Imágenes funcionales de la corteza auditiva en los gatos adultos el uso de alto campo fMRI

Resumen

Los estudios funcionales del sistema auditivo en los mamíferos que tradicionalmente han llevado a cabo utilizando técnicas espacialmente focalizadas tales como registros electrofisiológicos. El siguiente protocolo describe un método de visualización de los patrones a gran escala de la actividad hemodinámica evocado en la corteza auditiva gato utilizando imágenes de resonancia magnética funcional.

Resumen

El conocimiento actual de procesamiento sensorial en el sistema auditivo mamífero se deriva principalmente de estudios electrofisiológicos en una variedad de modelos animales, incluyendo monos, hurones, murciélagos, roedores y gatos. Con el fin de establecer paralelismos adecuados entre los modelos humanos y animales de la función auditiva, es importante establecer un puente entre los estudios de imagen funcional humanos y estudios electrofisiológicos animales. La resonancia magnética funcional (fMRI) es establecido un método mínimamente invasivo para medir patrones amplios de la actividad hemodinámica en las distintas regiones de la corteza cerebral. Esta técnica es ampliamente utilizado para sondear la función sensorial en el cerebro humano, es una herramienta útil en la vinculación de los estudios de procesamiento auditivo en los seres humanos y los animales y se ha utilizado con éxito para investigar la función auditiva en monos y roedores. El siguiente protocolo describe un procedimiento experimental para la investigación de la función auditiva en adultos anestesiadosgatos mediante la medición de estímulo-evocó los cambios hemodinámicos en el córtex auditivo mediante resonancia magnética funcional. Este método facilita la comparación de las respuestas hemodinámicas a través de diferentes modelos de la función auditiva lo que conduce a una mejor comprensión de las características de especies independiente de la corteza auditiva de los mamíferos.

Introducción

La comprensión actual del procesamiento auditivo en los mamíferos se deriva principalmente de los estudios electrofisiológicos invasivos en monos, hurones ^{1-5 6-10 11-14,} murciélagos, roedores ^{15-19, 20-24} y gatos. Técnicas electrofisiológicas comúnmente utilizan microelectrodos extracelulares para registrar la actividad de las neuronas individuales y múltiples dentro de una pequeña área de tejido neuronal que rodea la punta del electrodo. Establecido métodos de neuroimagen funcional, como la proyección de imagen óptica y la resonancia magnética funcional (fMRI), sirven como complementos útiles a las grabaciones extracelulares, proporcionando una perspectiva macroscópica de la actividad driven simultánea a través de múltiples regiones, espacialmente distintas del cerebro. Imágenes ópticas señal intrínseca facilita la visualización de la actividad evocada en el cerebro mediante la medición de los cambios relacionados con la actividad en las propiedades de reflectancia de la superficie del tejido, mientras que la fMRI utiliza la sangre oxígeno-dependiente del nivel de (BOLD)contrastar medir estímulo-evocó los cambios hemodinámicos en las regiones del cerebro que están activas durante una tarea en particular. Imágenes ópticas requiere la exposición directa de la superficie cortical que mide los cambios en la superficie de reflectancia del tejido que están relacionados con la actividad provocada por estímulo ^25. En comparación, la fMRI es no invasivo y explota las propiedades paramagnéticas de sangre sin oxígeno para medir tanto la superficie cortical ^26-28 y ^27,29 la actividad evocada basado en surco dentro de un cráneo intacto. Una alta correlación entre la señal BOLD y la actividad neuronal en la corteza visual de los primates no humanos ³⁰ y en la corteza auditiva humana ³¹ validan fMRI como una herramienta útil para estudiar la función sensorial. Desde fMRI se ha utilizado ampliamente para estudiar las características de la vía auditiva tales como la organización tonotópica ^32-36, lateralización de la función auditiva ^37, los patrones de activación cortical, la identificación de regiones corticales ^38, efectos de sonidointensidad en las propiedades de respuesta auditiva ^39,40, y las características de la evolución en el tiempo de respuesta BOLD ^29,41 en modelos de ratas humanas, de mono, y, el desarrollo de un protocolo de imagen funcional adecuado para estudiar la función auditiva en el gato proporcionaría un complemento útil para la literatura de imagen funcional. Mientras fMRI también se ha utilizado para explorar diversos aspectos funcionales de la corteza visual en el gato anestesiado ^26-28,42, pocos estudios han utilizado esta técnica para examinar el procesamiento sensorial de gato corteza auditiva. El propósito del presente Protocolo es establecer un método eficaz de utilizar fMRI para cuantificar la función en la corteza auditiva del gato anestesiado. Los procedimientos experimentales descritos en este manuscrito se han utilizado con éxito para describir las características de la evolución en el tiempo de respuesta BOLD en la corteza auditiva gato adulto ^43.

Protocolo

El siguiente procedimiento se puede aplicar a cualquier experimento de formación de imágenes en el que se utilizan gatos anestesiados. Pasos que se requieren específicamente para experimentos auditivos (pasos 1.1 a 1.7, 2.8, 4.1) pueden ser modificados para dar cabida a otros protocolos de estímulos sensoriales.

Todos los procedimientos experimentales recibieron la aprobación de la utilización de animales Subcomité del Consejo Universitario de Cuidado de Animales de la Universidad de Western Ontario y siguieron las directrices especificadas por el Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA) ^44. El experimento descrito requiere aproximadamente 150 minutos, desde la preparación de los animales para la recuperación. El curso de tiempo del experimento se ilustra en la Figura 1.

1. Estímulo para la Preparación de

La Figura 2 muestra los componentes electrónicos y las conexiones correspondientes requeridas para generar un estímulo auditivo en el escáner de resonancia magnética. Los requisitos son los follows: un ordenador, una tarjeta de sonido externa, un amplificador de potencia estéreo y un sistema de auriculares compatible con fMRI.

1. Conectar el equipo que se utiliza para presentar el estímulo auditivo a la tarjeta de sonido externa a través del cable (USB) de bus serie universal.
2. Conecte los cables que conectan los puertos de salida de la tarjeta de sonido externa a los puertos de entrada del amplificador de potencia estéreo.
3. Conecte los cables que conectan los puertos de salida del amplificador de potencia estéreo a los puertos de entrada de la caja del transformador del sistema de auricular compatible con fMRI.
4. Conecte los auriculares binaurales a los puertos de salida de la caja del transformador.
5. Utilice cables coaxiales apantallados con conexiones BNC para conectar la caja del transformador al panel de penetración fuera de la sala del escáner.
6. Conecte el conjunto de cables del auricular a los puertos BNC correspondientes en el panel de la penetración en el interior de la sala del escáner.
7. Conecte las puntas de las orejas de espuma para los auriculares y luego conectar los auriculares to el conjunto de cables. Ejecute un estímulo auditivo de prueba para confirmar que el sonido se transmite desde el ordenador a los auriculares. Desconecte los auriculares y insertar las almohadillas de espuma de forma segura en las orejas del gato durante la fase de preparación de animales (paso 2.7).

2. Preparación de los animales

1. Para premedicar el gato, administrar un sedante mezcla de sulfato de atropina (0,02 mg / kg) y acepromacina (0,02 mg / kg) a través de una inyección subcutánea (SC).
2. Después de 20 min, administrar la ketamina (4 mg / kg) y clorhidrato de dexmedetomidina (0,02-0,03 mg / kg) a través de una inyección intramuscular (IM) para inducir la anestesia. La ketamina se combina generalmente con un sedante y relajante muscular, en este caso, clorhidrato de dexmedetomidina, para reducir los temblores y la rigidez muscular comúnmente observados cuando la ketamina se usa solo ^45. Esta combinación anestésico típicamente induce aproximadamente 150 min de sedación y se utiliza con frecuencia en la práctica veterinaria para induciranestesia en animales pequeños.
3. Una vez que el gato ha perdido su reflejo de enderezamiento, aplique ungüento oftálmico para los ojos para evitar la sequedad durante el procedimiento. Coloque un catéter permanente en la vena safena medial de la administración intravenosa de ketamina.
4. Prueba para la inducción anestésica con éxito apretando un dedo del pie en la pata delantera y luego observar si el gato retira su pata. Una vez que el reflejo pedal desaparece, suprimir el reflejo de la mordaza rociando lidocaína sobre las paredes faríngeas entonces intubar al gato con un tubo endotraqueal 4,0-4,5.
5. Mantener la anestesia durante toda la sesión de formación de imágenes con una infusión a velocidad constante de ketamina (0.6-0.75 mg / kg / h) e isoflurano inhalado (0,4-0,5%) entregado en 100% de oxígeno a 1-1,5 L / min. Combinar 60 ml de solución salina y 0,07 ml de ketamina en una jeringa de 60 ml a continuación, colocar la jeringa en la bomba de jeringa. Este paso puede realizarse antes de premedicating el gato.
6. Coloque almohadillas térmicas de cera llenas de cálidos en el suelo de los s compatibles con resonancia magnéticaconducido (figuras 3a y 3c) a continuación, la capa aislante de la envoltura de burbujas de plástico alrededor de las paredes interiores de la corredera.
7. Coloque el gato en posición esternal en el plástico de burbujas de aislamiento en el trineo compatible con resonancia magnética (Figura 3c).
8. Una vez que el gato se coloca, ajustar la cabeza para obtener acceso a los oídos. Rollo de las puntas de las orejas de espuma en el menor diámetro posible luego inserte la punta de cada oreja profundamente en el canal auditivo. Una vez insertado, las almohadillas de espuma deberían expandirse para llenar el espacio dentro de los canales del oído.
9. Ajuste el gato hasta que su cabeza está colocada adecuadamente dentro de la radiofrecuencia (RF) de la bobina de 3 canales (Figura 3b). Estabilice la cabeza con espuma de memoria amortiguación acústica (Figura 3d). Coloque espuma alrededor de las orejas para proporcionar la atenuación del ruido producido por el escáner.
10. Envuelva al gato en la manta de aislante plástico de burbujas de plástico y luego asegurar y transportar el trineo a la superficie del escáner.
11. Conecte las líneas de infusión, tubos de suministro de anestesia y equipos de monitoreo para el gato. Conecte los auriculares a la asamblea de cable del auricular de la centralita de la penetración.
12. Iniciar la infusión de ketamina en la tasa de flujo de base de 0,6 mg / kg / hr a continuación, aumentar la velocidad de flujo según se requiera en base a la profundidad de la anestesia. Ajuste de la dosis inicial isoflurano al 0,5% y luego disminuirá a 0,4% una vez que se han recogido las exploraciones anatómicas.
13. Monitorear y registrar la saturación del gato de oxígeno en sangre, final de la espiración niveles de CO _2, la frecuencia cardiaca, la respiración y la temperatura rectal (si es posible) durante todo el experimento utilizando equipos de vigilancia compatible con resonancia magnética colocada a una distancia apropiada desde el agujero del escáner. Tabla 1 enumera los los valores medios y rangos de las mediciones fisiológicas para la ejecución exitosa de este procedimiento. Los constantes aumentos en la frecuencia cardíaca y la respiración se asocian generalmente con la recuperación inminente de la anestesia.
14. Después de que los sse completa esión, quite el gato del trineo. Continuar proporcionando calentamiento suplementario con almohadillas de calor y toallas hasta que el animal se recupere por completo. Una vez que los retorne el reflejo nauseoso, retire el tubo endotraqueal. Monitorear el gato hasta que el reflejo de enderezamiento se restaura luego regresar al animal a las instalaciones. Evaluar el animal al día siguiente del procedimiento para asegurarse de efectos adversos del experimento.

3. Brain Imaging

1. Recoger las exploraciones anatómicas del cerebro del gato en una orientación corte axial. Utilice los siguientes parámetros de imagen para el volumen de referencia anatómica: la secuencia de imágenes FLASH con TR = 750 ms, TE = 8 ms, matriz = 256 x 256, la adquisición de un voxel = 281 m x 281 m x 1,0 mm. La duración de la exploración anatómica es aproximadamente 6 min. Figura 4 (panel izquierdo) proporciona una muestra de corte de imagen anatómica obtenida usando los parámetros especificados.
2. Utilice los siguientes parámetros de imagen para el funciovolúmenes internos: la adquisición de eco planar intercalada segmentado (EPI) con TR = 1000 ms, TE = 15 ms, 3 segmentos / avión, 21 x 1 mm rebanadas; matriz = 96 x 96; campo de visión = 72 mm x 72 mm, la adquisición de un voxel = 0.75 mm x 0.75 mm x 1,0 mm;. tiempo de adquisición = 3 s / volumen de la figura 4 (panel derecho) ofrece una muestra de corte de imagen funcional obtenida mediante los parámetros especificados.

4. Presentación de Estímulo

1. Presentar un ruido blanco de banda ancha estímulo (0-25 kHz, 100 mseg ráfagas con 5 tiempo de subida / caída ms, 1 presentación cada 200 ms, 90-100 dB SPL) en un diseño de bloques en el que se juega el estímulo auditivo durante 30 segundos y alternado con un 30 seg línea de base (sin-estímulo) condición (Figura 5). Repita este paso hasta que se observe la actividad BOLD acústicamente-evocó en la corteza auditiva. La duración de cada carrera funcional utilizando un diseño de bloques es de aproximadamente 4,5 min por 90 volúmenes.
2. Presentar el estímulo en el apbloque apropiado configuración de diseño para el número deseado de carreras funcionales.

5. Análisis de Datos

1. Seleccione el software de análisis de resonancia magnética funcional adecuada (por ejemplo, SPM, FSL) para procesar los volúmenes funcionales adquiridos.
2. Vuelva a alinear cada volumen funcional al volumen adquirido más cercano en el tiempo a la referencia anatómica exploración. Guarde los valores de corrección de movimiento resultantes para uso en la etapa 5.6. Excluir las carreras funcionales en las que los movimientos de cabeza de rotación superiores a 1 º o movimientos de la cabeza de traslación superan 1 mm.
3. Coregister cada volumen a la referencia anatómica exploración.
4. Alise cada volumen con un 2 mm de media máxima de ancho completo (FWHM) de filtro de Gauss.
5. Incorporar una función de onda cuadrada (furgón), que se corresponde con el diseño de bloques al estímulo ON-OFF como regresor en el modelo lineal general (GLM).
6. Incorporar los valores de corrección de movimiento como regresores de ningún interés para dar cuenta de los artefactos relacionados con el movimiento. Aplicar una uumbral estadístico ncorrected de p = 0,001 para el GLM resulta para ver los grupos de activación BOLD. Determine el tamaño de la agrupación más pequeña que se encuentra con un corregido (error familia de sabios: FWE) umbral de p <0,05 en el nivel de clúster. Ajuste el umbral de extensión de clúster a este valor para ver grupos estadísticamente significativas en las regiones de interés.
7. Definir el cambio de la señal BOLD ciento (PSC) en cada voxel como la diferencia entre la señal BOLD media durante los bloques de estimulación y la señal BOLD media durante los bloques de referencia.

Resultados

Datos funcionales representativos fueron adquiridos en un escáner de perforación horizontal 7T y se analizaron usando la caja de herramientas Statistical Parametric Mapping en MATLAB. Respuestas hemodinámicas corticales robusto para la estimulación auditiva consistentemente se han observado en los gatos utilizando el protocolo experimental descrito ^43. Figura 6 ilustra la activación negrita en 2 animales en respuesta a un estímulo ruido de banda ancha 30 seg presentado en un diseño de ...

Discusión

En el diseño de un experimento fMRI para un modelo animal anestesiado de la función auditiva, los siguientes aspectos deben recibir una cuidadosa consideración: (i) el impacto de la anestesia en las respuestas corticales, (ii) el efecto del ruido del escáner plano, y (iii) la optimización de la fase de recogida de datos del procedimiento experimental.

Mientras que una preparación anestesiado ofrece la importante ventaja de producir un período prolongado de sedación y minimizando el p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Atropine sulphate injection 0.5 mg/ml	Rafter 8 Products
Acepromazine 5 mg/ml	Vetoquinol Inc.
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml	Bimeda-MTC
Dexmedetomidine hydrochloride (Dexdomitor 0.5 mg/ml)	Orion Pharma
Isoflurane 99.9%	Abbott Laboratories
Lidocaine (Xylocaine endotracheal 10 mg/metered dose)	Astra Zeneca
Lubricating opthalmic ointment (Refresh Lacri Lube)	Allergan Inc.
Saline 0.95%
IV Catheter 22 g (wings)
IV Extension Set	Codan US Corp.	BC 269
IV Administration Set 10 drips/ml
Endotracheal tube 4.0
Heating pads (Snuggle Safe)	Lenric C21 Ltd.
Syringe 60 ml
Equipment
External sound card	Roland Corporation	Cakewalk UA-25EX
Stereo power amplifier	Pyle Audio Inc.	Pyle Pro PCAU11
MRI-compatible insert earphone system	Sensimetric Corporation	Model S14
Foam ear tips for insert earphones	E-A-R Auditory Systems	Earlink 3B
End-tidal CO2 monitor	Nellcor	N-85
MRI-compatible pulse oximeter	Nonin Medical Inc.	Model 7500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-2208