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Resumen

Se presenta un método para la rápida inmovilización reversible de moléculas pequeñas y las asambleas de nanopartículas funcionalizadas de resonancia de plasmones superficiales (SPR) los estudios, utilizando secuencial en el chip de captura química cicloadición bioorthogonal y anticuerpo-antígeno.

Resumen

Los métodos para la inmovilización de superficie rápida de pequeñas moléculas bioactivas con el control sobre la orientación y densidad de inmovilización son altamente deseables para aplicaciones de biosensores y de microarrays. En este estudio, utilizamos una bioorthogonal altamente eficiente covalente [4 +2] reacción de cicloadición entre trans-cicloocteno (TCO) y 1,2,4,5-tetrazina (Tz) para permitir la inmovilización de microfluidos de moléculas derivatizadas-Tz TCO / . Supervisamos el proceso en tiempo real bajo condiciones de flujo continuo utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR). Para permitir la inmovilización reversible y ampliar la gama experimental de la superficie del sensor, se combinan un componente de captura de antígeno-anticuerpo no covalente con la reacción de cicloadición. Al presentar alternativamente restos TCO o Tz a la superficie del sensor, múltiples procesos de captura-cicloadición son ahora posibles en una superficie del sensor de montaje y de interacción on-chip de estudios de una variedad de estructuras de componentes múltiples. Nos illustrate este método con dos experimentos diferentes de inmovilización en un chip biosensor; una molécula pequeña, AP1497 que se une la proteína de unión a FK506-12 (FKBP12), y la misma molécula pequeña como parte de una nanopartícula in situ-funcionalizado inmovilizado y en.

Introducción

Reacciones de conjugación eficientes son herramientas valiosas para la fijación de moléculas bioactivas a las superficies para una variedad de aplicaciones de la biotecnología. Recientemente, el bioorthogonal muy rápido [4 2] de reacción de cicloadición entre trans-cicloocteno (TCO) y 1,2,4,5-tetrazina (Tz) se ha utilizado para etiquetar superficies de las células, estructuras subcelulares, anticuerpos y nanopartículas 1. - 7 Aquí, utilizamos el [4 +2] reacción de cicloadición en combinación con la captura de antígeno / anticuerpo (GST / anti-GST) para reversible la síntesis en el chip de estructuras de componentes múltiples para resonancia de plasmones superficiales (SPR) análisis de la interacción y monitoreamos la proceso en tiempo real (Figura 1). 8,9 En particular, la estrategia de captura-cicloadición permite la regeneración de la superficie utilizando un protocolo establecido. 8 Como consecuencia de ello, el conjunto de superficies de sensor estables con control sobre la orientación y densidad de ligando para la variedad de nuevo ensayo formatos es ahora posible. Usoesta estrategia demostramos la inmovilización de pequeñas moléculas derivatizadas-Tz TCO / y caracterizar los tipos de cicloadición en una variedad de condiciones de tampón. Elegimos la conocida interacción entre FKBP12 y un AP1497 molécula que se une a FKBP12 10-12 como un ejemplo para verificar que la estrategia de captura-cicloadición conserva la capacidad de la molécula pequeña para interactuar con su objetivo cuando ya sea directamente unido a los antígenos inmovilizados de GST o nanopartículas inmovilizadas (NPS).

Este método ofrece varias ventajas. En primer lugar, la inmovilización reversible de moléculas pequeñas en chips sensores es ahora posible. En segundo lugar, TCO / Tz inmovilización de moléculas pequeñas también permite estudios de interacción de marca libre que revierten la orientación de los estudios SPR canónicas, y puede proporcionar una visión complementaria de una interacción de unión. En tercer lugar, este método permite la síntesis de microfluidos de nanopartículas dirigidas, y la evaluación inmediata de su bindinpropiedades g. Esto promete mejorar la eficiencia de la evaluación o prueba de nanopartículas específicas, y también disminuir las cantidades de nanopartículas requeridos. 13-15 En cuarto lugar, este enfoque puede medir la cinética de reacción de reacciones de cicloadición bioorthogonal en tiempo real en un flujo continuo. Finalmente, la inmovilización química TCO / Tz es robusto en presencia de suero. Tomados en conjunto, podemos anticipar que este enfoque versátil ampliamente facilitar la construcción de superficies de sensor estables para una amplia variedad de estudios de microfluidos con relevancia para in vitro y en aplicaciones celulares in vivo.

Protocolo

1. Preparación de GST y nanopartículas (NP) Conjugados

  1. Preparación GST-TCO:
    1. Añadir 8 l de solución de TCO-NHS (50 mM en DMSO) a 100 l de GST (1 mg / ml en PBS) y agitar la mezcla a TA durante 1 h.
    2. Retire el exceso de reactivo utilizando una columna de desalado giro Zeba. El filtrado recuperado que contiene el conjugado de GST-TCO se almacena a 4 ° C antes de su uso.
  2. Preparación GST-Tz:
    1. Añadir 6 l de solución de Tz-NHS (25 mM en DMF) a 75 l de GST (1 mg / ml en PBS) y agitar la mezcla a TA durante 1 h.
    2. Se diluye la mezcla de reacción con 25 l de PBS y se purifica usando una columna de desalación de centrifugado. El filtrado que contiene el conjugado de GST-Tz se almacena a 4 ° C antes de su uso.
    Nota: Los análisis de masas (MALDI-TOF) mostraron que, en promedio ~ 10 Tz o TCO moléculas se conjugaron con GST.
  3. Preparación NP-TCO:
    1. Añadir 100 l de solución de TCO-NHS (50 mM en DMSO) a150 l de nanopartículas aminado (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml en PBS, núcleo de hierro 3 nm ~ 8000 Fe / NP) y agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora.
    2. Eliminar el exceso de reactivo por filtración de gel utilizando una columna NAP-10 se eluyó con tampón PBS. Recoger la banda de color que contiene el producto NP-TCO.
    3. Se concentra el filtrado a un volumen final de ~ 150 l utilizando un dispositivo de filtro centrífugo (100 k MWCO).
    4. Añadir 50 l de anhídrido succínico, (0,1 M en DMSO) a la solución de NP-TCO y agitar a TA durante 1 h (anhídrido reacciona con cualquier amina restantes para formar ácidos carboxílicos terminales. Esto evita las interacciones no específicas con la superficie de dextrano).
    5. Se purifica el producto NP-TCO utilizando una columna NAP-10 eluyendo con PBS. Almacenar la solución de NP-TCO a 4 ° C antes de su uso.

2. Preparación de la superficie

Todos los ensayos de resonancia de plasmón superficial se realizaron en un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) en25 ° C utilizando un chip sensor CM5 y PBS-P como el tampón de desplazamiento a menos que se indique lo contrario. Control de Biacore y la evaluación de software suministrado con el instrumento se emplean para la creación de experimentos y análisis de datos. Dos modos de funcionamiento, asistentes para aplicaciones y ejecución manual se utilizarán para la preparación y el seguimiento de superficie en el chip de captura-cicloadición. El modo de método de constructor se utiliza para la creación de experimentos de unión orientación inversa y para la medición de las velocidades de reacción de cicloadición. Los datos son doble referencia resta y los análisis cinéticos se realizó con un modelo de unión de Langmuir 1:1.

  1. Utilice la plantilla de asistente inmovilización amina y seleccione la inmovilización de células de flujo 1 (referencia) y 2 (de detección). Modificar método de amina para activar los grupos carboxílicos de la superficie por inyección de una solución 1:1 de 0,4 M de EDC: NHS 0,1 M de 480 segundos a una velocidad de flujo de 10 l / min. Establezca la inyección de etanolamina para extinguir restantes ésteres activados a 420 seg tiempo de contacto enuna velocidad de flujo de 10 l / min.
  2. Nombre de entrada de ligando, anti-GST (18 g / ml en tampón de acetato, pH 5,0) y se puso a inyectar para un tiempo de contacto de 420 segundos a una velocidad de flujo de 10 l / min.
  3. Coloque los viales solución necesarias en el reactivo de rack 2 asegurándose de hacer coincidir las posiciones con la lista de contenidos. Guardar e iniciar la inmovilización.
    Nota: Al ejecutar el Asistente para la inmovilización de esta manera da como resultado niveles de inmovilización anti-GST en el rango de 14.000 a 17.000 ~ RU.
  4. Edite el asistente de inmovilización sólo para inyectar ligando GST solución (20 mg / ml) durante 420 segundos a 5 l / min a través de células de flujo de referencia 1.

3. Monitoreo on-chip de captura-cicloadición de moléculas funcionalizadas

  1. Monitoreo en el chip de captura-cicloadición en tiempo real (Figura 2).
    1. Coloque GST-TCO (20 g / ml), Tz-BnNH 2 (10 mM) y la regeneración (glicina 10 mM, pH = 2,0) en viales de solución de reactivo bastidor 2. Seleccionar el hombremétodo de ejecución manual, ajuste el caudal de 5 l / min y la ruta de flujo de flujo de células 2.
    2. Inyectar la solución de GST-TCO para 420 sec.
    3. Inyectar la solución de Tz-BnNH 2 de 600 seg.
    4. Regenera la superficie con dos inyecciones de 30 seg de solución de regeneración.
  2. Supervisión de montaje en el chip de estructuras de componentes múltiples, en tiempo real (Figura 3):
    1. Coloque GST-Tz (20 g / ml), NP-TCO (100 mg Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 mM) y la regeneración (glicina 10 mM, pH = 2,0) en viales de solución de reactivo bastidor 2. Seleccione el instrumento método run manual, ajuste la velocidad de flujo de 5 l / min y la trayectoria del flujo de Celda de flujo 2.
    2. Inyectar una solución de GST-Tz durante 60 segundos.
    3. Inyectar una solución de NP-TCO durante 60 segundos.
    4. Inyectar una solución de Tz-BnNH 2 durante 60 segundos.
    5. Regenera la superficie con dos inyecciones de 30 seg de solución de regeneración.

4. MONITOREO Densidad Inmovilización y Determinación de cicloadición Precios

  1. Caracterización de pequeñas velocidades de reacción de cicloadición de moléculas (Figura 4).
    1. Seleccione los nuevos parámetros generales de método y de entrada. En el panel de las etapas del ensayo crear un nuevo paso y el nombre de la muestra. Establecer el propósito y Conecte ajustes de la base a la Muestra.
    2. En el panel Tipos de ciclo Crea un nuevo paso del ciclo e introducir los siguientes comandos; Capture, Muestra, Regeneración 1 y Regeneración 2.
    3. Seleccione el comando de captura, el nombre ligando entrada (GST-TCO, 20 mg / ml), el tiempo de contacto 120 seg a 5 l / min y la trayectoria del flujo se establece en: Segundo. Seleccione el comando de muestra; entrada 180 tiempo de contacto seg, 60 seg tiempo de disociación, el caudal de 30 l / min y la trayectoria del flujo se establece en: Ambos. Seleccione el comando de regeneración 1, el nombre de la solución de regeneración de entrada (10 mM glicina-HCl pH 2,0), tiempo de contacto de 30 segundos a 30 l / min y la trayectoria del flujo se establece en: Segundo. Repita lo mismo para la regeneración de comandos 2.
    4. Seleccione Configuración Ejecutar y trayectoria del flujo se establece en: 2-1. Seleccionar la siguiente lista y llenar la muestra con una solución de analito (Tz-BnNH 2) y serie de concentraciones (0,3-10 M, dilución 1:2). Seleccione junto al panel de rack de posición. Lugar de soluciones en viales de reactivo bastidor 2 y la serie de dilución en placa de 96 pocillos asegurándose de hacer coincidir las posiciones con la lista de contenidos. Guardar plantilla método y comenzar ensayo de unión. Los datos de unión y análisis cinético se muestran en la Figura 4.
  2. Caracterización de las velocidades de reacción de cicloadición NP (Figura 4).
    1. Abra la plantilla de método salvado de arriba y cambiar los siguientes parámetros. Seleccione el panel Captura, cambio de nombre ligando a GST-Tz, 20 mg / ml. Seleccione el panel de la muestra, el cambio de tiempo de contacto de 120 segundos de tiempo de contacto y el tiempo de disociación a 120 seg.
    2. Seleccione la lista de muestra; cambiar analito serie de concentraciones (7-224 nM, dilución 1:2) NP-TCO y. Viales Place de soluciones en el rack de reactivos2 y la serie de dilución en placa de 96 pocillos asegurándose de hacer coincidir las posiciones con la lista de contenidos. Guardar plantilla método y comenzar ensayo de unión. Los datos de unión y análisis cinético se muestran en la Figura 4.

5. La medición de la unión de FKBP12 a AP1497 inmovilizado

Los estudios de unión-orientación inversa emplean FKBP12 como el analito y AP1497 compuesto como ligando inmovilizado (Figura 5). El método general para este ensayo se configura de la siguiente manera con la función método constructor:

  1. Seleccione los nuevos parámetros generales de método y de entrada. En el panel de las etapas del ensayo crear y pasos nombre de Captura, muestra y la regeneración. Seleccione Propósito correspondiente y Conecte ajustes de la base.
  2. Seleccione el panel Tipos de ciclo y de crear 3 etapas del ciclo: Captura, muestra y la regeneración.
  3. Introduzca el comando de captura en dos ocasiones en la etapa del ciclo de captura. Seleccione la captura de 1 panel y seleccione la solución de captura como variablE, establecer el tiempo de contacto a 300 segundos a una velocidad de flujo de 5 l / min y trayectoria de flujo se establece en: Segundo. Seleccione el panel de captura 2 y seleccione la solución de captura como variables, establecer el tiempo de contacto de 250 segundos a un caudal de 5 l / min y la trayectoria del flujo se establece en: Segundo.
  4. Introduzca el comando de muestra bajo el paso del ciclo de la muestra. Seleccione el panel de muestra, conjunto de tiempo de contacto de 60 segundos, tiempo de disociación de 200 segundos a un caudal de 30 l / min y la trayectoria del flujo se establece en: Ambos.
  5. Introduzca el comando Regeneración dos veces bajo el paso del ciclo de regeneración. Seleccione el panel de regeneración 1, el nombre de la solución de regeneración de entrada (10 mM glicina-HCl pH 2,0), tiempo de contacto de 30 segundos a 30 l / min y la trayectoria del flujo se establece en: Segundo. Repita lo mismo para el panel de la regeneración 2.
  6. Seleccione Configuración Ejecutar y trayectoria del flujo se establece en: 2-1. Seleccione próximos y para entrar los nombres de soluciones de captura, nombre de la muestra (FKBP12), serie de concentraciones (0,020 a 5 mg / ml, dilución 1:2) (GST-TCO y AP1497-Tz) y MW (13.000). Viales Place de soluciones en reAgent bastidor 2 y la serie de dilución en placa de 96 pocillos asegurándose de hacer coincidir las posiciones con la lista de contenidos. Guardar plantilla método y comenzar ensayo de unión. Los datos del análisis cinético se muestran en la Figura 5.

6. La medición de la unión de FKBP12 a AP1497 Adjunto a Inmovilizados NPs

El método general para la inmovilización de nanopartículas, pequeña derivación molécula y ensayo de unión de FKBP12 es puesta en marcha de la siguiente manera con la función método constructor:

  1. Abra la plantilla de método salvado de arriba y modificar. Inserte un comando adicional Capture en el paso del ciclo de captura. Seleccione la captura el 1 panel; desmarque solución de captura como variable y nombre de la solución de captura de 1 (GST-Tz). Conjunto de tiempo de contacto a 60 segundos a una velocidad de flujo de 5 l / min y trayectoria de flujo ajustado en la segunda. Seleccione el panel Captura 2; desmarque solución de captura como solución de captura y nombre de variable 2 (NP-TCO). Tiempo de contacto establecido en 90 segundos a un caudal de 5 l / min ytrayectoria de flujo se establece en segundos. Seleccione la captura de 3 paneles, anule la selección de la solución de captura como solución de captura y nombre de variable 3 (AP1497-Tz). Tiempo de contacto Set de 180 segundos a un caudal de 5 l / min y la vía de flujo ajustado en segundo lugar.
  2. Seleccione Configuración Ejecutar y trayectoria del flujo se establece en: 2-1. Seleccionar el siguiente dos veces. Lugar de soluciones en viales de reactivo bastidor 2 y la serie de dilución en placa de 96 pocillos asegurándose de hacer coincidir las posiciones con la lista de contenidos. Guardar plantilla método y comenzar ensayo de unión. Los datos del análisis cinético se muestran en la Figura 5.

Resultados

Los datos y las cifras han sido adaptados de referencia 8.

Inmovilización reversible eficiente de pequeñas moléculas bioactivas con el control sobre la orientación y la densidad juega un papel clave en el desarrollo de nuevas aplicaciones de biosensores. El uso de la reacción bioorthogonal rápida entre el TCO y Tz, se describe un método para el montaje paso a paso y la regeneración de las superficies de ligando con retención de la actividad biológica. Figura 2 mues...

Discusión

El método de captura-cicloadición aquí descrito permite una rápida inmovilización reversible de las nanopartículas modificadas y pequeñas moléculas para la interacción basada en el chip sin etiquetas y los estudios cinéticos. El protocolo de inmovilización se puede realizar en minutos que requieren <10 M concentraciones de ligandos de molécula pequeña. Mediante la modulación de la concentración de ligando y densidades de inmovilización de tiempo de contacto puede estar estrechamente controlado. Nuestr...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Reconocemos la financiación de los NIH (NHLBI Contrato No. HHSN268201000044C a RW, SH y SYS).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Sensor Chip CM5GE HealthcareBR-1005-30 
Amine coupling kitGE HealthcareBR-1000-50 
GST capture kitGE HealthcareBR-1002-23 
NAP-10 ColumnsGE Healthcare17-0854-01 
GST, lyophilized in 1X PBSGenscriptZ020391 mg/ml
rhFKBP12R&D Systems3777-FK 
Surfactant P-20GE HealthcareBR-1000-54 
Glycine 2.0GE HealthcareBR-1003-55 
Zeba spin desalting columnThermo898827 K MWCO
Amicon Ultra 4FisherUFC810096100 K centrifugal filter
TCO-OHRef. 8Synthesized in-house
TCO-NHSRef. 8Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2Ref. 8Synthesized in-house
Tz-NHSRef. 8764701Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2Ref. 8Synthesized in-house
AP1497, AP1497-TzRef. 8Synthesized in-house
Equipment
SPR BiosensorGE HealthcareBiacore T100 

Referencias

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