la necesidadvolumen ed de haba de la soja Inhibidor de Tripsina (SBTI) (750 l por 1 ml de tripsina) en un tubo de 15 ml.
3. Desalojar células pipeteando repetidamente por toda la solución de tripsina; transferencia de células desprendidas en el tubo cónico de 15 ml con SBTI.
4. Enjuague todos los pocillos con un total de 1 ml de HBSS, añadir HBSS para el tubo con las células.
5. Se centrifuga para sedimentar (4 ° C, 400 x g, 5 min), aspirar los medios de comunicación, resuspender en 1 ml BEGM + medios de comunicación y agitar el tubo.
6. Expandir las células en un matraz T25 o T75, dependiendo del tamaño de pellet (esto es p1; aproximadamente dos pozos confluentes entran en un frasco T75, uno confluentes bien es suficiente para un T25, por lo general 2 pozos confluentes producen una T75).
   1. Añadir BEGM + a los matraces (5 ml cada una para un T75, 3 ml cada una para un T25).
   2. Añadir la suspensión celular a los matraces. Transfiera los frascos en una incubadora de cultivo de tejidos.
7. 24 horas después de la matraz de siembra: agregar elementos multimedia adicionales BEGM + al matraz (3 ml a un T25, 10 ml a un T75).
8. mantener las células de los frascos: Retire el medio (aspirado desde la esquina) y añadir BEGM + medios de comunicación (5 ml/T25, 20 ml/T75). Los medios de comunicación tiene que ser cambiado cada 2-3 días. Mantener las células en el matraz hasta que son aproximadamente el 80% de confluencia (confluencia puede no ser aún lo largo de todo el matraz; normalmente esto tarda entre 7-10 días, y si no son confluentes después de 10 días no van a crecer con éxito).

5. Sembrar las células en cultivo de tejidos inserciones

1. Retire el papel del matraz y añadir tripsina (3 ml para T25, 4 ml de matraz T75).
2. Incubar a 37 ° C hasta que se desprenden las células (aproximadamente 2-3 minutos).
3. Preparar SBTI (750 l por 1 ml de tripsina> 2,25 ml para T25, 3 ml para T75) en un tubo de 15 ml.
4. Separar las células con cinta adhesiva el matraz y pipeteando arriba y abajo y transferir al tubo cónico con el SBTI.
5. Lavar el matraz con HBSS (1 ml para T25, 2 ml para T75), añadir el HBSS para el tubo de 15 ml.
6. Centrífugopara sedimentar (4 ° C, 400 x g, 5 min), retire el sobrenadante con cuidado.
7. Preparar las placas: decidir cuántos platos van a ser cabeza de serie, etiquetar las placas con código de muestra y número, número de pases (es decir, p2) y la fecha. Añadir 700 mu l BEGM + medios de comunicación a la cámara basal.
8. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio BEGM ALI por agitación del tubo.
9. Contar las células con un hemocitómetro (un T25 normalmente produce alrededor de 4 millones de células, un T75 puede tener hasta 20 millones de células en función del islote, el uso de 1-2 million de las células de una placa de 12 pocillos) y diluir la suspensión celular con medios BEGM ALI con el volumen total necesario para la cantidad de placas que deben ser cabeza de serie (1,2 x 10 ⁶ células en 2,5 ml de medio por placa) (Nota:. Si una parte de las células quieren congelar, etiquetar el tubo y eliminar las células aquí solemos congelamos 2 x 10 ⁶ células en 2 ml de medio de congelación)
10. Añadir 200 l de suspensión celular a la parte apical de cada célula Corning 12well sin revestirinsertar (> este período es de 80,000-150,000 células / inserto; 12 transwells mm con 0,4 micras de poliéster de poros (polietileno tereftalato (PET)) inserto de membrana), la transferencia en el cultivo de tejidos incubadora.
11. Después de 24 horas, cambiar el soporte apical (200 medio de expansión l).
12. El mantenimiento de los cultivos celulares: Cambia los medios de comunicación (medios BEGM ALI; 700 l basolateral y 200 l apical) en días alternos. Inserta tienen que mantenerse sumergido hasta que las células son totalmente confluente (sin agujeros en monocapa son visibles). Dependiendo del número de células esta toma generalmente entre 2-6 días, si se necesita más tiempo que las células lo más probable es que no sea viable.

6. Establecer Aire interfaz Liquid Una vez que las células son completamente confluentes (Cuando las células de la Transwells son completamente confluentes)

1. Una vez que las células son completamente confluente reemplazar ambos medios apical y basolateral con medios BEGM ALI suplementado con 500 nM de ácido retinoico durante 48 horas.
2. 48 horas después de añadir el ácido retinoico medio suplementado BEGM ALI: Preparar PneumaCult-ALI Medio de Mantenimiento (siguiendo las instrucciones del fabricante): Calcular el volumen de medio necesario (para una placa, por lo general 8,5 ml para compartimentos basales); añadir por cada 1 ml PneumaCult medio completo Base :

   10 l PneumaCult 100x Suplemento Mantenimiento
   2 l de heparina (de una solución madre 2 mg / ml)
   5 l de hidrocortisona (de una solución madre 96 l / ml).

3. Quite todos los medios de comunicación y añadir 700 l PneumaCult-ALI medios de mantenimiento en el lado basolateral sólo (sin soporte en la parte apical).
4. Mantener los cultivos celulares durante 4 semanas en el ALI:
   1. Cambie los medios de comunicación en días alternos (lunes, miércoles y horario Viernes funciona bien para nosotros).
   2. Después de una semana en ALI, una vez a la semana (miércoles) la superficie apical se aclara: añadir 200 l HBSS a la parte apical, mantenerlos durante 10 minutos en la incubadora, aspirar con cuidado laHBSS (utilice un 9 en pipeta de vidrio unido a la trampa de vacío en la cabina de seguridad biológica, utilizar 200 l consejos en la punta de la pipeta para succionar de la HBSS).

Nota: Cambie las puntas entre las placas, así como el cambio de las puntas cuando se pasa de la superficie apical frente basolateral. Después de aproximadamente 2 semanas en el Ali, las células comienzan a diferenciarse y aparecen cilios. Los cultivos de células alcancen una diferenciación después de 4 semanas en el ALI.

Resultados

CNE cultivó siguiendo el protocolo aquí descrito de re-diferenciarse en una capa heterogénea de ECs compuesto de células ciliadas y no ciliadas, que representan la situación in vivo (Figura 1). Algunos de los CNE diferenciadas son moco que producen (células de la tinción de azul usando AB / PAS, Figura 1B). A pesar de que el protocolo aquí presentado está optimizado, la diferenciación puede variar con respecto a la distribución de las poblaciones de células...

Discusión

EC respiratorios proporcionan no sólo una barrera física para proteger el cuerpo humano de estímulos exógenos ^20, sino que también actúan como un cuadro de distribución para iniciar y regular las respuestas de defensa inmune respiratorias ^1-3 a través de la secreción de mediadores solubles o interacciones célula-célula directos receptor-ligando. Con el fin de estudiar más a fondo el papel de ECs en la respuesta inmune, para examinar las diferencias potenciales entre los CE de poblacione...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nasal speculum	Welch Allyn	Model 22009	9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope	Welch Allyn	Model 21700
Rhino probe cell cuvette	Arlington Scientific	SY-96-092	bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates	Corning	3512
Transwell membrane cell culture inserts	Corning	3460
Tissue culture flask	Corning	430639 and 430641	T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine)	Gibco	11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium	Cell applications	511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3170	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	Gibco	25080	Use as it is.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Use as it is.
BAMBANKER freezing media	BAMBANKER	302-14681	Use as it is.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red	Gibco	25200-056	Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)	Sigma	T6522	Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid	Sigma	R7632	Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate	Gibco	11995
Bovine Pituitary Extract	Gibco	13028-014	Used for BEGM ALI media.
Nystatin	Sigma	N4014-50 mg	Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100	Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone	StemCell	7904	Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	Use at it is.
Filter flasks (500 ml)	Corning	431097	0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips	Molecular Bioproducts	2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for General remark: always warm the media to room temperature BEGM media 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid (mix them half-half and filter ) 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements digestion of the biopsy BEGM+ media 50 ml BEGM media maintaining cells on plastic in the plates (passage0) 10 μl retinoic acid (working solution) seeding cells in the flask (passage1; partially) maintain the cells in the flask BEGM++ media 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements seeding fresh cells in 12-well plate on plastic 1 ml Sodium BiCarb maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially) 2.5 ml NuSerum seeding cells in the flask (passage1; partially) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Maintaining cells on the transwell before they go ALI 250 ml BEGM including supplements 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution) 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution) 75 μl BSA (10 mg/ml solution) 200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution) 200 μl dissolved hydrocortisone As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts 4250 μl dissolved sodium chloride 540 μl ddH2O 10 μl absolute ethanol Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles PneumaCult-ALI Complete Base Media 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium Base medium for all three PneumaCult-ALI media 50 ml PneumaCult 10x Supplement The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark (this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C) PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)