Imagem Funcional do Cortex Auditivo em gatos adultos usando de alta campo fMRI

Resumo

Estudos funcionais do sistema auditivo em mamíferos têm sido tradicionalmente realizada usando técnicas espacialmente focadas, como registros eletrofisiológicos. O protocolo a seguir descreve um método de visualização de padrões de grande escala da atividade hemodinâmica evocada no córtex auditivo gato usando ressonância magnética funcional.

Resumo

O conhecimento atual de processamento sensorial no sistema auditivo de mamíferos é derivado principalmente de estudos eletrofisiológicos em uma variedade de modelos animais, incluindo macacos, furões, morcegos, roedores e gatos. A fim de traçar paralelos adequadas entre modelos humanos e animais de função auditiva, é importante estabelecer uma ponte entre os estudos de imagem funcional humanos e estudos eletrofisiológicos animais. A ressonância magnética funcional (fMRI) é um método minimamente invasivo estabelecido de medir padrões gerais de atividade hemodinâmica em diferentes regiões do córtex cerebral. Esta técnica é muito utilizada para sondar a função sensorial no cérebro humano, é uma ferramenta útil na ligação entre os estudos do processamento auditivo em ambos os seres humanos e animais e tem sido usado com sucesso para investigar a função auditiva em macacos e roedores. O protocolo a seguir descreve um procedimento experimental de investigação da função auditiva em adultos anestesiadosgatos, medindo alterações hemodinâmicas evocado de estímulo no córtex auditivo usando fMRI. Este método permite a comparação das respostas hemodinâmicas em diferentes modelos de função auditiva conduzindo assim a uma melhor compreensão das características independentes de espécies de mamíferos, o córtex auditivo.

Introdução

Compreensão atual do processamento auditivo em mamíferos é derivado principalmente de estudos eletrofisiológicos invasivos em macacos ^{1-5, 6-10} furões, morcegos, roedores ^{11-14 15-19, 20-24} e gatos. Técnicas eletrofisiológicas comumente utilizam microeletrodos extracelulares para registrar a atividade de neurônios individuais e múltiplas dentro de uma pequena área de tecido neural em torno da ponta do eletrodo. Fundada métodos de imagem funcionais, tais como imagens ópticas e de ressonância magnética funcional (fMRI), servem como complementos úteis para gravações extracelular, fornecendo uma perspectiva macroscópica orientados para actividades simultâneas em vários regiões, espacialmente distintas do cérebro. Sinal intrínseco imagem óptica facilita a visualização da atividade evocada no cérebro medindo mudanças relacionadas com a actividade nas propriedades de reflectância do tecido superfície, enquanto fMRI utiliza o sangue oxigênio-nível-dependente (BOLD)contraste para medir alterações hemodinâmicas evocado de estímulo em regiões do cérebro que são ativas durante uma determinada tarefa. Imageamento óptico exige a exposição direta da superfície cortical a medidas de mudanças na reflectância do tecido superfície que estão relacionados com a atividade evocada-estímulo ^25. Em comparação, a fMRI é não-invasivo e explora as propriedades paramagnéticas de sangue oxigenado para medir tanto a superfície cortical ^26-28 e baseada no sulco ^27,29 atividade evocada dentro de um crânio intacto. Fortes correlações entre o sinal BOLD ea atividade neuronal no córtex visual não-humano primata ³⁰ e no córtex auditivo humano ³¹ validar fMRI como uma ferramenta útil para estudar a função sensorial. Desde fMRI tem sido amplamente utilizado para estudar características da via auditiva como organização tonotópico ^32-36, lateralização da função auditiva ^37, padrões de ativação cortical, identificação de regiões corticais ^38, efeitos de somintensidade em propriedades de resposta auditiva ^39,40, e as características da resposta BOLD tempo claro ^29,41 em modelos de ratos humano, macaco, e, o desenvolvimento de um protocolo de imagem funcional adequado para estudar a função auditiva em que o gato iria fornecer um complemento útil para a literatura imagiologia funcional. Enquanto fMRI também tem sido usado para explorar os vários aspectos funcionais do córtex visual no gato anestesiado ^26-28,42, poucos estudos têm utilizado esta técnica para analisar o processamento sensorial no córtex auditivo gato. O objetivo do presente Protocolo é estabelecer um método eficaz de usar fMRI para quantificar a função no córtex auditivo do gato anestesiado. Os procedimentos experimentais descritos neste manuscrito foram usados ​​com sucesso para descrever as características do curso de tempo de resposta BOLD no gato adulto córtex auditivo ^43.

Protocolo

O seguinte procedimento pode ser aplicado a qualquer experiência de imagem em que são utilizados gatos anestesiados. As medidas que são especificamente necessárias para experiências auditivas (passos 1,1-1,7, 2,8, 4,1) pode ser modificado para acomodar outros protocolos de estímulo sensorial.

Todos os procedimentos experimentais recebeu a aprovação do Uso de Animais Subcomissão do Conselho Universitário sobre Cuidados Animais da Universidade de Western Ontario e seguiu as orientações especificadas pelo Canadian Council on Animal Care (CCAC) ^44. O experimento descrito necessita de aproximadamente 150 min, desde a preparação de animais para a recuperação. O curso do tempo da experiência está ilustrada na Figura 1.

1. Estímulo Equipamentos Preparação

A Figura 2 mostra os componentes electrónicos e ligações correspondentes necessários para a geração de um estímulo auditivo no scanner de IRM. Os requisitos são os forma: um computador, uma placa de som externa, um amplificador de potência stereo e um sistema de fone de ouvido compatível com fMRI.

1. Ligue o computador que será utilizado para apresentar o estímulo auditivo para a placa de som externa através da (USB) Cabo Universal Serial Bus.
2. Conecte os cabos que ligam os portos da placa de som externa de saída para as portas de entrada do amplificador de potência estéreo.
3. Conecte os cabos que ligam os portos do amplificador de potência estéreo de saída para as portas de entrada da caixa do transformador do sistema de fone de ouvido compatível com fMRI.
4. Conecte os fones de ouvido binaural para as portas da caixa de transformador de saída.
5. Use cabos blindados coaxiais com conexões BNC para conectar a caixa de transformador para o painel de penetração fora da sala de scanner.
6. Conecte o conjunto de cabo do fone de ouvido para os portos correspondentes BNC no painel penetração dentro da sala de scanner.
7. Conecte as pontas de espuma de ouvido para os fones de ouvido, em seguida, conectar os fones de ouvido to conjunto de cabos. Executar um teste de estímulo auditivo para confirmar que o som está sendo transmitido do computador para os fones de ouvido. Desconecte os fones de ouvido e inserir as pontas de espuma de ouvido com segurança nos ouvidos do gato durante a fase de preparação de animais (passo 2.7).

2. Preparação animal

1. Para premedicate o gato, administrar uma mistura de sulfato de atropina sedativo (0,02 mg / kg) e acepromazina (0,02 mg / kg) através de uma injecção subcutânea (SC).
2. Após 20 min, administrar a cetamina (4 mg / kg) e cloridrato de dexmedetomidina (0,02-0,03 mg / kg) através de uma injecção intramuscular (IM) para induzir a anestesia. A cetamina é geralmente combinada com um sedativo e relaxante muscular, neste caso, o cloridrato de dexmedetomidina, para reduzir os tremores e rigidez muscular frequentemente observados quando a cetamina é utilizado sozinho ^45. Esta combinação de anestésico geralmente induz aproximadamente 150 min de sedação e é frequentemente utilizado na prática veterinária para induziranestesia em animais de pequeno porte.
3. Uma vez que o gato perdeu o seu reflexo de endireitamento, aplicar pomada oftálmica para os olhos para evitar a secura durante o procedimento. Coloque um cateter na veia safena medial para administração intravenosa de cetamina.
4. Teste para indução anestésica sucesso por beliscar um dedo do pé na pata dianteira então observar se o gato retira a sua pata. Uma vez que o reflexo pedal desaparece, suprimir o reflexo de vômito por aspersão de lidocaína nas paredes da faringe depois entubar o gato com um tubo endotraqueal 4,0-4,5.
5. Manter anestesia durante toda a sessão de imagens com uma infusão de taxa constante de ketamina (,6-,75 mg / kg / h) e isoflurano inalado (0,4-0,5%) entregue em oxigênio a 100% 1-1,5 L / min. Combinar 60 mL de solução salina e 0,07 ml de cetamina em uma seringa de 60 ml, em seguida, colocar a seringa na bomba de seringa. Este passo pode ser realizado antes premedicating o gato.
6. Lugar quente almofadas de aquecimento cheio de cera no chão dos s MRI-compatívelled (Figuras 3a e 3c), em seguida, a camada de isolante plástico bolha de plástico ao redor das paredes interiores do trenó.
7. Coloque o gato em uma posição esternal dentro do envoltório de bolha de isolamento no trenó MRI-compatível (Figura 3c).
8. Uma vez que o gato está posicionado, ajustar a cabeça de acesso para os ouvidos. Rolar as pontas da orelha da espuma para o menor diâmetro possível, então insira cada ponta da orelha profundamente no canal auditivo. Uma vez inserido, as pontas de ouvido de espuma deve expandir-se para encher o espaço dentro do canal auditivo.
9. Ajuste o gato até que sua cabeça está devidamente posicionado dentro da bobina (Figura 3b) de 3 canais de rádio-freqüência (RF). Estabilize a cabeça com acústica de espuma de memória de amortecimento (Figura 3d). Coloque espuma em torno das orelhas para proporcionar a atenuação adicional do ruído do scanner.
10. Enrole o gato no cobertor de isolamento plástico bolha de plástico, em seguida, proteger e transportar o trenó para o scanner.
11. Ligue as linhas de infusão, tubos de distribuição de anestésicos e equipamentos de monitoramento para o gato. Conecte os fones de ouvido para o conjunto de cabo do fone de ouvido conectado ao painel de penetração.
12. O início da infusão de cetamina à taxa de fluxo de base de 0,6 mg / kg / hr, em seguida, aumentar a taxa de fluxo tal como exigido com base na profundidade de anestesia. Definir a dose inicial isoflurano a 0,5%, em seguida diminuir para 0,4% uma vez que os exames anatômicos foram recolhidos.
13. Monitorar e gravar a saturação do gato de oxigênio no sangue, CO exalado _{2 andares,} freqüência cardíaca, respiração e temperatura retal (se possível) durante todo o experimento usando equipamento de monitoramento MRI-compatível posicionado a uma distância adequada do furo scanner. Tabela 1 apresenta os Os valores médios e os intervalos das medições fisiológicas para a execução bem sucedida deste procedimento. Aumentos constantes na freqüência cardíaca e respiração são normalmente associados com a recuperação iminente da anestesia.
14. Após as sessão estiver concluída, remova o gato do trenó. Continuar a fornecer aquecimento suplementar com almofadas de aquecimento e toalhas até que o animal se recupera totalmente. Uma vez que os reflexos da mordaça retornos, remova o tubo endotraqueal. Monitorar o gato até que o reflexo de endireitamento é restaurada em seguida, retornar o animal para a instalação. Avaliar o animal no dia após o procedimento para garantir que não haja efeitos negativos da experiência.

3. Brain Imaging

1. Colete scans anatômicas do cérebro do gato em uma orientação fatia axial. Utilize os seguintes parâmetros de imagem para o volume de referência anatômica: Seqüência de imagens FLASH com TR = 750 ms, TE = 8 ms, matriz = 256 x 256, a aquisição tamanho do voxel = 281 mM mM x 281 x 1,0 mm. A duração do exame anatômico é de aproximadamente 6 min. Figura 4 (painel esquerdo) oferece uma fatia de anatômica amostra obtida usando os parâmetros especificados.
2. Utilize os seguintes parâmetros de imagem para o functiovolumes nal: aquisição de eco-planar intercalado segmentada (EPI), com TR = 1.000 ms, TE = 15 ms, 3 segmentos / avião, 21 x 1 mm fatias; matriz = 96 x 96; campo de visão = 72 milímetros x 72 mm; aquisição tamanho do voxel = 0,75 milímetros x 0,75 mm x 1,0 mm;. tempo de aquisição = 3 seg / volume Figura 4 (painel direito) fornece uma fatia de imagem funcional amostra obtida usando os parâmetros especificados.

4. Estímulo Apresentação

1. Apresentar um ruído branco estímulo de banda larga (0-25 kHz, 100 rajadas ms com 5 tempo de subida / descida ms, uma apresentação a cada 200 ms, 90-100 dB SPL), em um delineamento em blocos em que o estímulo auditivo é jogado por 30 segundos e alternado com uma linha de base de 30 segundos (sem estímulo) condição (Figura 5). Repita este passo até que a atividade BOLD acusticamente evocadas é observada no córtex auditivo. A duração de cada corrida funcional utilizando um delineamento em blocos é de aproximadamente 4,5 min por 90 volumes.
2. Apresentar o estímulo no apquada configuração de blocos para o número desejado de execuções funcionais.

5. Análise de Dados

1. Selecione o software de análise fMRI apropriado (por exemplo, SPM, FSL) para processar os volumes funcionais adquiridas.
2. Realinhar cada volume funcional com o volume adquirido mais próxima no tempo a referência anatômica digitalização. Salve os valores de correção de movimento resultantes para uso no passo 5.6. Excluir quaisquer execuções funcionais em que os movimentos da cabeça de rotação superiores a 1 ° ou movimentos da cabeça de translação exceder 1 mm.
3. Coregister cada volume a referência anatômica digitalização.
4. Alise cada volume com 2 milímetros metade do máximo de largura total (FWHM) do filtro de Gauss.
5. Incorporar uma função de onda quadrada (vagão), que corresponde ao projeto de bloco estímulo ON-OFF como um regressor para o modelo linear geral (GLM).
6. Incorporar valores de correção de movimento como regressores de interesse para explicar artefatos relacionados ao movimento. Aplique um ulimiar estatístico ncorrected de p = 0,001 para a GLM resulta para ver aglomerados de ativação BOLD. Determine o tamanho do menor grupo que se reúne uma corrigido (erro sábio-family: FWE) limiar de p <0,05 no nível de cluster. Defina o limite de extensão de cluster para esse valor para ver agrupamentos estatisticamente significativos em regiões de interesse.
7. Defina o BOLD mudança de sinal de porcentagem (PSC) em cada voxel como a diferença entre o sinal BOLD média durante os blocos de estimulação e do sinal BOLD média durante os blocos de linha de base.

Resultados

Dados funcionais representativos foram adquiridas em um scanner furo horizontal 7T e analisados ​​utilizando a caixa de ferramentas Statistical Parametric Mapping em MATLAB. Respostas hemodinâmicas corticais robusta para a estimulação auditiva têm sido consistentemente observada em gatos usando o protocolo experimental descrito ^43. Figura 6 ilustra a ativação BOLD em 2 animais em resposta a um estímulo 30 seg ruído de banda larga apresentados em blocos. Mapas estatística t do ru?...

Discussão

Na concepção de um experimento fMRI para um modelo animal anestesiado da função auditiva, as seguintes questões deve ser dada cuidadosa consideração: (i) o impacto da anestesia nas respostas corticais, (ii) o efeito do ruído do scanner plano, e (iii) a optimização da fase de recolha de dados do procedimento experimental.

Enquanto uma preparação anestesiado oferece a importante vantagem de produzir um prolongado período de sedação e minimizando o movimento da cabeça potencial ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Atropine sulphate injection 0.5 mg/ml	Rafter 8 Products
Acepromazine 5 mg/ml	Vetoquinol Inc.
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml	Bimeda-MTC
Dexmedetomidine hydrochloride (Dexdomitor 0.5 mg/ml)	Orion Pharma
Isoflurane 99.9%	Abbott Laboratories
Lidocaine (Xylocaine endotracheal 10 mg/metered dose)	Astra Zeneca
Lubricating opthalmic ointment (Refresh Lacri Lube)	Allergan Inc.
Saline 0.95%
IV Catheter 22 g (wings)
IV Extension Set	Codan US Corp.	BC 269
IV Administration Set 10 drips/ml
Endotracheal tube 4.0
Heating pads (Snuggle Safe)	Lenric C21 Ltd.
Syringe 60 ml
Equipment
External sound card	Roland Corporation	Cakewalk UA-25EX
Stereo power amplifier	Pyle Audio Inc.	Pyle Pro PCAU11
MRI-compatible insert earphone system	Sensimetric Corporation	Model S14
Foam ear tips for insert earphones	E-A-R Auditory Systems	Earlink 3B
End-tidal CO2 monitor	Nellcor	N-85
MRI-compatible pulse oximeter	Nonin Medical Inc.	Model 7500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-2208