Культивирование носа человека эпителиальных клеток в Военно-воздушной жидкость

Резюме

Носовые эпителиальные клетки, полученные с помощью поверхностного скрести биопсии добровольцах, расширены и переносят на тканевых культур вставками. По достижении слияния, клетки выращивают в воздух жидкой фаз с получением культур мерцательного и не ресничных клеток. Дифференцированные носовые культуры эпителиальных клеток обеспечивают жизнеспособные экспериментальные модели для изучения слизистой дыхательных путей.

Аннотация

В пробирке моделей с использованием первичные эпителиальные клетки человека имеют важное значение в понимании основных функций дыхательного эпителия в контексте микробных инфекций или вдыхаемых агентов. Прямые сравнения клеток, полученные от больных населения позволяют охарактеризовать различные фенотипы и анализировать основные механизмы посреднические изменения в функции эпителиальных клеток. Культивирование эпителиальных клеток из трахеобронхиального области человеческого была хорошо документирована, но ограничивается наличием человеческих тканей легких или инвазивности, связанных с получением бронхиальных щетки биопсии. Носовые эпителиальные клетки получают через гораздо менее инвазивных поверхностных носовой скрести биопсий и предметы могут быть биопсию несколько раз без существенных побочных эффектов. Кроме того, нос является точкой входа для дыхательной системы и, следовательно, одним из первых сайтов, чтобы быть подвержены всякого рода воздушно-капельной стресс, таких как микробных агентов, загрязняющие вещества, или аллергены.

Вкратце, назальные эпителиальные клетки, полученные от людей-добровольцев расширены на покрытых пластин культуры ткани, а затем переносили на культуре клеток вставками. По достижении слияния, клетки продолжают быть культивированы в воздух и жидкой фаз (ALI), в течение нескольких недель, что создает более физиологически соответствующие условия. Условия культивирования АЛИ использует определенные средства массовой информации, ведущие к дифференцированной эпителия, который проявляет морфологические и функциональные характеристики, аналогичные человеческого носа эпителия, и с ресничками и слизистых клеток, продуцирующих. Культуры ткани вставки с дифференцированной носовых эпителиальных клеток можно манипулировать в различными способами в зависимости от исследовательских вопросов (лечение фармакологических агентов, трансдукции с лентивирусов, воздействие газов или инфекции с микробными агентами) и анализировали на многочисленных различных конечных точек в пределах от клеточные и молекулярные пути, функциональный чАнгелов, морфология и т.д.

В пробирке моделей дифференцированных человека носовых эпителиальных клеток позволит следователям для решения новых и важных вопросов исследования с помощью органотипической экспериментальные модели, в значительной степени имитировать носовой эпителий в естественных условиях.

Введение

Цель методики

Эпителиальные клетки (ECS) в дыхательных путях являются одними из первых сайтов, чтобы быть непосредственно подвергающихся ингаляционных экологического стресса, таких как патогенов, аллергенов или загрязнителей воздуха. ЭК более структурного барьера: Они действуют в качестве щита, чтобы инициировать и регулировать иммунную реакцию дыхательных ^1-3 с помощью выпуска растворимых медиаторов ^4-6 и экспрессии лигандов / рецепторов на их Surfac ^7-9. В то время как увековечена клеточные линии могут быть использованы в качестве моделей для изучения дыхания ECs в пробирке, они не в состоянии дифференцироваться в популяциях гетерогенных клеточных состоящих из поляризованного мерцательного и слизистых клеток, продуцирующих, подобное тому, что наблюдается в естественных условиях. Подводя итог важные характеристики дыхательного эпителия наблюдается в естественных условиях, первичные ЭК дыхательных путей могут быть использованы. Таким образом, наша цель в том, чтобы оптимизировать наш метод с использованием носовой ECS (НИКС), полученный из добровольцах. В NECs расширены и культивировали в пробирке, что дает модель культуры клеток дифференцированных ИЭС которая имитирует многие из особенностей носовом эпителии видели в естественных условиях.

Обоснование

Использование моделей в пробирке с человеческими первичных ЭК, имитирующих в естественных условиях ситуации - как описано в данном исследовании - дает уникальные возможности для изучения заболеваний конкретные различия ECS, физиологические параметры, связанные с эпителия дыхательных путей, или взаимодействия между ЭК и других типов клеток, такие как дендритных клеток ^10, натуральные клетки-киллеры ¹¹ или макрофаги. Несколько существующие методы используют бронхов ECS, которые могут быть получены инвазивно через щеточные биопсии во bronchoscopies, или из иного отбрасываются легочной ткани ^12-17. Кроме того, коммерческие источники для получения полностью дифференцированные дыхательных путей человека культуры эпителиальных клеток существует (EpiAirway модель из Маттек, Ashland, штат Массачусетс, Cloneticsот Lonza, Базеле, Швейцария, MucilAir от Epithelix ОРВИ, Женеве, Швейцария), где следователи могут выбрать из различных доноров. Однако из-за ограниченного пула коммерчески доступных эпителиальных клеток, ограниченных или заданным набором параметров, расходы, связанные с коммерческой получения первичной человеческой дыхательных путей ECS, и ограниченный доступ к отбрасываются легочной ткани или недавно полученной человека бронхиальной биопсии ткани, запретить многих исследователей от проведения исследований в полностью дифференцированных ЭК дыхательных путей человека. Таким образом, мы намерены разработать методику, которая будет 1) использовать неинвазивным полученные человека ИЭС, 2) обеспечить протокол, дающий культуры дифференцированного эпителия дыхательных путей человека, и 3) быть воспроизводимым в большинстве настроек лабораторных с существующей инфраструктуре культуры ткани.

Преимущества по сравнению с существующими методами / модели

Получение свежих ИЭС, по сравнению с бронхов или небольшого дыхательных путей ECS, гораздо менее инвазивной, индивидуальныйс может быть биопсию несколько раз без существенных побочных эффектов, и поверхностные носовые скрести биопсии могут быть проведены в пораженных групп населения, которые иначе не соответствуют требованиям научно-исследовательских связанных bronchoscopies. Неинвазивные поверхностные скрести биопсии для получения ИЭС позволяют следователь установить спецификацию донора априори, в том числе возраст, пол, статус заболевания, и т.д. в соответствии с научно-исследовательской целью быть выполнена. Таким образом, при планировании научных исследований следователи не ограничены клинически доступных тканей / эпителиальные образца, покупать дорогие дифференцированные модели клеточных культур от коммерческих поставщиков, или дизайна инвазивных исследований бронхоскопии. Кроме того, легкость получения ИЭС увеличивает способность проводить эксперименты в клетках от разных доноров, что повышает статистическую проверку наблюдаемых результатов. Наконец, нос является одним из первых сайтов, чтобы подвергаться воздействию любого вида воздушно-капельным путем стресса. Таким образом, создание Органотипической впробирке культуры системы, имитирующие назальный эпителий полезны для изучения вдыхания вирусных частиц, загрязняющих веществ, аллергенов, или газов, которые могут быть легко достигнуты с помощью этой системы клеточной культуре.

протокол

1. Подготовка пластиковая посуда: Пальто плиты

1. Добавить 500 мкл PureCol (1:100 разбавленный стерильной водой) в каждую лунку 12-луночного планшета.
2. Инкубировать при 37 ° С в термостате в течение 30 мин, удалить PureCol и промыть HBSS непосредственно перед клеток добавляли в планшет (см. шаг 3.1 ниже).

2. Получение и предварительной обработки Биопсия человека ИЭС

1. Носовые лом биопсия
   1. Получить поверхностные КЭ, выстилающие носовых раковинах под контролем зрения через 9 мм многоразового полипропилен носовой расширитель (модель 22009) в операционной отоскопа с зеркалах (модель 21700). Это устройство обеспечивает оптимальную визуализацию носовых раковинах и гибкость движения.
   2. Выполните биопсии с предметом, сидящего в вертикальном положении в прямой спинкой с голова наклонена немного назад или лежа в лежачем положении на гинекологическое кресло с.
   3. Вставьте Отоскоп расширитель в ноздрю и уступает TurbiНейт визуализированы с подсветкой.
   4. Вставка стерильный термопластичного кюретки через расширитель с наконечником расширенной дистально к задней части раковины.
   5. Использование мягкое давление на нижней поверхности носовой раковины, кюретка обращается по поверхности слизистой оболочки 5x и отказался. Успешный извлечение клеток слизистой оболочки, проводимых под действием капиллярных сил будет видно в чашке кюреткой.
2. Поместите образец в 15 мл коническую пробирку, содержащую 8 мл RPMI 1640, транспорт на льду.
3. Используйте пинцет для извлечения зонда, выбить ткань от носорога зонда с P-1000 пипетки, отбросить зонд
4. Центрифуга для осаждения (4 ° C, 400 мкг, 5 мин), аспирации супернатант (внимание: тщательное не для аспирации осадок).
5. Ресуспендируют осадок в 1 мл BEGM с 10 мкл ДНКазы 1 100x.
6. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
7. Центрифуга (4 ° С, 400 XG, 5 мин), НЕ аспирации супернатант!

3. SEED Клетки на пластической (день 0)

1. Снимите PureCol от пластины и промыть ССРХ (см. также шаг 1.2).
2. Добавить минимальный объем BEGM + + сред (80-100 мкл, пока мениск носителей не появляется в центре лунку) в 1-4 скважин (в зависимости от размера биопсии) пластины с покрытием.
3. Используйте P-1000 пипеткой осторожно снимите гранулу биопсии ткани из трубы, без аспирационных слишком много средств массовой информации.
4. Перенесите осадок в середину скважин, держать биопсию вместе как группа клеток, и не распадаются сделать суспензии отдельных клеток. Хороший биопсии дает до 4 скважин, которые могут быть посеяны. Поставьте тарелку в культуре ткани инкубаторе (37 ° C, 5% СО _2,> 90% относительной влажности).
5. Проверьте через два часа, чтобы гарантировать, что есть достаточно средств массовой информации (не нарушая мениск).
6. День 1, 24 ч после посева: собрать все неприкрепленных клеток всех скважин (наклона пластины и собирать средства массовой информации с ячеек в P-1000, сСобрать все скважины в 1,5 мл трубки центрифуги).
7. Центрифуга (4 ° C, 400 XG, 5 мин).
8. В то время как центрифугирование клеточной суспензии: добавить около 250 мкл BEGM + + и 250 мкл BEGM + медиа смеси клеток, посеянных на день 0.
9. Повторите шаги 3.1-3.5 для неадгезивных клеток.
10. День 2-5: изменение медиа клеток в день; добавить 500 мкл среды в каждую лунку, уменьшить количество BEGM + + медиа ступенчато (2 день после посева: 125 мкл BEGM + + плюс 375 мкл BEGM +, день3 после посева и в последующие дни: 73 мкл BEGM + + плюс 427 мкл BEGM +).

4. Расширение клетки в контейнерах

1. Монитор клетки ежедневно; как только они достигли 80-90% слияния (обычно 5-7 дней после биопсии, если они занимают больше времени они будут не успешно расти) лифт клетки следующим образом: Тщательно аспирата СМИ; добавить 500 мкл 0,25% трипсина на лунку, держать их при 37 ° С, пока клетки не отделяются (обычно это занимает 2-3 мин).
2. Подготовка необходимостьред объем соевого ингибитора трипсина (SBTI) (750 мкл на 1 мл трипсина) в 15 мл трубки.
3. Выбить клетки, неоднократно пипетки вверх и вниз по раствора трипсина; передачи отдельные клетки в 15 мл коническую трубку с SBTI.
4. Промыть все лунки с в общей 1 мл HBSS, добавьте HBSS к трубе с клетками.
5. Центрифуга для осаждения (4 ° C, 400 мкг, 5 мин), аспирация СМИ, ресуспендируют в 1 мл BEGM + СМИ и вихрь трубку.
6. Развернуть клеток в T25 или T75 колбу в зависимости от размера гранул (это p1; около двух сливающихся скважин идут в одном T75 колбу, один сливной хорошо достаточно, чтобы один T25, как правило, 2 сливные колодцы, доходность одной T75).
   1. Добавить BEGM + в колбы (5 мл каждый для T75, 3 мл каждый для T25).
   2. Добавить клеточной суспензии в колбы. Передача колбы в инкубаторе для тканевых культур.
7. 24 часа в сутки после колбу-посев: добавить дополнительные BEGM + СМИ в колбу (3 мл к T25, 10 мл к T75).
8. поддержания клеток в колбах: Удалить носителя (аспирируйте от угла) и добавьте BEGM + СМИ (5 ml/T25, 20 ml/T75). Средства массовой информации должны быть изменены каждые 2-3 дня. Поддержание клеток в колбе, пока они не около 80% сливной (сплошности не может быть даже в течение всего колбу, обычно это занимает от 7-10 дней; если они не сливающийся через 10 дней они не будут успешно расти).

5. Семенной клеток на тканевой культуры вставками

1. Извлеките носитель из колбы и добавить трипсина (3 мл для T25, 4 мл для T75 колбу).
2. Инкубировать при 37 ° С, пока клетки не отделяются (около 2-3 мин).
3. Подготовка SBTI (750 мкл на 1 мл трипсина> 2,25 мл для T25, 3 мл для T75) в 15 мл трубки.
4. Выбить клетки лентой колбу и пипетки вверх и вниз и трансфер в конической трубе с SBTI.
5. Промойте колбу с HBSS (1 мл для T25, 2 мл для T75), добавьте HBSS в 15 мл трубки.
6. Центрифугадля осаждения (4 ° С, 400 мкг, 5 мин), аккуратно удалите супернатант.
7. Подготовка пластин: решить, сколько тарелок будут посеяны, маркировать таблички с примеров кода и числа, пассаж (т.е. р2) и дата. Добавить 700 мкл BEGM + СМИ к базисной камеры.
8. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл BEGM ALI СМИ встряхиванием трубки.
9. Граф клеток с гемоцитометре (T25 обычно производит около 4 млн. клеток; T75 может иметь до 20 миллионов клеток в зависимости от островка; использовать 1-2 млн. клеток на один 12-луночный планшет) и разбавить клеточной суспензии с BEGM ALI СМИ в общем объеме необходимого на сумму пластин, которые должны быть посеяна (1,2 х 10 ⁶ клеток в 2,5 мл среды на чашку) (Примечание:. Если часть клеток хотите быть заморожены, этикетка трубку и удалить клетки здесь: мы обычно заморозить 2 х 10 ⁶ клеток в 2 мл замораживания средств массовой информации)
10. Добавить 200 мкл суспензии клеток в апикальной стороне каждой непокрытой клетки Corning 12wellвставить (> это будет около 80,000-150,000 клеток / вставка; 12 мм transwells с 0,4 мкм пор полиэстера (Полиэтилентерефталат (ПЭТ)) мембрана вставки); передать в культуре ткани инкубаторе.
11. После 24 часов, изменить верхушечный СМИ (200 мкл расширение средний).
12. Поддержание клеточных культур: Измените СМИ (BEGM АЛИ СМИ; 700 мкл базолатеральная и 200 мкл верхушечный) через день. Вставки должны поддерживаться под флюсом, пока клетки полностью сливающиеся (никаких отверстий в монослоя не могут видеть). В зависимости от количества клеток это обычно занимает от 2-6 дней, если это занимает больше времени клетки, скорее всего, не будет жизнеспособным.

6. Установите Air жидкость только клетки становятся полностью Сливной (когда клетки на Transwells полностью Сливной)

1. Как только клетки полностью сливающиеся замените обе верхушечные и базолатеральных СМИ с BEGM ALI среде с 500 нм ретиноевой кислоты в течение 48 часов.
2. 48 ч после добавления ретиноевой кислоты дополнить BEGM ALI СМИ: Подготовка PneumaCult-ALI поддерживающая среда (перечень поручений по итогам производителя): Рассчитайте объем среды, необходимой (для одной пластины обычно 8,5 мл для базальных отсеков); добавить на 1 мл PneumaCult Полная база Средний :

   10 мкл PneumaCult 100x Дополнение обслуживание
   2 мкл гепарина (из 2 мг / мл маточного раствора)
   5 мкл Гидрокортизон (из 96 мкл / мл маточного раствора).

3. Извлеките все носители и добавить 700 мкл PneumaCult-ALI обслуживания средств массовой информации для базолатеральной стороны только (без средней на апикальной стороне).
4. Поддерживать клеточных культур в течение 4 недель в АЛИ:
   1. Смены носителя через день (понедельник, среда и график пятницу хорошо работает для нас).
   2. Через неделю в АЛИ, один раз в неделю (по средам) верхушечный поверхность промыть: добавить 200 мкл HBSS в апикальной стороны, держать их в течение 10 мин в инкубаторе, тщательно аспирацииHBSS (9 использовать в стеклянной пипетки, присоединенный к вакуумной ловушке в биологической безопасности, используют 200 мкл подсказки на кончике пипетки для всасывания от HBSS).

Примечание: Изменить советы между пластинами, а также изменения советы при переходе от апикальной поверхности по сравнению с базолатеральная. Примерно через 2 недели в АЛИ, клетки начинают дифференцироваться и появляются реснички. Клеточные культуры достичь полного дифференциации примерно через 4 недели на Али.

Результаты

NECs культивировали следующее здесь описано протокол повторного дифференцироваться в гетерогенной слоем ЭК состоит из мерцательного и не ресничных клеток, представляющих ситуацию в естественных условиях (рис. 1). Некоторые из дифференцированных ИЭС являются продуцирующи...

Обсуждение

Респираторные ЭК обеспечить не только физический барьер, чтобы защитить человеческое тело от экзогенного стимулов ^20, но и выступать в качестве щита, чтобы инициировать и регулировать дыхательных ответов иммунной защиты ^1-3 через секреции растворимых медиаторов или прямых ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nasal speculum	Welch Allyn	Model 22009	9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope	Welch Allyn	Model 21700
Rhino probe cell cuvette	Arlington Scientific	SY-96-092	bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates	Corning	3512
Transwell membrane cell culture inserts	Corning	3460
Tissue culture flask	Corning	430639 and 430641	T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine)	Gibco	11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium	Cell applications	511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3170	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	Gibco	25080	Use as it is.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Use as it is.
BAMBANKER freezing media	BAMBANKER	302-14681	Use as it is.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red	Gibco	25200-056	Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)	Sigma	T6522	Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid	Sigma	R7632	Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate	Gibco	11995
Bovine Pituitary Extract	Gibco	13028-014	Used for BEGM ALI media.
Nystatin	Sigma	N4014-50 mg	Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100	Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone	StemCell	7904	Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	Use at it is.
Filter flasks (500 ml)	Corning	431097	0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips	Molecular Bioproducts	2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for General remark: always warm the media to room temperature BEGM media 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid (mix them half-half and filter ) 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements digestion of the biopsy BEGM+ media 50 ml BEGM media maintaining cells on plastic in the plates (passage0) 10 μl retinoic acid (working solution) seeding cells in the flask (passage1; partially) maintain the cells in the flask BEGM++ media 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements seeding fresh cells in 12-well plate on plastic 1 ml Sodium BiCarb maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially) 2.5 ml NuSerum seeding cells in the flask (passage1; partially) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Maintaining cells on the transwell before they go ALI 250 ml BEGM including supplements 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution) 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution) 75 μl BSA (10 mg/ml solution) 200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution) 200 μl dissolved hydrocortisone As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts 4250 μl dissolved sodium chloride 540 μl ddH2O 10 μl absolute ethanol Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles PneumaCult-ALI Complete Base Media 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium Base medium for all three PneumaCult-ALI media 50 ml PneumaCult 10x Supplement The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark (this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C) PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)