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要約

我々は、順次、オンチップバイオ直交環化学と抗体抗原取り込みを使用して、低分子の急速な可逆固定化および表面プラズモン共鳴（SPR）の研究のための官能化ナノ粒子集合体のための手法を提案する。

要約

配向および固定化密度を制御有する生物活性小分子の迅速な表面固定化のための方法は、バイオセンサー、マイクロアレイの用途に非常に望ましい。本研究では、TCO / TZ-誘導体化分子のマイクロ流体の固定化を可能にするために非常に効率的な共有結合性バイオ直交トランスシクロオクテン（TCO）の間[4 +2]環化反応および1,2,4,5 -テトラジン（Tzの）を使用する。我々は、表面プラズモン共鳴（SPR）を用いて連続流条件下で、リアルタイムでプロセスを監視する。可逆的な固定化を可能にし、センサ表面の実験範囲を拡張するために、我々は、付加環化反応と非共有結合抗原 - 抗体捕捉成分を結合する。交互にセンサ表面にTCOまたはTzの部分を提示することによって、複数の捕獲 - 環化のプロセスは、多成分構造体の様々なオンチップ·アセンブリとの相互作用の研究のために一つのセンサー表面上に今や可能である。私たちは、私バイオセンサーチップ上に2つの異なる固定化実験で、この方法をllustrate、小分子、FK506結合タンパク質12（FKBP12）に結合AP1497と同じ低分子固定化され、 その場官能化ナノ粒子中の一部として。

概要

効率的な結合反応は、バイオテクノロジーの様々なアプリケーションのために表面に生物活性分子を付着させるための貴重なツールです。最近では、非常に高速なバイオ直交トランスシクロオクテン（TCO）および1,2,4,5 -テトラジン（Tzの）間の[4 +2]環化反応は、細胞表面、細胞内構造、抗体およびナノ粒子を標識するために使用されてきた1。 - 7ここでは、表面プラズモン共鳴（SPR）相互作用分析のための多成分構造の可逆オンチップ合成のために、抗原/抗体捕捉（GST /抗GST）との組み合わせで、[4 +2]付加環化反応を使用してモニターリアルタイムでのプロセス（ 図1）。8,9特に、キャプチャ付加環化戦略が確立されたプロトコルを使用して表面の再生を可能にします。8結果として、新たなアッセイの様々なリガンドの向きや密度を制御して安定したセンサ面の集合体フォーマットが可能になりました。使い方この戦略は、我々は、TCO / TZ-誘導体化小分子の固定化を実証し、バッファの様々な条件で環化率を特徴づける。我々は、直接、固定化GST抗原に結合した場合、キャプチャ·環戦略がその標的と相互作用する低分子の能力を保持していることを確認するために、一例として、FKBP12 10-12結合しFKBP12分子AP1497の間のよく知られた相互作用を選びましたまたは固定化ナノ粒子（NPS）へ。

この方法は、いくつかの利点があります。まず、セ​​ンサーチップ上の小分子の可逆的な固定化が可能になりました。第二に、低分子のTCO / Tzの固定化にも標準的なSPRの研究の方向を逆転させるラベルフリー相互作用の研究を可能にし、結合相互作用の補完的なビューを提供することがあります。第三に、この方法は、標的化ナノ粒子のマイクロ流体合成、およびそれらのバインディンの即時評価を可能G特性。これは、標的化ナノ粒子の評価又はスクリーニングの効率を向上させ、また必要なナノ粒子の量を減少させることを約束する。13-15第四に、このアプローチは、連続流の下でリアルタイムにバイオ直交付加環化反応の反応速度を測定することができる。最後に、TCO / Tzの固定化化学は、血清の存在下でロバストである。一緒になって、我々は、この汎用性の高いアプローチが広くin vitroおよびin vivoの携帯アプリケーションでの関連性のマイクロ流体研究の多種多様な安定したセンサ面の構築を容易にすることを期待しています。

プロトコル

1。 GSTおよびナノ粒子（NP）複合体の調製

  1. GST-TCOの調製：
    1. GST（PBS中1 mg / ml）を100μlにTCO-NHS溶液8μL（DMSO中50 mm）を追加し、室温で1時間混合物を振る。
    2. のZebaスピン脱塩カラムを使用して過剰の試薬を除去。 GST-TCOコンジュゲートを含有するろ液を回収し、使用前に4℃で保存する。
  2. GST-TZの準備：
    1. GST（PBS中1 mg / ml）を75μlにTZ-NHS溶液6μL（DMF中25 mm）を追加し、室温で1時間混合物を振る。
    2. PBS25μlの反応混合物を希釈し、スピン脱塩カラムを用いて精製する。 GST-Tzのコンジュゲートを含有する濾液を、使用前に4℃で保存する。
    注：質量分析（MALDI-TOF）は、平均して約10 Tzのか、TCO分子は、GSTに結合させたことを示した。
  3. NP-TCOの調製：
    1. TCO-NHS溶液を100μl（DMSO中50 mM）をを追加アミノ化ナノ粒子を150μl（NP-NH 2、8.7mgの鉄/ PBS溶液で、3nmの鉄心〜8,000のFe / NP）と室温で1時間、混合物を振る。
    2. PBS緩衝液で溶出したNAP-10カラムを用いたゲル濾過によって過剰の試薬を除去する。 NP-TCOの生成物を含む色のバンドを収集します。
    3. 遠心フィルター装置（100 K MWCO）を使用して〜150μlの最終容量をろ液を濃縮する。
    4. （無水物末端カルボン酸を形成するために、残りのアミンと反応し、これはデキストラン表面に非特異的な相互作用を防止する）、NP-TCO溶液（DMSO中0.1M）、無水コハク酸を50μlを加え、室温で1時間振とうする。
    5. PBSで溶出NAP-10カラムを用いてNP-TCO生成物を精製する。使用前に4℃でのNP-TCOの溶液を保管してください。

2。表面処理

すべての表面プラズモン共鳴アッセイにおいてバイアコアT100計器（GE Healthcare）で実行される25°C、特に断りのない限り、ランニングバッファーとしてCM5センサーチップおよびPBS-Pを使用して。ビアコア制御および測定器に供給される評価ソフトウェアは、実験を設定し、データを分析するために使用される。二つの動作モード、アプリケーションウィザードと手動運転を表面処理し、監視、オンチップキャプチャ環のために使用されます。方法ビルダーモードは逆方向結合実験のセットアップおよび環化反応速度を測定するために使用される。データは、二重参照を差し引いおよび動力学分析は、1:1ラングミュア結合モデルを使用して実行されている。

  1. フローセル上のアミン固定化ウィザードテンプレートを選択し、固定化1（参考）と2（検出）を使用します。 0.4 M EDCの1:1溶液を注入することにより、表面カルボキシル基を活性化アミンメソッドを修正する：480秒、0.1 M NHSを10μL/分の流速で。で420秒の接触時間に残りの活性化エステルをクエンチエタノールアミンの注入を設定するを10μl/分の流速。
  2. 入力リガンド名、抗GST（酢酸緩衝液、pH5.0中の18μgの個​​/ ml）し、10μl/分の流速で420秒の接触時間のために注入するように設定。
  3. コンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら2試薬ラックに必要なソリューションバイアルを置きます。保存して、固定化を開始します。
    注：〜14,000〜17,000 RUの範囲内の抗GST固定化レベルのこのよう結果に固定化ウィザードの実行。
  4. のみ参照フローセル1を介して5μL/分で420秒間（20μg/ ml）をソリューションを、GSTリガンドを注入するために固定化ウィザードを編集します。

3。官能基化分子のオンチップキャプチャ環を監視

  1. オンチップリアルタイムでキャプチャ-環（ 図2）の監視。
    1. GST-TCO（20μg/ ml）を、TZ-BnNH 2（10μM）と再生（10 mMグリシン、pH値= 2.0）試薬ラック2内の溶液バイアルを置きます。男を選択UALの実行方法は、5μlの/分に流量を設定し、セル2フローのパスを流れる。
    2. 420秒間、GST-TCOの溶液を注入する。
    3. 600秒間TZ-BnNH 2の溶液を注入する。
    4. 再生溶液の2 30秒の注射で表面を再生。
  2. リアルタイム（ 図3）の多成分構造のオンチップ·アセンブリを監視する。
    1. 場所GST-Tzを（20μg/ ml）を、NP-TCO（100μgの鉄/ ml）を、TZ-BnNH 2（10μM）および再生（10mMグリシン液、pH = 2.0）溶液バイアル試薬ラック2。測定器の取扱説明書の実行方法を選択し、セル2のフローに5μL/分の流路に流量を設定。
    2. 60秒間、GST-TZの溶液を注入する。
    3. 60秒間のNP-TCOの溶液を注入する。
    4. 60秒間TZ-BnNH 2の溶液を注入する。
    5. 再生溶液の2 30秒の注射で表面を再生。

4。 M環化率の固定化密度と決意をonitoring

  1. 小分子の付加環化反応速度の特徴付け（ 図4）。
    1. 新しい手法や入力一般的なパラメータを選択します。アッセイ工程パネルで新たな一歩と名前のサンプルを作成します。目的を設定し、サンプルするために基本設定を接続します。
    2. サイクルタイプパネルで新しいサイクルステップを作成し、次のコマンドを挿入して、キャプチャ、サンプル、再生1及び再生2。
    3. captureコマンドを選択すると、入力リガンド名（GST-TCO、20μg/ ml）を、5〜10μL/分と設定された流路での接触時間120秒：秒。サンプルコマンドを選択し、入力180秒の接触時間、60秒の解離時間、30μL/分の流速とに設定された流路：両方。再生1コマンドを選択し、入力された再生溶液名（10 mMのグリシン-HCl pHは2.0）、30μL/分に設定された流路で30秒の接触時間：セカンド。再生2コマンドのために同じことを繰り返します。
    4. 2-1：に設定して実行し、設定された流路を選択します。次の選択し、検体溶液（TZ-BnNH 2）および一連の濃度（0.3〜μM、1:2希釈）でサンプルリストを埋める。ポジションパネルをラックに横に選択します。 96ウェルプレート内の試薬ラック2と希釈系列に置き液バイアルは、コンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。データバインディングおよび動力学的分析は、 図4に示されている。
  2. NP付加環化反応速度の特徴付け（ 図4）。
    1. 上から保存されたメソッドのテンプレートを開き、次のパラメータを変更してください。キャプチャパネルを選択します。GST-TZ、20μg/ mlのへの変更リガンド名。サンプルパネルを選択し、120秒〜120秒の接触時間および解離時間への変更の接触時間を。
    2. サンプルリストを選択します。NP-TCOに変更検体および濃度シリーズ（7から224 nMで、1:2希釈）。試薬ラックに固定液バイアル2およびコンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら、96ウェルプレート内の希釈系列。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。データバインディングおよび動力学的分析は、 図4に示されている。

5。固定化されたAP1497へのFKBP12の結合を測定する

逆向きの結合研究は、固定化リガンドとして検体および化合物のAP1497（ 図5）のようなFKBP12を採用している。次のようにこのアッセイのための一般的な方法は、メソッドBuilderツールを使用して設定されます。

  1. 新しい手法や入力一般的なパラメータを選択します。アッセイ工程パネルで作成し、名前キャプチャ、サンプルおよび再生の手順。対応する目的を選択して、基本設定を接続します。
  2. サイクルタイプのパネルを選択し、3サイクル工程作成：キャプチャ、サンプルおよび再生を。
  3. キャプチャサイクルのステップの下二回captureコマンドを挿入します。ヴァリアブルとしてキャプチャ1のパネルを選択し、キャプチャソリューションを選択第二：電子、5μlの/分に設定した流路の流量で300秒の接触時間を設定する。第二：5〜10μL/分と設定された流路の流量で250秒の接触時間を設定する変数としてキャプチャ2のパネルを選択捕捉溶液を選択する。
  4. サンプルサイクルステップ下でのサンプルコマンドを挿入します。サンプルパネルを選択し、30μL/分に設定された流路の流速で200秒〜60秒とし、接触時間を、解離時間：両方。
  5. 再生サイクルのステップの下二回生指令を挿入します。再生1パネルを選択し、入力された再生溶液名（10 mMのグリシン-HCl pHは2.0）、30μL/分に設定された流路で30秒の接触時間：セカンド。再生2パネルのために同じことを繰り返します。
  6. 2-1：に設定して実行し、設定された流路を選択します。次の入力キャプチャソリューション名（GST-TCOおよびAP1497-TZ）、サンプル名（FKBP12）、一連の濃度（0.020から5μg/ mlの1:2希釈）とMW（13000）を選択します。 R溶液バイアルを置きますコンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら96ウェルプレートに2および希釈シリーズラックeagent。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。動力学的分析データを図5に示す。

6。固定化のNPに添付AP1497にFKBP12の結合を測定する

ナノ粒子固定化、低分子誘導体化およびFKBP12結合アッセイのための一般的な方法は、セットアップされている方法Builderツールを使用して次のように

  1. 上から保存されたメソッドのテンプレートを開き、変更します。キャプチャサイクルステップの下に追加のcaptureコマンドを挿入します。キャプチャ1のパネルを選択します。変数と名前のキャプチャソリューション1（GST-TZ）としてキャプチャソリューションの選択を解除します。 5μl/分の流速および第二のセットの流路で60秒に設定された接触時間。キャプチャ2のパネルを選択します。変数と名前のキャプチャソリューション2（NP-TCO）などのキャプチャソリューションの選択を解除します。設定された接触時間を5μl/分の流速で90秒、及び第二のセットの流路。キャプチャ3のパネルを選択します。変数と名前のキャプチャソリューション3（AP1497-TZ）としてキャプチャソリューションの選択を解除します。 5μl/分の流速および第二のセットの流路180秒に設定された接触時間。
  2. 2-1：に設定して実行し、設定された流路を選択します。二度横に選択します。 96ウェルプレート内の試薬ラック2と希釈系列に置き液バイアルは、コンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。動力学的分析データを図5に示す。

結果

データおよび図は、参照8から適応されている。

向きや密度の制御付きの生理活性小分子の効率的な可逆的な固定化は、新しいバイオセンサーのアプリケーションの開発に重要な役割を果たしている。 TCOとTzの間の高速バイオ直交反応を用いて、我々は、生物学的活性を保持したリガンド面の段階的な組み立ておよび再生のための方法を記載している。 図2は、-Tz

ディスカッション

ここで説明するキャプチャ付加環化の方法は、ラベルフリーチップベースの相互作用および動力学的研究のための修飾ナノ粒子および小分子を迅速に、可逆的な固定化を可能にします。固定化プロトコルは、<小分子リガンドの10μMの濃度を必要数分で行うことができる。リガンド濃度と接触時間の固定化密度を調節することにより厳密に制御することができる。我々のデータは、オンチッ?...

開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

我々は、NIHから（NHLBI契約番号HHSN268201000044C RW、SHおよびSYSに）資金を認めている。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Sensor Chip CM5GE HealthcareBR-1005-30 
Amine coupling kitGE HealthcareBR-1000-50 
GST capture kitGE HealthcareBR-1002-23 
NAP-10 ColumnsGE Healthcare17-0854-01 
GST, lyophilized in 1X PBSGenscriptZ020391 mg/ml
rhFKBP12R&D Systems3777-FK 
Surfactant P-20GE HealthcareBR-1000-54 
Glycine 2.0GE HealthcareBR-1003-55 
Zeba spin desalting columnThermo898827 K MWCO
Amicon Ultra 4FisherUFC810096100 K centrifugal filter
TCO-OHRef. 8Synthesized in-house
TCO-NHSRef. 8Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2Ref. 8Synthesized in-house
Tz-NHSRef. 8764701Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2Ref. 8Synthesized in-house
AP1497, AP1497-TzRef. 8Synthesized in-house
Equipment
SPR BiosensorGE HealthcareBiacore T100 

参考文献

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