Evaluación ecocardiográfica de la parte derecha del corazón en ratones

Resumen

Este artículo proporciona un protocolo para la evaluación ecocardiográfica del tamaño ventricular derecha e hipertensión pulmonar en los ratones. Las aplicaciones incluyen la determinación del fenotipo y la evaluación de serie en modelos de ratón inducido por la toxina de la cardiomiopatía y la enfermedad vascular pulmonar transgénicos y.

Resumen

Transgénicos y modelos tóxicos de la hipertensión arterial pulmonar (HAP) son ampliamente utilizados para estudiar la fisiopatología de la HAP y para investigar las posibles terapias. Dado el costo y el tiempo necesarios para la creación de modelos animales de la enfermedad, es fundamental que los investigadores tengan herramientas para evaluar con precisión la expresión fenotípica de la enfermedad. La disfunción ventricular derecha es la principal manifestación de la hipertensión pulmonar. La ecocardiografía es el pilar de la evaluación no invasiva de la función del ventrículo derecho en modelos de roedores y tiene la ventaja de definir de forma sencilla a los seres humanos en los que se utiliza la misma herramienta. Protocolos de ecocardiografía Publicado en modelos murinos de PAH son insuficientes.

En este artículo, se describe un protocolo para evaluar la RV y la función vascular pulmonar en un modelo de ratón de la HAP con una mutación dominante negativa BMPRII, sin embargo, este protocolo es aplicable a cualquier enfermedad que afectan a la vasculatura pulmonar o cardiaca derecha. Nosotrosproporcionar una descripción detallada de la preparación de los animales, adquisición de imágenes y cálculo hemodinámico del volumen sistólico, el gasto cardíaco y una estimación de la presión arterial pulmonar.

Introducción

Presión pulmonar elevada y ventrículo derecho (VD) disfunción son las características de la enfermedad vascular pulmonar en modelos animales y pacientes humanos con hipertensión arterial pulmonar (HAP). Modelos tóxicos (por ejemplo monocrotalina o hipoxia) Transgénicos y de HAP son ampliamente utilizados para estudiar la fisiopatología de la HAP y para investigar las posibles terapias. Dado el costo y el tiempo necesarios para la creación de modelos animales de la enfermedad, es fundamental que los investigadores tengan herramientas para evaluar con precisión la expresión fenotípica de la enfermedad.

La ecocardiografía es el pilar de la evaluación no invasiva de la función ventricular en modelos de roedores ^1,2. La ecocardiografía tiene la ventaja de traducción claro para los seres humanos en los que se utiliza la misma herramienta. Además, algunos modelos genéticos muestran una penetración incompleta ^3, la capacidad de identificar a los animales afectados de forma no invasiva permite ahorrar tiempo y recursos valiosos. La evaluación no invasiva de la enfermegravedad en sí, sin sacrificar un animal también permite a los investigadores estudiar en serie los efectos de las terapias de investigación. Esto es especialmente importante dada la rapidez con la que las terapias de traslación pueden progresar a ensayos en humanos ^4,5.

En los seres humanos, la evaluación ecocardiográfica del tamaño del VD y la hipertensión pulmonar es particularmente difícil debido a la posición retroesternal y la forma irregular de la RV ^6. Modelos de roedores tienen los problemas y retos de pequeño tamaño y la frecuencia cardíaca muy rápida (300-700 latidos / min). Los avances recientes, incluyendo mayores velocidades de fotogramas y transductores más pequeños han mejorado la calidad de imagen y la imagen consciente siquiera se les permite en algunos protocolos experimentales, aunque la mayoría de imágenes de roedores se realiza bajo anestesia ^7,8. Protocolos experimentales excelentes de la ecocardiografía en modelos de rata de la HAP se han descrito y validado en contra de ambos resonancia magnética y hemodinámica invasiva ^1,9. Sin embargo, la ecocardiografía publicadoprotocolos en los modelos murinos de PAH son insuficientes.

En este artículo, se describe un protocolo para evaluar la RV y la función vascular pulmonar en un modelo de ratón de la HAP con una mutación dominante negativa BMPRII y un modelo de RV postcarga aislada después de cerclaje de la arteria pulmonar, sin embargo, este protocolo es aplicable a cualquier enfermedad que afecte a la vasculatura pulmonar o cardiaca derecha. Vamos a describir la preparación de los animales y la evaluación detallada de su tamaño RV y función, así como principal arteria pulmonar (AP) de tamaño. También demostrar las técnicas y los cálculos necesarios para estimar el volumen sistólico y el gasto cardíaco. Las limitaciones técnicas impiden estimaciones Doppler exactas de la presión pulmonar, pero hemos aplicado un sustituto humano bien validado, arteria pulmonar tiempo de aceleración, para estimar la presión PA.

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Protocolo

1. Equipo de preparación

1. Examine el transductor de ultrasonidos para detectar defectos. Dependiendo del equipo utilizado, este paso puede no ser necesario.
   1. Si se observa una burbuja de aire, extraiga el tornillo situado en el lado derecho de la cabeza del transductor, y añadir agua estéril a través del agujero con una aguja de 26. Las burbujas de aire en el interior del cabezal del transductor son comunes. Se impedirá la adquisición de imágenes de calidad.
   2. Compruebe la membrana que cubre la sonda en busca de fugas o agujeros. Reemplace si es necesario.
2. Abra el software e inicializar la sonda.
   1. Elija el paquete cardiaca desde el menú desplegable, junto con el transductor adecuado. Haga clic en "inicializar". Utilice una sonda de 20 a 60 MHz para los ratones de menos de 35 g, y una sonda de 15 a 45 MHz para los ratones de más de 35 g.
   2. Seleccione el operador, animal y fecha en la pantalla de la demografía, y seleccione "start".

2. Ratón Preparation incluida la anestesia, Depilación, y Posicionamiento

1. Anestesia: coloque el ratón en una cámara de inducción y anestesiar con una mesa máquina de anestesia portátil que contenga un vaporizador de isoflurano y un recipiente de gas residual.
   1. Ajuste el vaporizador a 3% con una tasa de flujo de oxígeno de 3 L / min. Se utiliza este índice relativamente alto de anestesia para lograr el efecto anestésico rápido y por lo tanto minimizar la respuesta de estrés que pueden influir en la función cardíaca. La corta duración del protocolo minimiza cualquier posible riesgo para el animal. Es muy importante mantener siempre el tipo de anestesia el mismo. Este protocolo ha sido optimizado para el uso exclusivo de isoflurano como la anestesia, por lo tanto, las condiciones óptimas para otros agentes pueden variar de este protocolo. Una menor profundidad de la anestesia se puede elegir, dependiendo de las necesidades experimentales, pero una vez que se estableció un protocolo de anestesia, no debe ser cambiado. Anestesia afecta el ritmo cardíaco y other mediciones hemodinámicas. Por lo tanto, si se cambia la profundidad de la anestesia durante un experimento, los datos pueden no ser útiles para análisis. Si varios ratones son a ser fotografiado en un día, anestesiar por separado.
   2. Monitorear la temperatura ambiente para asegurar que es la misma entre los grupos experimentales. La temperatura ambiente puede afectar la reactividad vascular, incluso cuando el ratón está sobre una mesa se calienta, por lo que debe ser controlado y mantuvo el mismo entre los grupos experimentales que se compararán. Aunque este protocolo no mide directamente la temperatura de los animales, la temperatura ambiente y la tabla de constante asegura que hay poca variación en la temperatura entre los grupos experimentales.
2. Depilación: Eliminar el vello del pecho con una crema depilatoria después se anestesia el ratón. Comience la aplicación con un aplicador con punta de algodón, en las clavículas, y continuar hasta justo por debajo del diafragma.
   1. Coloque el ratón de nuevo en la cámara de anestesia durante 1 minpara permitir que el depilatorio para trabajar. Para determinar si la anestesia es eficaz, presione firmemente la uña del pulgar contra una de las patas del ratón. Si no hay retirar, la anestesia es adecuada. Si el miembro se retira, coloque el ratón de nuevo en la cámara de anestesia durante otro minuto.
   2. Aplique una pequeña cantidad de lubricante ungüento para los ojos del ratón para evitar daños en la córnea.
   3. Retire el cabello del pecho con un 2 en x 2 en gasa. El producto químico utilizado en la crema depilatoria es cáustico y daña la piel si se deja por mucho tiempo, por lo que se debe tener cuidado de eliminar todo el producto de la piel.
   4. Aplicar una crema hidratante de la piel después de la depilación.
3. Posicionamiento: Coloca el ratón en una posición ventrodorsal en una mesa de calefacción ajustada a 37 ° C. La colocación correcta es imprescindible para la adquisición de imágenes de calidad. Utilice una tabla que puede capturar la temperatura del cuerpo, la respiración y la frecuencia cardíaca. El uso de un sistema ferroviario integrado todaows para un posicionamiento preciso y, posteriormente, la optimización de la imagen.
   1. Cinta suavemente las cuatro patas y aplique una cantidad del tamaño de moneda de diez centavos de gel de transducción en el pecho.

3. Adquisición de Imágenes: Imágenes en paraesternal eje largo View

1. Bloquee el transductor de ultrasonido en su lugar dentro del montaje en el sistema ferroviario, y girarlo 10 ° en sentido contrario, de modo que la sonda de metal del transductor se coloca directamente sobre el corazón. Más específicamente, la sonda debe estar en el lado izquierdo del pecho, en la segunda o tercera espacio intercostal, y lateral al esternón.
   1. Manipular las x e y ejes ubicados en el sistema ferroviario, hasta que se obtenga el punto de vista correcto.
   2. Seleccione "Modo B". Esto se encuentra en la parte superior derecha de la consola del sistema, con el fin de proyectar una imagen en vivo 2D.
   3. Ver las siguientes estructuras anatómicas en el monitor:
      1. Todo el corazón desde el vértice a aorta - El vértice se visualizará en el extremo izquierdo de la pantalla, y la aorta en el extremo derecho.
      2. El lumen del ventrículo izquierdo (VI)
      3. La pared posterior del ventrículo izquierdo (LPW)
      4. Septo interventricular (IVS)
      5. El lumen del ventrículo derecho (VD)
      6. Anteriores y posteriores valvas de la válvula mitral (AML y PML)
      7. Aorta ascendente (AO)
      8. Aurícula izquierda (LA)
2. Obtener una medida de diámetro de la aorta en esta vista pulsando el botón de escaneo / congelación para "congelar" la imagen. A continuación, utilice el ratón para tirar hacia atrás a través del bucle de vídeo en la parte inferior de la imagen hasta el ventrículo izquierdo está en la sístole y la aorta está en su máximo diámetro.
   1. Haga clic en la herramienta de medición en la esquina superior izquierda de la pantalla y seleccione el icono que se parece a una línea diagonal. Izquierda haga clic en el ratón y dibujar una línea recta desde la parte anterior a la pared posterior de la aorta, perpendicular de su eje longitudinal. Guarde pulsando el botón "enmarcados".
   2. Creación de un bucle de vídeo pulsando "Cine Store"

. 4 Adquisición de Imágenes: Imágenes en paraesternal eje corto View

1. Vuelva a colocar el transductor a las 3 y 9 horas (transversales). Ángulo ligeramente caudal mediante la manipulación del soporte del transductor para lograr la mejor vista de la aorta y la luz de baja tensión. La sonda de metal se coloca horizontalmente y directamente sobre el esternón.
   1. Manipular los X e Y-ejes en el sistema ferroviario hasta obtener el punto de vista correcto. El lumen de LV se verá, junto con los músculos papilares anterolateral y posteromedial, que son visibles a la derecha del monitor. Este es el punto de referencia estándar para el eje corto, lo que indica la porción media del ventrículo izquierdo, Donde se hacen las mediciones de dimensión. Desviarse un poco desde el punto de referencia con las x e y ejes para lograr diferentes estructuras anatómicas a la vista, será necesario, pero el posicionamiento se explica haciendo referencia a la opinión anterior.
2. Obtener las siguientes medidas en el eje corto:
   1. Modo B
      1. Dos mediciones más diametrales de la aorta.
      2. Tres mediciones de la arteria pulmonar.
   2. Modo Doppler pulsado (DP)
      1. Tres mediciones integrales de tiempo de velocidad (IFP) de la aorta
      2. Tres mediciones VTI de la arteria pulmonar medida justo proximal a la válvula pulmonar.
      3. Medir la arteria pulmonar tiempo de aceleración mediante el trazado de la curva de VTI desde el principio del flujo de sangre a la velocidad pico.
   3. Modo M
      1. Tres mediciones del diámetro interno del ventrículo izquierdo en diastole (LVIDd)
      2. Tres mediciones del diámetro interno del ventrículo izquierdo en sístole (LVIDs)
      3. Tres mediciones del diámetro interno del ventrículo derecho (RVID). El lumen RV sólo serán visibles en esta vista si se dilata.
      4. Medir la frecuencia cardiaca tres veces usando m-mode trazando la distancia entre dos picos diastólico de la pared anterior del ventrículo izquierdo durante tres ciclos cardíacos diferentes.
3. Mediciones de modo B:
   1. Manipular el eje Y cranealmente desde el punto de vista del músculo papilar, hasta que la válvula semilunar de la aorta entra en el foco.
   2. Obtener mediciones de la aorta justo por encima de la válvula en el diámetro mayor.
   3. Haga clic en la herramienta de medición en la esquina superior izquierda de la pantalla, y seleccione el icono que se parece a una línea diagonal.
   4. Izquierda haga clic en el ratón y dibujar una línea recta desde la parte anterior a la pared posterior de la aorta.
   5. Manipular tque x e y ejes hasta que la arteria pulmonar principal se bifurca. Esta estructura será visto anteriormente, y a la derecha de la aorta en el monitor.
   6. Manipular el cranealmente eje y hasta que el anillo de la arteria pulmonar principal está a la vista. Esto no será tan claramente definida como la aorta.
   7. "Congelar" la imagen y obtener la medida en sístole.
   8. Recoge tres mediciones en total.
4. Onda pulsada (PW) mediciones Doppler: Modo PW se utiliza principalmente para la evaluación hemodinámica del flujo de sangre a través de arterias y venas. En este protocolo, se puede utilizar para recuperar tres mediciones integrales de tiempo la velocidad de la aorta y la arteria pulmonar.
   1. Traiga la aorta nuevo a la vista, como se describe en el paso 4.3.1, y el punto 1 bala.
      1. Seleccione "Modo PW". Esta se encuentra en la esquina superior derecha de la consola del sistema y producirá una lectura Doppler del flujo sanguíneo a través de la aorta.
      2. Coloque la savolumen mple justo por encima del nivel de la válvula aórtica. Pueden necesitar ser ajustado ligeramente para obtener sobres Doppler suficientes Las x e y ejes. Los sobres deben tener bordes blancos, y un interior que indica el flujo de sangre laminar hueca.
      3. Una vez que se obtiene una visión suficiente, "congelar" la imagen y trace el borde del sobre Doppler. Esto calculará el VTI.
      4. Con la perilla de "ángulo", situado en la consola del sistema hacia la derecha hasta la línea amarilla segmentado ve en la imagen en la parte superior derecha del monitor se encuentra a 0 °. Esta línea amarilla representa la dirección del flujo sanguíneo a través del vaso. Dado que el propio transductor está en ángulo de tal manera para producir una vista en sección transversal o transversal del corazón, la línea debe ser ajustado a 0 °, para alinearse con el flujo vertical de sangre a través de la aorta ascendente.
   2. Coloque el volumen de la muestra proximal al nivel de la válvula pulmonar en el centro de laventrículo derecho del tracto de salida y repetir las mediciones de las IFP que el anterior. El flujo de sangre debe aparecer invertida, o frente al flujo de la sangre en relación a la aorta en el monitor.
5. Mediciones en modo M: formación de imágenes en modo M ofrece alta resolución temporal de movimiento del tejido a lo largo de un único haz de ultrasonidos, y se utiliza para cuantificar dimensiones de la cavidad, así como para estudiar valvular, infarto, y el movimiento de la pared del vaso.
   1. Reanudar "Modo B" y la posición del transductor para obtener la "vista de referencia" (la vista en sección transversal del ventrículo izquierdo a nivel de los músculos papilares).
   2. Pulse el botón "M-mode". Esto producirá una señal de video continuo en el que el movimiento de las siguientes estructuras anatómicas será visible como una "cinta". Si dilatada, aparecerá el lumen de RV en la parte superior de la alimentación como un lazo negro muy fino. El septo interventricular (SIV) será visible como una cinta opaca directamente por debajo de la RVlumen. El lumen de LV se verán directamente debajo de los IVS. Es el gran espacio negro que ocupa la mayor parte de la alimentación. Debajo de la luz del LV es la pared posterior del VI (LVPW), que se ve como una cinta opaca.
   3. Congelar la imagen y tire hacia atrás a través del bucle de vídeo si es necesario a un punto donde la respiración no se está produciendo. Cuando los respira ratón, la adquisición de la imagen se interrumpe por el movimiento de la pared del diafragma y el pecho, produciendo de este modo un artefacto distorsionada "manchado" en la alimentación que se produce con frecuencia regular.
   4. Obtenga los siguientes mediciones usando el icono de la línea diagonal:
      1. Tres mediciones de LV terminan dimensión diastólica, que aparece como la mayor distancia entre el IVS y VEPP.
      2. Tres mediciones de LV dimensión sistólica final, que aparece como la distancia más corta entre el IVS y LVPW.
      3. Tres mediciones de la frecuencia cardíaca, que se realiza haciendo clic en el icono del corazón y la medición del pico sistólicasistólica máxima del LVPW.
      4. Si la luz del RV se dilatan, obtener tres mediciones utilizando el icono de la línea diagonal.
   5. Grabar un bucle de vídeo de la corta en eje paraesternal en modo "B" pulsando el botón "Cine Store".
   6. Ir a "Archivo", seleccione "Examinar Study" para recapitular sus medidas, haga clic en "Fin de sesión", y luego "Confirmar datos de sesión."
   7. Recuperar el ratón como se describe en el protocolo del IACUC y limpiar.
   8. Exportar datos como un archivo CSV a una unidad flash para su posterior análisis.
6. Calcular los siguientes parámetros de la función cardíaca (Tabla 1):
   1. Ventricular izquierdo del área del tracto de salida
   2. Izquierda volumen sistólico del ventrículo
   3. Ventrículo izquierdo del gasto cardíaco
   4. Fracción de acortamiento
   5. Área de la arteria pulmonar
   6. Arteria pulmonar tiempo de aceleración
   7. Derecho volumen sistólico del ventrículo
   8. El índice cardíaco

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Resultados

Los principales objetivos de este protocolo son para cuantificar el tamaño y la función del VD, y para comprender el grado en que la vasculatura pulmonar está enfermo. La preparación adecuada de los equipos tanto en el ratón y la ecocardiografía es esencial para obtener resultados exactos y reproducibles. Los ratones deben tener su pecho depilado y las extremidades asegurado a la plataforma de imágenes con cinta adhesiva. Anestesia, en este caso de isoflurano, se administra a través de cono de la nariz. El trans...

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Discusión

Los modelos de ratón de la enfermedad, ya sea transgénica o relacionados con la toxina, requieren la validación fenotípica que el modelo de realidad recapitula la enfermedad humana que se pretende imitar. Esta validación a menudo se puede lograr por la presencia o ausencia de una característica particular, por ejemplo el desarrollo de un tumor. Sin embargo, los modelos que dan lugar a alteraciones hemodinámicas, como los modelos de constricción de la aorta de la hipertrofia ventricular izquierda o nuestro modelo...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 770 High Resolution Micro-Ultrasound System	Visualsonics Inc.		get more info at www.visualsonics.com/products
RMV (Real-Time MicroVisualization) 704B 40 mH Scanhead w/ Encapsulated Transducer	Visualsonics Inc.		get more info at www.visualsonics.com/products
Vevo Integrated Rail System including the Physioogical Monitoring System	Visualsonics Inc.		get more info at www.visualsonics.com/products
Computer Monitor set up for use with the Vevo770	DELL or other General Supplier
Computer Mouse set up for use with the Vevo770	General Supplier
Vevo770 Cardiac Package Software	Visualsonics Inc.		get more info at www.visualsonics.com/products
VetEquip Portable Tabletop Anesthesia Machine with an Isoflurane Vaporizer	VetEquip		get more info at vetequip.com
Activated Charcoal Waste Gas Containers	VetEquip/Vaporguard	931401	get more info at vetequip.com
Puralube Eye Ointment	Henry Schein		get more info at henryschein.com
Ecogel 100 Ultrasound Gel	EcoMed Pharmaceuticals	30GB	get more info at ecomed.com
3M Transpore Tape	Fisher Scientific	1527-0	get more info at fishersci.com
Small Flathead Screwdriver	General Supplier
Sterile H2O	DDI H2O from faucet and then autoclave
6 in Cotton Tipped Applicators	Fisher Scientific		get more info at fishersci.com
Nair (depilatory cream)	General Supplier
2 in x 2 in Gauze Sponges	Fisher Scientific		get more info at fishersci.com