エア·液界面での人間の鼻上皮細胞の培養

要約

ヒトボランティアの表面掻き取り、生検により得られた鼻上皮細胞は、組織培養インサートに展開され、転送される。コンフルエントに達したら、細胞は、繊毛および非繊毛細胞の培養物を得、空気液体界面で成長させる。差別化された鼻の上皮細胞培養物は、呼吸器粘膜を研究するための実行可能な実験モデルを提供する。

要約

in vitroモデルヒト初代上皮細胞を用いて、微生物感染または吸入薬のコンテキストで気道上皮の主要な機能を理解する上で不可欠です。病気の集団から得られた細胞の直接比較は、私たちは異なる表現型を特徴づけるし、上皮細胞の機能の変化を仲介する根本的なメカニズムを分析することができます。ヒト気管気管支領域からの上皮細胞を培養することは、十分に文書化されているが、気管支ブラシ生検の取得と関連するヒト肺組織または侵襲性の利用可能性によって制限される。鼻上皮細胞ははるかに低侵襲性表在性鼻擦り生検を介して得られ、被験者は、有意な副作用を複数回生検することができる。さらに、鼻呼吸器系へのエントリポイントであり、したがってそのような抗菌剤として空気中のストレッサーの任意の種類に露出される最初の部位、のいずれか、汚染物質、またはアレルゲン。

簡潔には、ヒトボランティアから得た鼻上皮細胞は、コーティングされた組織培養プレート上に展開し、次に細胞培養インサート上に転写される。コンフルエンシーに達すると、細胞は、より生理学的に関連する条件を作り出す数週間、例えば、気液界面（ALI）で培養され続ける。 ALI培養条件は繊毛と細胞を産生する粘液の両方で、人間の鼻上皮と同様の形態学的および機能的な特徴を示す差別化上皮につながる定義されたメディアを使用しています。分化した鼻上皮細胞と組織培養インサートは研究課題（薬理学的薬剤による治療、レンチウイルスベクター、ガスへの曝露、又は微生物剤の感染による形質導入）に応じて様々な方法で操作さに至るまで、多数の異なるエンドポイントのために分析することができる細胞および分子経路、機能的CHアンジェス、形態など

分化したヒトの鼻上皮細胞の試験管内モデルでは 、主に、生体内で鼻上皮を模倣器官実験モデルを使用して新規で重要な研究課題に対処するために研究者を可能にします。

概要

技術の目的

気道上皮細胞（EC）を直接このような病原体、アレルゲンまたは大気汚染物質などの吸入環境ストレスにさらされる最初の部位の一つである。 ECの構造的障壁を超えている：彼らは可溶性メディエーター^4-6とそのsurfac ^7-9上のリガンド/受容体の発現の解放を経由して、呼吸器、免疫応答^1-3を開始し、制御する交換機として機能します。不死化細胞株は、インビトロでのEC呼吸を研究するためのモデルとして使用することができるが、それらはin vivoで観察されるものと同様の偏極繊毛および粘液産生細胞からなる不均一な細胞集団に分化することができない。 in vivoで観察気道上皮の重要な特性を再現するために、一次気道のECを使用することができる。そのため、私たちの目標は、鼻のEC（NECの）を利用し、本手法を最適化することであったヒトボランティアから得た。 NECのは、インビボで見られる鼻上皮の特徴の多くを模倣するNECの分化の細胞培養モデルを得、 インビトロで増殖培養する。

論理的根拠

生体内の状況に模倣ヒト初代のEC を用いたin vitroモデルの使用は、 -この研究で説明したように- 、病気ECの具体的な違いが、気道上皮に関連する生理的パラメータ、またはECおよび他の細胞型間の相互作用を研究するユニークな可能性を提供しますこのような樹状細胞^10、ナチュラルキラー細胞¹¹やマクロファージなど。いくつかの既存の方法はbronchoscopies中に、またはそうでなければ廃棄された肺組織から^12-17ブラシ生検を介して、侵襲的に得ることができる気管支電気部品を利用する。また、完全に分化したヒト気道上皮細胞培養物を得るための商業的供給源はマテック、アッシュ、MA、Clonetics社から（EpiAirwayモデルが存在調査官は異なるドナーから選択することができますロンザ、バーゼル、スイス、Epithelix SARS、スイスのジュネーブからMucilAir）から。しかし、市販されている上皮細胞の限られたプール、パラメータの限定されたまたは所定の設定、市販の一次ヒト気道のEC、そして廃棄肺組織または新たに採取したヒト気管支生検組織への限定的なアクセスを取得することで、コストの多くの研究者を禁止する完全に分化したヒト気道のECでの研究を行うから。したがって、我々は1）非侵襲的に得られたヒトNECのを利用する技術を開発するために着手し、2）分化したヒト気道上皮の文化をもたらしプロトコルを提供し、3）既存の組織培養インフラのほとんどのラボ設定で、再現性がある。

既存の技術/モデルに比べて利点

気管支や末梢気道のECに比べて、はるかに少ない侵襲的であるように、新鮮なNECの入手方法は、個々のS重大な副作用が複数回の生検することができ、表面的な鼻掻き生検は、そうでなければ、研究関連のbronchoscopiesの対象とならないだろう、罹患集団で行うことができる。 NECのを得るための非侵襲的な表面的な掻き生検は、研究者が達成される研究目的に合わせて年齢 、性別、疾患の状態を含め、 先験的ドナーの仕様を設定することができます。調査研究を設計する際にこのようにして、研究者は、商用ベンダー、またはデザイン侵襲的な気管支鏡検査の研究から、高価な分化した細胞培養モデルを購入し、臨床的に利用可能な組織/上皮試料によって限定されるものではない。また、NECの使いやすさを得るためには、観察された所見の統計的な妥当性を増強する異なるドナーからの細胞で実験を実施する能力を、増加させる。最後に、鼻に空気中のストレッサーの任意の種類に露出された最初のサイトの一つである。このように、 内器官を生成する鼻上皮を模倣するインビトロ培養系は、容易にこの細胞培養系を使用することによって達成することができるウイルス粒子、汚染物質、アレルゲン、又はガスの吸入を研究するために有用である。

プロトコル

1。プラスチックの構造を準備します。コートプレート

1. 12ウェルプレートの各ウェルに500μlのPureCol（滅菌水で希釈1:100）を添加する。
2. 30分間インキュベーター内で37℃でインキュベート、PureColを削除し、細胞をプレートに添加する前にHBSS権で洗い流し（以下のステップ3.1を参照）。

2。取得と人間NECのの前処理生検

1. 鼻掻き生検
   1. 鏡（モデル21700）を持つオペレーティング·オトスコープに9ミリメートル、再利用可能なポリプロピレン製鼻鏡（モデル22009）を通して直視下鼻甲介の内側を覆う表面的なECのを入手します。このデバイスは、鼻甲介と運動の柔軟性の最適な可視化を提供します。
   2. わずかに後方に傾いたり診察台に仰臥位で横たわって頭をまっすぐにバックアップされた椅子に直立座っ対象で生検を行う。
   3. 鼻孔と劣っturbiに耳鏡の鏡を挿入しますネイトは、照明で可視化した。
   4. 鼻甲介の奥まで遠位延長先で鏡を通して無菌熱可塑キューレットを挿入します。
   5. 鼻甲介の下面に穏やかな圧力を使用して、キューレットは、粘膜表面5X渡って描かれ後退する。毛細管現象によって保持粘膜細胞の正常な取得は、キューレットのカップには明らかであろう。
2. のRPMI 1640の8ミリリットル、氷上輸送を含む15ミリリットルコニカルチューブにサンプルを配置します。
3. 、プローブを取得するために鉗子を使用して、P-1000ピペットでRhinoのプローブから組織を取り除く、プローブを破棄
4. 遠心分離機、上清を吸引し（注意：ペレットを吸引しないように注意してください）​​を（4℃、400×gで、5分間）ペレット化する。
5. 100X DNアーゼ1の10μlで1ミリリットルBEGMでペレットを再懸濁します。
6. 室温で20分間インキュベートする。
7. 遠心分離機（4℃、400×gで、5分）、上清を吸引しないでください！

3。 Sプラスチック上EED細胞（0日目）

1. プレートからPureColを削除し、HBSSで洗い流し（も1.2ステップ参照）。
2. （メディアのメニスカスがウェルの中央に表示されるまで、80〜100μL）塗装板の（生検サイズに応じて）1-4ウェルにBEGM +メディアの最小容積を追加します。
3. 慎重にあまりにも多くのメディアを吸引することなく、チューブから生検組織のペレットを除去するために、P-1000ピペットを使用してください。
4. 、井戸の中央にペレットを移し、細胞のクラスタとして一緒に生検を維持し、単一細胞懸濁液を作るために別れるません。播種することができる4つのウェルまでの良好な生検が得られます。組織培養インキュベーター（37℃、5％CO _2、> 90％相対湿度）中にプレートを置く。
5. （メニスカスを乱すことなく）十分なメディアがあることを保証するために、2時間後に確認してください。
6. 1日目は、24時間後に播種：すべてのウェルのすべての非接着細胞を回収（ティルトプレートとP-1000のセルでメディアを集めて、C1.5ミリリットルの遠心管中のすべてのウェルollect）。
7. 遠心分離（4℃、400×gで、5分間）。
8. 細胞懸濁液を遠心分離しながら：0日目に播種した細胞にBEGM + +とBEGM +メディア混合物を250μlの約250μLを加える。
9. 繰り返し、非接着細胞用3.1から3.5を繰り返します。
10. 日2-5：毎日の細胞の変化媒体; BEGM +メディア段階的に（播種後2日目の量減らし、各ウェルに500μlのメディアを追加します。125μLBEGM +プラス375μLBEGM +、播種後3日目と次の日：73 μLBEGM +プラス427μLBEGM +）。

4。フラスコ中の細胞を増殖

1. 日々のセルを監視、彼らは80〜90％の集密度に達すると（彼らは時間がかかる場合には、通常5〜7日の生検後、彼らが正常に成長しない）リフト細胞以下のとおりです。慎重に培地を吸引し、0.25％トリプシン500μlのを追加細胞が剥離するまで、ウェル毎に、（それは通常は2〜3分かかります）、37℃で保管してください。
2. 必要性を準備する15mlチューブ中の大豆トリプシンインヒビター（SBTI）（1ミリリットル当たりトリプシン750μL）のEDの音量。
3. 繰り返しピペッティングトリプシン溶液ダウンによって細胞を取り除く。SBTIで15ミリリットルコニカルチューブを剥離した細胞を移す。
4. 細胞とチューブにHBSSを追加、合計1ミリリットルHBSS中で全てのウェルを洗浄します。
5. 、（4℃、400×gで、5分間）ペレットメディアを吸引し、1ミリリットルBEGM +メディアに再懸濁し、チューブを渦に遠心します。
6. ペレットサイズに応じて、T25やT75フラスコ中の細胞を展開します（これはP1である。約2集密ウェルが1 T75フラスコに入り、1集密よく1、T25には十分ですが、通常は2融合性ウェルは1 T75）を得た。
   1. （T75のための5ミリリットルごとに、T25のための3ミリリットルずつ）フラスコにBEGM +を追加します。
   2. フラスコに細胞懸濁液を追加します。組織培養インキュベーターにフラスコを転送します。
7. 24時間後にフラスコ播種：フラスコ（T75とT25に3ミリリットル、10ミリリットル）に追加BEGM +メディアを追加します。
8. フラスコ中の細胞を維持する：（5 ml/T25、20 ml/T75）メディア（角から吸引）を取り外し、BEGM +メディアを追加します。メディアは、2〜3日ごとに変更する必要があります。彼らは約80％コンフルエントになるまでフラスコ中の細胞を維持する（集密度でも全体のフラスコを通してできない場合があり、通常、これは7〜10日間を要する。彼らは、彼らが正常に成長しない10日後にコンフルエントされていない場合）。

5。組織培養インサート上で細胞を播種

1. フラスコから培地を除去し、トリプシン（T25用3ミリリットル、T75フラスコのための4ミリリットル）を追加します。
2. 細胞が剥離するまで、37℃でインキュベートする（約2〜3分）。
3. 15ミリリットルチューブにSBTI（T25用1ミリリットルのトリプシン> 2.25ミリリットル、T75のための3ミリリットル当たり750μl）を準備します。
4. ダウンフラスコをテーピングし、ピペッティングにより細胞を取り除くとSBTIとコニカルチューブに移す。
5. 15mlチューブにHBSSを加え、HBSS（T25、T75のための2ミリリットルのための1ミリリットル）でフラスコを洗浄します。
6. 遠心分離機（4℃、400×gで、5分間）ペレットにし、上清を注意深く除去します。
7. プレートを準備します。シードされたことを行っているか多くのプレートを決定し、サンプルコードや番号、継代数（ すなわち P2）と日付でプレートにラベルを付ける。基底室に700μLBEGM +メディアを追加します。
8. チューブをボルテックスで1ミリリットルBEGM ALI培地で細胞ペレットを再懸濁します。
9. （T25は通常、約4万個の細胞を生産、T75は、島によっては最大20万個の細胞を持つことができます。1 12ウェルプレートのための細胞の1から2000000を使用してください）​​、血球計数器で細胞をカウントして細胞懸濁液を希釈（プレート当たり2.5ミリリットルのメディアに1.2×10 ⁶細胞）を播種する必要があり、プレートの量のために必要な総容量BEGM ALIメディア（注：細胞の一部を凍結する場合は、チューブにラベルを付け、細胞を除去ここに：我々は通常、メディアの凍結の2ミリリットル中の2×10 ^6個の細胞を凍結する）
10. 各コーティングされていないコーニング12well細胞の頂端側に200μlの細胞懸濁液を追加挿入（>これは約80,000〜150,000個/挿入されます。0.4ミクロンの細孔のポリエステル（ポリエチレンテレフタレート（PET））メンブレンインサート付き12mmのトランスウェル）は、組織培養インキュベーターに移す。
11. 24時間後、頂端メディア（200μlの増殖培地）を変更。
12. 細胞培養の維持：（BEGM ALI媒体、700μlの基底外側および200μlの頂端）メディアを変更日おきに。インサートは、細胞が（単層に穴が見えない）、完全にコンフルエントになるまで水没維持されなければならない。それは、細胞が最も可能性の高い実行可能ではありません長い時間がかかる場合は、細胞数に依存し、これは通常、2〜6の間で日かかります。

6。エア·液界面を確立する（トランスウェル上の細胞が完全にコンフルエントのとき）一度細胞が完全にコンフルエント

1. 細胞が完全にコンフルエントになったら48時間500nMのレチノイン酸を補給しBEGM ALIメディアの両方先端および基底外側のメディアを交換してください。
2. レチノイン酸を添加した後の48時間はBEGM ALIメディアを補足：PneumaCult-ALI 維持培地（以下、メーカーの説明書）を準備します（基礎コンパートメントの通常8.5ミリリットル1版用）に必要な媒体の体積を計算し、1ミリリットルあたりの追加完全基礎培地をPneumaCult ：

   10μLPneumaCult 100X保守サプリメント
   （2 mg / mlの保存溶液）2μlのヘパリン
   （96μL/ mlの保存溶液）5μLヒドロコルチゾン。

3. すべてのメディアを削除し、基底外側のみ（頂端側の無培地）に700μlのPneumaCult-ALI保守メディアを追加。
4. ALIで4週間の細胞培養を維持する。
   1. （月曜日、水曜日と金曜日のスケジュールは私たちのためにうまく動作します）一日おきにメディアを変更。
   2. ALIの1週間後、一週間（水曜日）、一度先端表面を洗浄されています慎重に吸引し、培養器で10分のためにそれらを保つため、頂端側に200μlのHBSSを追加HBSSを（HBSSをオフに吸引するピペットの先端に200μLのヒントを使用して、生物学的安全キャビネット内の真空トラップに付着したガラスピペット内の9を使用します）。

注意：変更板間のヒントだけでなく、側底対頂端面から行くときのヒントを変更する。 ALIで約2週間後、細胞は分化し始めると、繊毛が表示される。細胞培養は、ALIで約4週間後に完全な差別化を達成。

結果

NECのは、ここで説明するプロトコルは、生体内の状況（ 図1）を表す繊毛と非繊毛細胞から構成されるECの異質層に再差別次培養した。差別化NECののいくつかは、（AB / PAS、 図1Bを用いた青色に染色細胞）を産生する粘液である。ここで紹介するプロトコルが最適化されるにもかかわらず、全体的な分化は、細胞集団（：粘液産生細胞：繊毛細胞、すなわち<...

ディスカッション

呼吸のECは、外因性の刺激²⁰から人体を保護するだけでなく、可溶性メディエーターまたは直接受容体-リガンドの細胞-細胞相互作用の分泌を介して開始し、呼吸器、免疫防御応答を^1-3に調節するための配電盤として作用する物理的障壁だけを提供する。さらに、免疫応答におけるECの役割を研究するための病気の集団からの電気部品間の電位差を調べるために、又は電気部品?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nasal speculum	Welch Allyn	Model 22009	9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope	Welch Allyn	Model 21700
Rhino probe cell cuvette	Arlington Scientific	SY-96-092	bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates	Corning	3512
Transwell membrane cell culture inserts	Corning	3460
Tissue culture flask	Corning	430639 and 430641	T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine)	Gibco	11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium	Cell applications	511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3170	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	Gibco	25080	Use as it is.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Use as it is.
BAMBANKER freezing media	BAMBANKER	302-14681	Use as it is.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red	Gibco	25200-056	Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)	Sigma	T6522	Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid	Sigma	R7632	Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate	Gibco	11995
Bovine Pituitary Extract	Gibco	13028-014	Used for BEGM ALI media.
Nystatin	Sigma	N4014-50 mg	Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100	Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone	StemCell	7904	Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	Use at it is.
Filter flasks (500 ml)	Corning	431097	0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips	Molecular Bioproducts	2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for General remark: always warm the media to room temperature BEGM media 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid (mix them half-half and filter ) 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements digestion of the biopsy BEGM+ media 50 ml BEGM media maintaining cells on plastic in the plates (passage0) 10 μl retinoic acid (working solution) seeding cells in the flask (passage1; partially) maintain the cells in the flask BEGM++ media 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements seeding fresh cells in 12-well plate on plastic 1 ml Sodium BiCarb maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially) 2.5 ml NuSerum seeding cells in the flask (passage1; partially) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Maintaining cells on the transwell before they go ALI 250 ml BEGM including supplements 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution) 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution) 75 μl BSA (10 mg/ml solution) 200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution) 200 μl dissolved hydrocortisone As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts 4250 μl dissolved sodium chloride 540 μl ddH2O 10 μl absolute ethanol Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles PneumaCult-ALI Complete Base Media 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium Base medium for all three PneumaCult-ALI media 50 ml PneumaCult 10x Supplement The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark (this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C) PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)