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요약

우리는 순차적으로 온 - 칩 bioorthogonal 사이클로 화학 및 항체 - 항원 캡처를 사용하여 작은 분자의 빠른 가역적 고정화 및 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 연구를위한 기능화 나노 입자 어셈블리에 대한 방법을 제시한다.

초록

방향과 고정 밀도 제어와 생체 활성 작은 ​​분자의 빠른 표면 고정화하는 방법은 바이오 센서 및 마이크로 어레이 응용 프로그램에 매우 바람직하다. 이 연구에서, 우리는 TCO / TZ-유도체 분자의 미세 고정을 가능하게하는 매우 효율적인 공유 bioorthogonal 트랜스 - 옥텐 (TCO) 사이 [4 +2] 고리 화 반응 및 1,2,4,5 - 테트라 (Tz 일)를 사용 . 우리는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 연속적인 유동 조건에서 실시간으로 프로세스를 모니터링한다. 리버시블 고정화를 활성화 센서 표면의 실험 범위를 확장하기 위해, 우리는 고리 화 반응과 비공유 항원 항체 캡처 컴포넌트를 배합. 교대 센서 표면에 TCO 또는 Tz 일 잔기를 제시함으로써, 다 캡처-사이클로 공정은 다 성분 다양한 구조의 온 - 칩 어셈블리와 상호 작용 연구를 위해 하나의 센서면에 지금은 가능하다. 우리 나작은 분자, FK506 결합 단백질 12 (FKBP12)를 결합 AP1497, 2 개의 바이오 센서 칩에 다른 고정화 실험으로이 방법을 llustrate과 같은 작은 분자 고정화에 현장 기능화 나노 입자의 일환으로.

서문

효율적인 결합 반응은 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 표면에 생체 활성 분자를 연결하는 중요한 도구입니다. 최근 매우 빠른 bioorthogonal 트랜스 - 옥텐 (TCO) 사이 [4 +2] 고리 화 반응 및 1,2,4,5 - 테트라 (Tz 일)은 세포 표면, 세포 내 구조, 항체 및 나노 입자를 레이블로 사용 된 1. - 여기에 7, 우리는 표면 플라스 몬 공명 (SPR)의 상호 작용 분석을위한 다 성분 구조의 가역적 인 온 - 칩 합성 항원 / 항체 캡처 (GST / 안티 GST)와 함께 [4 +2] 고리 화 반응을 사용하여 모니터 실시간 프로세스 (그림 1). 새로운 분석의 다양한 리간드의 방향과 밀도를 제어 안정 센서 표면의 결과, 어셈블리로 8,9 특히, 캡처 - 사이클로 전략 수립 프로토콜을 사용하여 표면의 재생을 가능하게한다. 8 형식은 지금 가능합니다. 사용이 전략은 우리는 TCO / TZ-유도 된 작은 분자의 고정화를 설명하고 버퍼 다양한 조건에서 사이클로 속도를 특징. 우리는 직접 고정 된 GST 항원에 부착 할 때 캡처 - 사이클로 전략 목표와 상호 작용하는 작은 분자의 기능을 유지하는지 확인하기 위해 예를 들어 FKBP12 10-12 바인딩 FKBP12 및 분자 AP1497의 잘 알려진 상호 작용을 선택했다 또는 고정 된 나노 입자 공단에.

이 방법은 여러 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 센서 칩에 작은 분자의 가역적 고정이 가능하게되었습니다. 둘째, 작은 분자의 TCO /는 TZ 고정화는 정식 SPR 연구의 방향을 반전 라벨없는 상호 작용의 연구를 가능하게하고, 결합 상호 작용의 상보적인 뷰를 제공 할 수있다. 셋째,이 방법은 대상 나노 입자의 미세 합성, 그들의 bindin의 즉각적인 평가를 가능하게G 속성. 이는 대상 입자를 평가하거나 선별 효율을 향상시키고, 또한 필요한 나노 입자의 양을 감소 약속한다. 넷째 13-15,이 방법은 연속 흐름 하에서 실시간 bioorthogonal 고리 화 반응의 반응 속도를 측정 할 수있다. 마지막으로, TCO /는 TZ 고정화 화학 혈청의 존재하에 강력하다. 이와 함께, 우리는이 다양한 접근 방식은 크게 생체 외 및 생체 내 세포의 응용 프로그램에서의 관련성과 미세 유체 연구의 다양한 안정 센서 표면의 구축을 용이하게 할 것으로 예상.

프로토콜

1. GST 및 나노 입자 (NP) 결합체의 제조

  1. GST-TCO 준비 :
    1. GST (PBS에 1 ㎎ / ㎖)의 100 μL로 TCO-NHS 솔루션의 8 μL (DMSO에 50 mm)를 추가하고 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔들어.
    2. Zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 과량의 시약을 제거합니다. GST-TCO 복합체를 포함하는 복구 여과 액을 사용하기 전에 4 ° C에 저장됩니다.
  2. GST-는 TZ 준비 :
    1. GST (PBS에 1 ㎎ / ㎖)의 75 μL에 TZ-NHS 용액을 6 μL (DMF 25 mm)를 추가하고 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔들어.
    2. PBS 25 μL로 반응 혼합물을 희석하고 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 정제. GST-는 TZ 접합체를 포함하는 여과 액을 사용하기 전에 4 ° C에 저장됩니다.
    참고 : 질량 분석 (MALDI-TOF)이 평균 10 ~ Tz 일 또는 TCO 분자가 GST에 접합 된 것으로 나타났다.
  3. NP-TCO 준비 :
    1. 에 TCO-NHS 용액 100 μL (DMSO에 50 mm)를 추가150 아미 노화 나노 입자 (NP-NH 2, PBS에 8.7 밀리그램 철 / ㎖, 3 nm의 철심 ~ 8,000 페 / NP)의 μL와 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔들어.
    2. PBS 버퍼로 용출 NAP-10 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 과잉 시약을 제거합니다. NP-TCO 제품을 포함하는 컬러 밴드를 수집합니다.
    3. 원심 분리 필터 장치 (100 K MWCO)를 이용하여 ~ 150 μL의 최종 부피로 여과 액을 농축.
    4. NP-TCO 용액에 숙신산 무수물 50 μL, (DMSO 중 0.1 M)를 첨가하고 1 시간 동안 RT에서 동요 (무수물 단자 카르 복실 산을 형성하기 위해 남아있는 아민들과 반응한다.이 덱스 트란 표면에 비특이적 상호 작용을 방지한다).
    5. PBS로 용출 NAP-10 컬럼을 사용하여 NP-TCO 생성물을 정제 하였다. 사용하기 전에 4 ° C에서 NP-TCO의 솔루션을 저장합니다.

2. 표면 처리

모든 표면 플라즈몬 공명 분석법에 비아 코어 T100 악기 (GE 헬스 케어)에서 수행됩니다25 ° C는 실행 버퍼로 CM5 센서 칩과 PBS-P를 사용하여 별도의 언급이없는 한. 악기와 함께 제공되는 비아 코어 제어 및 평가 소프트웨어는 실험을 설정하고 데이터를 분석에 이용된다. 두 가지 동작 모드, 응용 프로그램 마법사 및 수동 실행은 표면 처리 및 모니터링 온칩 캡처 - 사이클로 사용됩니다. 방법 빌더 모드는 역방향 방향 결합 실험을 설치와 고리 화 반응 속도를 측정하는데 사용된다. 데이터를 두 번 참조 감산 및 운동 분석이 1:1 랭 뮤어 결합 모델을 사용하여 수행됩니다.

  1. 흐름 세포에 아민 고정화 마법사 템플릿을 선택 고정 1 (참조), 2 (검출)를 사용합니다. 0.4 M EDC의 1:1 용액을 주입하여 표면 카르 복실 그룹을 활성화하는 방법을 수정 아민 : 480 초 동안 0.1 M NHS를 10 μL / 분의 유속. 에서 420 초 접촉 시간에 남아있는 활성 에스테르를 해소하기 위해 에탄올의 주입을 설​​정10 μL / 분의 유속.
  2. 입력 리간드 이름, 항-GST (아세테이트 완충액, pH 5.0으로 18 μg / ㎖) 및 10 μL / 분의 유속으로 420 초 접촉 시간 동안 주입 세트.
  3. 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하는 시약 랙 2에 필요한 솔루션 튜브를 놓습니다. 저장 및 고정화를 시작합니다.
    참고 : ~ 14,000 17,000 RU의 범위에서 안티 GST 고정화 수준에서이 방식으로 결과에 고정화 마법사를 실행합니다.
  4. 참고 흐름 전지 (1)에 5 μL / 분에서 420 초 (20 ㎍ / ml) 용액을 GST 리간드를 주입​​하는 고정 마법사를 편집합니다.

3. 기능화 분자의 모니터링에 칩 캡처 - 사이클로

  1. 온칩 실시간으로 캡처 - 사이클로 (그림 2) 모니터링.
    1. GST-TCO (20 ㎍ / ㎖), TZ-BnNH 2 (10 μM) 및 재생 (10 mM의 글리신, pH가 2.0) 시약 랙 2 솔루션 튜브를 놓습니다. 사람을 선택연간 실행 방법은 5 μL / 분으로 유량을 설정하고 셀 2 흐름 경로를 흐른다.
    2. 420 초 동안 GST-TCO의 솔루션을 주입한다.
    3. 600 초 동안 TZ-BnNH 2 용액을 주입한다.
    4. 재생 용액의 두 개의 30 초 주사하여 표면을 재생.
  2. 리얼 타임 (그림 3)의 다 성분 구조의 온 - 칩 어셈블리를 모니터링 :
    1. GST-Tz 일 (20 ㎍ / ㎖), NP-TCO (100 μg 철 / ㎖), TZ-BnNH 2 (10 μM) 및 재생 (10 mM의 글리신, pH가 2.0) 시약 랙 2 솔루션 튜브를 놓습니다. 악기 수동 운전 방법을 선택, 셀 2 흐름에 5 μL / 분 유로에 유량을 설정합니다.
    2. 60 초 동안 GST-Tz 일의 용액을 주입한다.
    3. 60 초 동안 NP-TCO의 솔루션을 주입.
    4. 60 초 동안 TZ-BnNH 2 용액을 주입한다.
    5. 재생 용액의 두 개의 30 초 주사하여 표면을 재생.

4. 엠사이클로 환율의 고정화 밀도 및 결정을 onitoring

  1. 작은 분자 고리 화 반응 속도 (그림 4)의 특성.
    1. 새로운 방법 및 입력 일반 매개 변수를 선택합니다. 분석 단계 패널에서 새로운 단계로 이름 샘플을 만들 수 있습니다. 목적을 설정하고 샘플에 기본 설정을 연결합니다.
    2. 사이클 유형 패널에서 새로운 사이클 단계를 작성하고 다음 명령을 삽입, 캡처, 샘플, 재생 1과 재생 2.
    3. 캡처 명령을 선택, 입력 리간드 이름 (GST-TCO, 20 ㎍ / ㎖) 5 μL / 분으로 설정 유로의 접촉 시간 120 초 : 초. 샘플 명령을 선택, 입력 180 초 접촉 시간, 60 초 해리 시간, 30 μL / 분의 유량으로 설정 유로 : 양쪽 모두. 재생 1 명령을 선택, 입력 재생 용액 이름 (10 mM의 글리신 - 염산의 pH 2.0), 30 μL / 분으로 설정 유로에서 30 초 접촉 시간 : 초. 재생이 명령에 대해 동일한 작업을 반복합니다.
    4. 선택 설치 실행과로 설정 유로 : 2-1. 다음 선택 및 분석 솔루션 (TZ-BnNH 2) 농도 시리즈 (0.3 ~ 10 μM 1:2 희석)와 샘플 목록을 입력합니다. 위치 패널 랙 옆에 선택합니다. 96 - 웰 플레이트에있는 시약 랙 2 희석 시리즈 플레이스 솔루션 유리 병은 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하고. 방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 데이터 바인딩 및 운동 분석은 그림 4에 나타내었다.
  2. NP 고리 화 반응 속도 (그림 4)의 특성.
    1. 위의 저장 방법 서식 파일을 열고 다음 매개 변수를 변경합니다. [캡처] 패널을 선택, GST-Tz 일, 20 ㎍ / ㎖의로 변경 리간드 이름입니다. 견본 패널을 선택, 변화의 접촉 시간 120 초 접촉 시간 및 분리 시간 120 초에.
    2. 샘플 목록을 선택, NP-TCO 및 농도 시리즈 (7 nm의 224에 1:2 희석)에 분석을 변경할 수 있습니다. 시약 랙에 배치 솔루션 유리 병2와 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하는 96 - 웰 플레이트에 희석 시리즈. 방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 데이터 바인딩 및 운동 분석은 그림 4에 나타내었다.

5. 고정화 AP1497에 FKBP12의 결합을 측정

반전 지향 결합 연구는 고정 된 리간드와 분석 및 복합 AP1497 (그림 5)로 FKBP12를 사용합니다. 방법 작성 도구를 사용하여 다음과 같이 분석의 일반적인 방법은 설정되어 있습니다 :

  1. 새로운 방법 및 입력 일반 매개 변수를 선택합니다. 분석 단계 패널에서 생성하고 이름을 캡처, 샘플 및 재생 단계. 해당 목적을 선택하고 기본 설정을 연결합니다.
  2. 사이클 종류의 패널을 선택하고 3주기 단계 생성 : 캡처, 샘플 및 재생을.
  3. 캡처주기 단계에서 두 번 캡처 명령을 삽입합니다. variabl로 캡처 한 패널을 선택 캡처 솔루션을 선택둘째, 전자, 5 / 분 μL 및 설정 유로의 유량으로 접촉 시간을 300 초로 설정합니다. 둘째로 5 μL / 분으로 설정 유로의 유량으로 250 초에 접촉 시간을 설정 변수로 캡처 2 패널 선택 캡처 솔루션을 선택합니다.
  4. 샘플주기 단계에서 샘플 명령을 삽입합니다. 견본 패널을 선택, 60 초에 설정 접촉 시간, 30 μL / 분의 유량으로 설정 유로에서 200 초에 분리 시간 : 양쪽 모두.
  5. 재생주기 단계에서 두 번 재생 명령을 삽입합니다. 재생 1 패널을 선택, 입력 재생 용액 이름 (10 mM의 글리신 - 염산의 pH 2.0), 30 μL / 분으로 설정 유로에서 30 초 접촉 시간 : 초. 재생 2 패널에 대해 동일한 작업을 반복합니다.
  6. 선택 설치 실행과로 설정 유로 : 2-1. 다음 입력 캡처 솔루션 이름 (GST-TCO와 AP1497-Tz 일), 샘플 이름 (FKBP12), 농도 시리즈 (0.020-5 ㎍ / ㎖의 1:2 희석)와 MW (13,000)을 선택합니다. R의 장소 솔루션 유리 병96 - 웰 플레이트에 eagent 랙 2 희석 시리즈는 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하고. 방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 키네틱 분석 데이터는도 5에 나타낸다.

6. 고정화 된 국민 연금 첨부 AP1497에 FKBP12의 결합을 측정

나노 입자의 고정화, 작은 분자 유도체 및 FKBP12 결합 분석을위한 일반적인 방법은 셋업하는 방법 작성 도구를 사용하여 다음과 같이

  1. 위의 저장 방법 서식 파일을 열고 수정합니다. 캡처주기의 단계에 따라 추가 캡처 명령을 삽입합니다. 캡처 한 패널을 선택, 변수 이름 캡처 솔루션 1 (GST-Tz 일)로 캡처 솔루션의 선택을 취소합니다. 5 μL / 분의 유량과 두 번째로 설정 유로에서 60 초에 설정 접촉 시간. 캡처 2 패널을 선택, 변수 이름을 캡처 솔루션 2 (NP-TCO)으로 캡처 솔루션의 선택을 취소합니다. 고정 접촉 시간 5 μL / 분의 유속으로 90 초 및설정 유로로 두 번째. 캡처 3 패널을 선택, 변수 이름을 캡처 솔루션 3 (AP1497-Tz 일)로 캡처 솔루션의 선택을 취소합니다. 5 μL / 분의 유량과 두 번째로 설정 유로에서 180 초까지 설정 접촉 시간.
  2. 선택 설치 실행과로 설정 유로 : 2-1. 다음을 두 번 선택합니다. 96 - 웰 플레이트에있는 시약 랙 2 희석 시리즈 플레이스 솔루션 유리 병은 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하고. 방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 키네틱 분석 데이터는도 5에 나타낸다.

결과

데이터 및 수치는 기준 8에서 적응되었습니다.

방향과 밀도 제어와 생체 활성 작은 ​​분자의 효율적인 가역 고정 새로운 바이오 센서의 응용 프로그램의 개발에 핵심적인 역할을 담당하고 있습니다. TCO와 Tz 일 사이 빠른 bioorthogonal 반응을 이용하여, 우리는 단계적 어셈블리 및 생물학적 활성의 유지와 리간드 표면의 재생을위한 방법을 설명한다. 2 TZ-BnNH이...

토론

여기에 설명 된 캡처 - 사이클로 방법은 라벨이없는 칩 기반의 상호 작용과 운동 연구에 대한 수정 된 나노 입자와 작은 분자의 빠른 가역적 고정 할 수 있습니다. 고정화 프로토콜 <저분자 리간드 10 μM 농도가 필요한 분에서 수행 될 수있다. 리간드 농도 및 접촉 시간 고정화 밀도를 변조함으로써 가깝게 제어 할 수있다. 우리의 데이타는 온칩 bioorthogonal 반응 그들의 표적과 상호 작용하는 동...

공개

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 말

우리는 NIH (NHLBI 계약 번호 HHSN268201000044C이, SH 및 SYS를 RW하는)에서 자금을 인정합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Sensor Chip CM5GE HealthcareBR-1005-30 
Amine coupling kitGE HealthcareBR-1000-50 
GST capture kitGE HealthcareBR-1002-23 
NAP-10 ColumnsGE Healthcare17-0854-01 
GST, lyophilized in 1X PBSGenscriptZ020391 mg/ml
rhFKBP12R&D Systems3777-FK 
Surfactant P-20GE HealthcareBR-1000-54 
Glycine 2.0GE HealthcareBR-1003-55 
Zeba spin desalting columnThermo898827 K MWCO
Amicon Ultra 4FisherUFC810096100 K centrifugal filter
TCO-OHRef. 8Synthesized in-house
TCO-NHSRef. 8Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2Ref. 8Synthesized in-house
Tz-NHSRef. 8764701Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2Ref. 8Synthesized in-house
AP1497, AP1497-TzRef. 8Synthesized in-house
Equipment
SPR BiosensorGE HealthcareBiacore T100 

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