Funktionelle Bildgebung Auditory Cortex bei erwachsenen Katzen mit Hochfeld-fMRI

Zusammenfassung

Funktionelle Untersuchungen des Gehörs bei Säugetieren haben traditionell mit räumlich konzentriert Techniken wie elektrophysiologischen Ableitungen durchgeführt. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung von Großmuster hervorgerufen hämodynamischen Aktivität im auditorischen Kortex der Katze mit Hilfe der funktionellen Kernspintomographie.

Zusammenfassung

Aktuelle Kenntnisse der sensorischen Verarbeitung im Säuger auditorischen System wird hauptsächlich aus elektrophysiologischen Studien in einer Vielzahl von Tiermodellen, darunter Affen, Frettchen, Fledermäuse, Nagetiere und Katzen ab. Um geeignete Parallelen zwischen Mensch und Tier Modelle der auditorischen Funktion zu zeichnen, ist es wichtig, eine Brücke zwischen Mensch funktionelle Bildgebung Studien und Tierelektrophysiologische Studien zu etablieren. Die funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT) ist eine etablierte, minimal-invasive Methode zur Messung der breiten Muster der hämodynamischen Aktivität in verschiedenen Regionen der Großhirnrinde. Diese Technik wird häufig zur sensorischen Funktion im menschlichen Gehirn zu untersuchen, ist ein nützliches Werkzeug bei der Verknüpfung von Studien von auditiven Verarbeitung bei Menschen und Tieren und ist erfolgreich verwendet worden, um Gehörfunktion bei Affen und Nagetiere zu untersuchen. Das folgende Protokoll beschreibt eine experimentelle Verfahren zur Untersuchung der Gehörfunktion bei narkotisierten ErwachsenenKatzen durch Messung Stimulus-evozierte hämodynamischen Veränderungen im auditorischen Kortex mittels fMRT. Dieses Verfahren erleichtert den Vergleich der hämodynamischen Reaktionen auf verschiedene Modelle der Gehörfunktion so zu einem besseren Verständnis der speziesunabhängige Merkmale des Säuger auditorischen Cortex führt.

Einleitung

Aktuelle Verständnis der auditiven Verarbeitung bei Säugetieren ist vor allem aus invasive elektrophysiologische Studien an Affen ^1-5, Frettchen ^{6-10, 11-14} Fledermäuse, Nagetiere ^{15-19, 20-24} und Katzen ab. Elektrophysiologische Techniken verwenden üblicherweise extrazellulären Mikroelektroden, die Aktivität von einzelnen und mehreren Neuronen in einem kleinen Bereich der Umgebung der Elektrodenspitze Nervengewebe aufzunehmen. Gegründet funktionellen bildgebenden Verfahren, wie optische Bildgebung und der funktionellen Magnetresonanztomographie (fMRI), dienen als nützliche Ergänzung zu extrazelluläre Ableitungen durch eine makroskopische Perspektive der gleichzeitigen angetriebenen Aktivität über mehrere räumlich getrennte Bereiche des Gehirns. Intrinsic Signal optische Bildgebung erleichtert die Darstellung der evozierten Aktivität im Gehirn durch Messung der Aktivität bedingten Veränderungen in den Reflexionseigenschaften des Oberflächengewebes während fMRI nutzt die Blut-Sauerstoff-Niveau abhängig (BOLD)Im Gegensatz zum Stimulus-evozierte hämodynamischen Veränderungen in Hirnregionen, die bei einer bestimmten Aufgabe aktiv sind, zu messen. Die optische Bildgebung erfordert direkte Exposition der kortikalen Oberfläche, Maßnahmen Veränderungen in Oberflächengewebe Reflexion, die Stimulus-evozierte Aktivität ²⁵ verbunden sind. Im Vergleich dazu ist fMRI nicht-invasive und nutzt die paramagnetischen Eigenschaften von sauerstoffarmes Blut, sowohl kortikalen Oberfläche ^26-28 und Sulcus-basierte ^27,29 evozierte Aktivität innerhalb einer intakten Schädel zu messen. Starke Korrelationen zwischen dem BOLD-Signal und neuronaler Aktivität in nicht-menschlichen Primaten visuellen Kortex ³⁰ und in der menschlichen auditorischen Kortex ³¹ validieren fMRI als ein nützliches Werkzeug, um sensorische Funktion zu studieren. Seit fMRI wurde ausgiebig genutzt, um Funktionen der Hörbahn wie tonotopen Organisation ^32-36, Lateralisa der auditiven Funktion ^37, Muster der kortikalen Aktivierung, die Identifizierung von kortikalen Regionen ^38, Auswirkungen von Schall studierenIntensität auf ^39,40 Gehörantworteigenschaften, und die Eigenschaften des BOLD Reaktionszeit natürlich in ^29,41 Mensch, Affe und Ratte Modelle, die Entwicklung einer geeigneten funktionellen Bildgebungsprotokoll zu Gehörfunktion bei der Katze studieren würde eine sinnvolle Ergänzung zu bieten die funktionelle Bildgebung Literatur. Während fMRI wurde auch verwendet, um verschiedene funktionale Aspekte des visuellen Kortex in der narkotisierten Katze ^26-28,42 erkunden, haben nur wenige Studien diese Technik verwendet, um die sensorische Verarbeitung in Katze auditorischen Kortex zu untersuchen. Der Zweck der vorliegenden Protokolls ist es, eine effektive Methode der Verwendung von fMRT-Funktion im auditorischen Kortex der narkotisierten Katze quantifizieren zu etablieren. Die in dieser Handschrift skizzierten experimentellen Verfahren wurden erfolgreich eingesetzt, um die Eigenschaften des BOLD Reaktionszeit natürlich in der erwachsenen Katze auditorischen Kortex ⁴³ zu beschreiben.

Protokoll

Das folgende Verfahren kann auf jede Imaging-Experiments in narkotisierten Katzen eingesetzt werden eingesetzt werden. Schritte, die speziell für Gehör Experimente erforderlich sind (Schritte 1.1-1.7, 2.8, 4.1) können modifiziert werden, um andere Sinnesreiz Protokolle aufzunehmen.

Alle Experimente die Genehmigung der Einsatz von Tieren Unterausschuss des Universitätsrates für Tierpflege an der Universität von Western Ontario und folgte den von der Canadian Council on Animal Care (CCAC) ⁴⁴ festgelegten Richtlinien. Die geschilderte Experiment erfordert ca. 150 min von Tierpräparation zur Genesung. Der Zeitverlauf des Experiments ist in Fig. 1 dargestellt.

1. Stimulus Vorbereitung der Ausrüstung

Fig. 2 zeigt die elektronischen Komponenten und entsprechenden Anschlüssen zum Erzeugen eines auditorischen Reizes in der MRI-Scanner erforderlich. Die Anforderungen sind als follows: ein Computer, eine externe Soundkarte, ein Stereo-Leistungsverstärker und einem fMRI-kompatiblen Kopfhörer-System.

1. Schließen Sie den Computer, die verwendet werden, um die auditorischen Reizes an die externe Soundkarte über den Universal Serial Bus (USB)-Kabel präsentieren wird.
2. Die Kabel, welche die Ausgangsanschlüsse des externen Soundkarte mit den Eingangsanschlüssen der Stereo-Endstufe.
3. Befestigen Sie die Verbindungskabel der Ausgangs-Ports des Stereo-Endstufe an die Eingangstore des Transformators Kasten des fMRI-kompatiblen Kopfhörer-System.
4. Schließen Sie die binaurale Kopfhörer an den Ausgangsanschlüssen des Transformators Feld.
5. Verwenden Sie abgeschirmte Koaxialkabel mit BNC-Anschlüsse, um den Transformator Feld, um das Eindringen Tafel außerhalb des Scanners Raum verbinden.
6. Schließen Sie das Kopfhörerkabel-Montage mit den entsprechenden BNC-Anschlüsse an der Durchdringung Tafel im Inneren des Scanners Raum.
7. Schließen Sie die Schaumstoff-Ohr Tipps, um die Kopfhörer schließen Sie dann die Ohrhörer to die Kabelkonfektion. Führen Sie einen Test auditorischen Reizes zu bestätigen, dass Ton aus dem Computer, um die Kopfhörer übertragen. Ziehen Sie die Ohrhörer und legen Sie die Schaumstoff-Ohrspitzen fest in die Ohren der Katze während der Tiervorbereitungsphase (Schritt 2.7).

2. Vorbereitung der Tiere

1. Um die Katze premedicate, ein Beruhigungsmittel verabreichen Mischung von Atropinsulfat (0,02 mg / kg) und Acepromazin (0,02 mg / kg) über eine subkutane (SC) Injektion.
2. Nach 20 min zu verabreichen Ketamin (4 mg / kg) und Dexmedetomidinhydrochlorid (0,02-0,03 mg / kg) über eine intramuskuläre (IM) Injektion Anästhesie zu induzieren. Ketamin ist üblicherweise mit einem Beruhigungsmittel und Muskelentspannungsmittel kombiniert, in diesem Fall, Dexmedetomidin-Hydrochlorid, das Zittern und Muskelstarre häufig beobachtet, wenn Ketamin alleine ⁴⁵ zu verringern. Diese Betäubung Kombination induziert typischerweise etwa 150 min der Sedierung und wird häufig in der tierärztlichen Praxis verwendet werden, um zu induzierenAnästhesie bei Kleintieren.
3. Sobald die Katze hat ihre Aufrichtungsreflexes verloren, gelten Augensalbe in die Augen zu Trockenheit während des Verfahrens zu verhindern. Legen Sie eine Dauerkatheter in der medialen Vena saphena für intravenöse Verabreichung von Ketamin.
4. Test für erfolgreiche Narkoseeinleitung durch Kneifen einen Fuß auf die Vorderpfote dann beobachtet, ob die Katze die Pfote zurückzieht. Sobald das Pedal Reflex verschwindet, unterdrücken den Würgereflex durch Besprühen Lidocain auf die Rachenwände dann intubieren die Katze mit einem 4,0-4,5 Endotrachealtubus.
5. Pflegen Anästhesie in der gesamten Imaging-Sitzung mit einer konstanten Rate Infusion von Ketamin (0,6-0,75 mg / kg / h) und inhalativen Isofluran (0,4-0,5%) in 100% Sauerstoff bei 1-1,5 l / min geliefert. Kombinieren Sie 60 ml Kochsalzlösung und 0,07 ml Ketamin in einem 60-ml-Spritze, dann legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe. Dieser Schritt kann vor premedicating die Katze durchgeführt werden.
6. Zeigen Warmwachs gefüllte Wärmekissen auf dem Boden der MRI-kompatiblen sgeführt (Fig. 3a und 3c) Schicht dann das isolierende Kunststoffluftpolsterfolie rund um die Innenwände des Schlittens.
7. Legen Sie die Katze in einem Brustbeinposition innerhalb der isolierenden Luftpolsterfolie in der MRI-kompatiblen Schlitten (Abbildung 3c).
8. Sobald die Katze ist so positioniert, stellen Sie den Kopf, um den Zugriff auf die Ohren bekommen. Rollen Sie die Schaumstoff-Ohrstöpsel in den kleinstmöglichen Durchmesser setzen Sie dann jedes Ohr Spitze tief in den Gehörgang. Einmal eingesetzt, sollten die Schaumstoff-Ohrspitzen zu erweitern, um den Raum in die Gehörgänge zu füllen.
9. Stellen Sie die Katze bis sein Kopf richtig in dem 3-Kanal-Funkfrequenz-(RF)-Spule (Abbildung 3b) positioniert. Stabilisieren Sie den Kopf mit akustischen Dämpfung Memory-Schaum (Abbildung 3d). Zeigen Schaum um die Ohren, um zusätzliche Dämpfung der Scanner Lärm bieten.
10. Wickeln Sie die Katze in der Decke der isolierenden Kunststoffluftpolsterfolie und befestigen und den Transport der Schlitten an den Scanner-Bett.
11. Verbinden Sie die Infusionsleitungen, Anästhesie Förderrohren und Überwachungsgeräte für die Katze. Schließen Sie die Kopfhörer an den Kopfhörerkabelbaugruppe für das Eindringen Tafel angebracht.
12. Starten Sie die Ketamin-Infusion an der Basis Flussrate von 0,6 mg / kg / h dann die Durchflussrate zu erhöhen, wie auf der Grundlage der Narkosetiefe erforderlich. Stellen Sie die Anfangsdosis Isofluran 0,5% dann auf 0,4% verringern, wenn die anatomischen Scans wurden gesammelt.
13. Überwachen und aufzeichnen, Sauerstoffsättigung im Blut der Katze, endexspiratorischen CO _2-Niveaus, Herzfrequenz, Atmung und rektale Temperatur (wenn möglich) während des Experiments mit der MRT-kompatiblen Überwachungsanlagen in einem angemessenen Abstand vom Scanner Bohrung positioniert. Tabelle 1 sind die Mittelwerte und Bereiche der physiologischen Messungen für die erfolgreiche Durchführung dieses Verfahrens. Stetige Erhöhung der Herzfrequenz und Atmung werden in der Regel mit baldige Erholung von der Narkose verbunden.
14. Nachdem die session abgeschlossen ist, entfernen Sie die Katze aus dem Schlitten. Weiter zu Zusatzheizung mit Wärmekissen und Handtücher, bis das Tier vollständig erholt. Sobald die Würgereflex Renditen, entfernen Sie den Tubus. Überwachen Sie die Katze, bis die Aufrichtungsreflexes wiederhergestellt ist dann wieder das Tier in der Einrichtung. Bewerten Sie das Tier am Tag nach dem Verfahren keine negativen Auswirkungen aus dem Experiment zu gewährleisten.

3. Brain Imaging

1. Sammeln anatomischen Scans von Gehirn der Katze in axialer Schichtorientierung. Verwenden Sie die folgenden Abbildungsparameter für die anatomischen Referenzvolumen: FLASH-Bildgebungssequenz mit TR = 750 ms, TE = 8 ms, Matrix = 256 x 256, Erwerb Voxelgröße = 281 um x 281 um x 1,0 mm. Die Dauer der anatomischen Scan beträgt ca. 6 min. Abbildung 4 (links) stellt eine mit den angegebenen Parametern erhaltenen Probe anatomischen Schnittbild.
2. Verwenden Sie die folgenden Parameter für die Imaging-funknal Bände: segmentierten verschachtelte Echo-Planar-Akquisition (EPI) mit TR = 1000 ms, TE = 15 ms, 3 Segmente / Flugzeug, 21 x 1 mm Scheiben; Matrix = 96 x 96; Feld-of-view = 72 mm x 72 mm; Erwerb Voxelgröße = 0,75 mm x 0,75 mm x 1,0 mm;. Akquisitionszeit = 3 sec / Volumen Abbildung 4 (rechts) stellt eine mit den angegebenen Parametern erhaltenen Probe Funktionsschnittbild.

4. Stimulus Präsentation

1. Präsentieren Sie eine Breitband-weißes Rauschen Reiz (0-25 kHz, 100 ms Salven 5 ms Anstiegs / Abfallzeit, 1 Präsentation alle 200 ms, 90-100 dB SPL) in einem Block-Design, in dem die auditiven Reiz für 30 Sekunden gespielt und mit einer 30 sec Basislinie (kein Stimulus-) Zustand (Fig. 5) abwechseln. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis akustisch evozierte BOLD-Aktivität im auditorischen Kortex beobachtet. Die Dauer der einzelnen Funktionslauf unter Verwendung eines Block-Design ist ungefähr 4,5 min für 90 Volumina.
2. Präsentieren Sie den Reiz in der apchenden Block Ausgestaltung für die gewünschte Anzahl an funktionellen verläuft.

5. Datenanalyse

1. Wählen Sie die entsprechende fMRT-Analyse-Software (zB SPM, FSL), die erworbenen Funktionsmengen zu verarbeiten.
2. Richten Sie jeden Funktionsvolumen auf den nächsten in die Zeit der anatomischen Referenz Scan erfassten Volumens. Speichern die resultierende Bewegung die Korrekturwerte für die Verwendung in Schritt 5.6. Schließen Sie alle Funktions läuft, in der Drehkopfbewegungen mehr als 1 ° oder translatorische Bewegungen des Kopfes 1 mm überschreiten.
3. Coregister jeder Band auf die Referenz anatomische Scan.
4. Glatte jeden Band mit einem 2-mm-Halbwertsbreite (FWHM) Gauß-Filter.
5. Integrieren Sie eine Rechteck (Güterwagen)-Funktion, die dem ON-OFF Reiz Block-Design als Regressor in die allgemeine lineare Modell (GLM) entspricht.
6. Integrieren Sie Bewegung Korrekturwerte als Regressoren nicht von Interesse für bewegungsbezogene Artefakte ausmachen. Tragen Sie eine uncorrected statistische Schwelle von p = 0,001 und der GLM-Ergebnissen an Clustern von BOLD-Aktivierung anzuzeigen. Bestimmen Sie die Größe des kleinsten Cluster, einen korrigierten erfüllt (Familie weise Fehler: FWE) Schwelle von p <0,05 auf Clusterebene. Stellen Sie den Cluster Umfang Schwelle auf diesen Wert, um statistisch signifikante Cluster in Regionen von Interesse zu sehen.
7. Definieren Sie die BOLD Prozent Signaländerung (PSC) in jedem Voxel als die Differenz zwischen der mittleren BOLD-Signal während der Stimulationsblöcke und die mittlere BOLD-Signal während der Baseline-Blöcke.

Ergebnisse

Repräsentative funktionellen Daten wurden in einer horizontalen Bohrung 7T Scanner erworben und unter Verwendung des Statistik Parametric Mapping Toolbox in MATLAB analysiert. Robust kortikalen hämodynamischen Reaktionen auf akustische Stimulation durchweg bei Katzen mit dem beschriebenen Versuchsprotokoll ⁴³ beobachtet. Fig. 6 zeigt die BOLD-Aktivierung bei 2 Tieren in Reaktion auf ein Breitbandrauschen 30 sec Stimulus in Blockbauweise dargestellt. T-Statistik Karten der Breitbandrauschen ...

Diskussion

In der Gestaltung einer fMRI-Experiment für einen narkotisierten Tiermodell der Gehörfunktion, sollten die folgenden Fragen sorgfältig geprüft werden: (i) die Auswirkungen der Narkose auf kortikalen Antworten, (ii) die Wirkung der Hintergrundscanner Lärm, und (iii) die Optimierung der Datenerfassungsphase der experimentellen Verfahren.

Während ein narkotisierten Vorbereitung bietet den wichtigen Vorteil zur Herstellung einer längere Sedierung und Minimierung potenzieller Kopfbewegung ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Atropine sulphate injection 0.5 mg/ml	Rafter 8 Products
Acepromazine 5 mg/ml	Vetoquinol Inc.
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml	Bimeda-MTC
Dexmedetomidine hydrochloride (Dexdomitor 0.5 mg/ml)	Orion Pharma
Isoflurane 99.9%	Abbott Laboratories
Lidocaine (Xylocaine endotracheal 10 mg/metered dose)	Astra Zeneca
Lubricating opthalmic ointment (Refresh Lacri Lube)	Allergan Inc.
Saline 0.95%
IV Catheter 22 g (wings)
IV Extension Set	Codan US Corp.	BC 269
IV Administration Set 10 drips/ml
Endotracheal tube 4.0
Heating pads (Snuggle Safe)	Lenric C21 Ltd.
Syringe 60 ml
Equipment
External sound card	Roland Corporation	Cakewalk UA-25EX
Stereo power amplifier	Pyle Audio Inc.	Pyle Pro PCAU11
MRI-compatible insert earphone system	Sensimetric Corporation	Model S14
Foam ear tips for insert earphones	E-A-R Auditory Systems	Earlink 3B
End-tidal CO2 monitor	Nellcor	N-85
MRI-compatible pulse oximeter	Nonin Medical Inc.	Model 7500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-2208