La valutazione ecocardiografica del cuore destro in topi

Riepilogo

Questo articolo fornisce un protocollo per la valutazione ecocardiografica delle dimensioni del ventricolo destro e l'ipertensione polmonare nei topi. Le applicazioni includono la determinazione del fenotipo e la valutazione seriale transgenici e modelli murini tossina-indotta di cardiomiopatia e la malattia vascolare polmonare.

Abstract

Transgenici e modelli tossici di ipertensione arteriosa polmonare (PAH) sono ampiamente utilizzati per studiare la fisiopatologia di IPA e di indagare potenziali terapie. Dato il costo e il tempo necessario per la creazione di modelli animali di malattia, è fondamentale che i ricercatori abbiano gli strumenti per valutare con precisione l'espressione fenotipica della malattia. Disfunzione ventricolare destra è la principale manifestazione di ipertensione polmonare. L'ecocardiografia è il cardine della valutazione non invasiva della funzione ventricolare destra in modelli di roditori e ha il vantaggio di chiara traduzione per l'uomo nel quale viene utilizzato lo stesso strumento. Protocolli di ecocardiografia Pubblicato in modelli murini di PAH sono carenti.

In questo articolo descriviamo un protocollo per la valutazione e RV funzione vascolare polmonare in un modello murino di PAH con una mutazione dominante negativa BMPRII, tuttavia, questo protocollo è applicabile a tutte le malattie che colpiscono il sistema vascolare polmonare o cardiaco destro. Noifornire una descrizione dettagliata della preparazione animale, acquisizione immagini e calcolo emodinamico di gittata sistolica, gittata cardiaca e una stima della pressione arteriosa polmonare.

Introduzione

Pressione polmonare elevata e del ventricolo destro (RV) erettile sono i tratti distintivi della malattia vascolare polmonare in modelli animali e pazienti umani affetti da ipertensione arteriosa polmonare (PAH). Transgeniche e (ad es monocrotaline o ipossia) modelli tossici di PAH sono ampiamente utilizzati per studiare la fisiopatologia di IPA e di indagare potenziali terapie. Dato il costo e il tempo necessario per la creazione di modelli animali di malattia, è fondamentale che i ricercatori abbiano gli strumenti per valutare con precisione l'espressione fenotipica della malattia.

L'ecocardiografia è il cardine della valutazione non invasiva della funzione ventricolare in modelli di roditori ^1,2. L'ecocardiografia ha il vantaggio di chiara definizione all'uomo in cui è utilizzato lo stesso utensile. Inoltre, alcuni modelli genetici mostrano penetranza incompleta ^3; la capacità di identificare in modo non invasivo animali affetti di risparmiare tempo e risorse preziose. La valutazione non invasiva della DiseÃse la gravità senza sacrificare un animale permette anche ai ricercatori di studiare in serie gli effetti delle terapie investigative. Questo è particolarmente importante data la rapidità con cui le terapie traslazionali possono progredire a sperimentazione umana ^4,5.

Negli esseri umani, la valutazione ecocardiografica di dimensioni camper e ipertensione polmonare è particolarmente difficile a causa della posizione retrosternale e la forma irregolare del RV ^6. Modelli di roditori sono le sfide aggiunte di piccole dimensioni e frequenze cardiache estremamente rapidi (300-700 beat / min). I recenti progressi compresi frame rate più elevati e trasduttori più piccoli hanno migliorato la qualità delle immagini e l'immagine cosciente anche permesso in alcuni protocolli sperimentali, sebbene la maggior parte delle immagini roditore viene eseguita in anestesia ^7,8. Sono stati descritti e validati Eccellente protocolli sperimentali di ecocardiografia in modelli di ratto di IPA sia contro la risonanza magnetica e l'emodinamica invasiva ^1,9. Tuttavia, l'ecocardiografia pubblicatoprotocolli in modelli murini di PAH sono carenti.

In questo articolo descriviamo un protocollo per la valutazione e RV funzione vascolare polmonare in un modello murino di PAH con una dominante mutazione BMPRII negativo e un modello di isolati RV postcarico dopo dell'arteria polmonare banding, tuttavia, questo protocollo è applicabile a tutte le malattie che colpiscono l' vascolare polmonare o cardiaco destro. Descriveremo la preparazione degli animali e valutazione dettagliata delle dimensioni e RV funzione così come arteria polmonare (PA) formato. Dimostriamo anche le tecniche ei calcoli necessari per stimare la gittata sistolica e della gittata cardiaca. Limitazioni tecniche ostino stime accurate Doppler della pressione polmonare, ma ci hanno applicato un surrogato umano ben validato, dell'arteria polmonare tempo di accelerazione, per stimare la pressione PA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Preparazione del materiale

1. Esaminare il trasduttore ad ultrasuoni per i difetti. A seconda delle attrezzature utilizzate, questa operazione può essere superflua.
   1. Se una bolla d'aria si osserva, rimuovere la vite posta sul lato destro della testa trasduttore, e aggiungere acqua sterile attraverso il foro con un ago G 26. Le bolle d'aria all'interno della testa del trasduttore sono comuni. Essi impediscono l'acquisizione di immagini di qualità.
   2. Controllare la membrana che ricopre la sonda per perdite o fori. Sostituire se necessario.
2. Aprire il software e inizializzare la sonda.
   1. Scegliere il pacchetto cardiaco dal menu a tendina, insieme con il trasduttore appropriato. Fare clic su "inizializzazione". Utilizzare una sonda 20-60 MHz per i topi di sotto dei 35 g ed una sonda 15-45 MHz per i topi superiori a 35 g.
   2. Selezionare l'operatore, animale e data sullo schermo demografia, e selezionare "start".

2. Topo Preparation Compreso Anestesia, Depilazione, e Posizionamento

1. Anestesia: posto del mouse in una camera di induzione e anestetizzare con un tavolo macchina per anestesia top portatile contenente un vaporizzatore isoflurano e un contenitore di gas di scarico.
   1. Impostare il vaporizzatore al 3% con un flusso di ossigeno di 3 L / min. Questo tasso relativamente elevato di anestesia viene utilizzata per ottenere una rapida effetto anestetico e quindi ridurre la risposta allo stress che possono influenzare la funzione cardiaca. La breve durata del protocollo minimizza qualsiasi rischio potenziale per l'animale. E 'molto importante mantenere sempre il tasso anestesia stesso. Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso esclusivo di isoflurano come anestetico, quindi le condizioni ottimali per altri agenti possono variare da questo protocollo. Un minore profondità dell'anestesia può essere scelto a seconda delle esigenze sperimentali, ma una volta stabilito un protocollo anestetico, ma non deve essere cambiato. Anestesia colpisce la frequenza cardiaca e Other misurazioni emodinamiche. Pertanto, se la profondità di anestesia viene modificato durante un esperimento, i dati potrebbero non essere utile per le analisi. Se più i topi sono per essere ripreso in un giorno, li anestetizzare separatamente.
   2. Controllo temperatura ambiente per assicurarsi che sia la stessa tra gruppi sperimentali. La temperatura ambiente può influenzare vasoreattività, anche quando il mouse è su un tavolo riscaldato, quindi dovrebbe essere monitorato e mantenuto lo stesso tra i gruppi sperimentali che verranno confrontati. Sebbene questo protocollo non misura direttamente la temperatura degli animali, ambiente e tabella temperatura costante assicura che c'è una piccola variazione di temperatura tra gruppi sperimentali.
2. Depilazione: Rimuovere i peli dal petto con una crema depilatoria dopo che il mouse è anestetizzato. Inizia applicazione con un applicatore con punta di cotone, le clavicole, e continuare a appena sotto il diaframma.
   1. Posizionare il mouse di nuovo in camera di anestesia per 1 minper consentire l'depilatorie di lavorare. Per determinare se l'anestesia è efficace, premere con forza il pollice contro una delle zampe del topo. Se non c'è ritirarsi, anestesia è adeguata. Se l'arto si ritira, posizionare il mouse di nuovo nella camera di anestesia per un altro minuto.
   2. Applicare una piccola quantità di lubrificante unguento per gli occhi del topo per evitare danni alla cornea.
   3. Eliminare i peli dal petto con un 2 x 2 in tampone di garza. La sostanza chimica utilizzata nella crema depilatoria è caustico, e danneggiare la pelle se viene lasciato per troppo tempo, quindi occorre prestare attenzione per rimuovere tutto il prodotto dalla pelle.
   4. Applicare una crema idratante della pelle dopo la rimozione dei capelli.
3. Posizionamento: posiziona il mouse in una posizione ventrodorsale su un tavolo riscaldato impostato a 37 ° C. Il corretto posizionamento è indispensabile per l'acquisizione di immagini di qualità. Utilizzare una tabella in grado di catturare la temperatura corporea, la respirazione e la frequenza cardiaca. L'uso di un sistema ferroviario integrato tuttiOWS per il posizionamento preciso e, successivamente, ottimizzazione delle immagini.
   1. Nastro delicatamente tutte e quattro le zampe e applicare una quantità dimensione centesimo di gel trasduzione al petto.

3. Acquisizione di immagini: Imaging in parasternale asse lungo View

1. Bloccare il trasduttore di ultrasuoni in posizione all'interno del supporto sul sistema ferroviario, e ruotarlo di 10 ° in senso antiorario, in modo che la sonda metallica del trasduttore è posizionato direttamente sopra il cuore. Più specificamente, la sonda dovrebbe essere sul lato sinistro del petto, nel 2 ° o 3 ° spazio intercostale, e lateralmente allo sterno.
   1. Manipolare le X e Y assi situati sul sistema ferroviario, fino ad ottenere la corretta visione.
   2. Selezionare "B Mode". Questo si trova nella parte superiore destra della console di sistema, per proiettare un'immagine live 2D.
   3. Guarda le seguenti strutture anatomiche sul monitor:
      1. L'intero cuore dall'apice alla aorta - L'apice verrà visualizzato sulla sinistra dello schermo, e l'aorta all'estrema destra.
      2. Il lume del ventricolo sinistro (LV)
      3. Parete posteriore del ventricolo sinistro (LPW)
      4. Setto interventricolare (IVS)
      5. Il lume del ventricolo destro (RV)
      6. Anteriori e posteriori lembi della valvola mitrale (AML & PML)
      7. Dell'aorta ascendente (AO)
      8. Atrio sinistro (LA)
2. Ottenere una misura diametrale dell'aorta in questa visualizzazione premendo il pulsante di scansione / freeze di "congelare" l'immagine. Quindi utilizzare il mouse per tirare indietro attraverso il loop video nella parte inferiore dell'immagine fino a quando il ventricolo sinistro in sistole, e l'aorta è al suo diametro massimo.
   1. Fare clic sullo strumento di misura nell'angolo in alto a sinistra dello schermo e selezionare l'icona che appare come una linea diagonale. Sinistro fare clic con il mouse e disegnare una linea retta dalla anteriori alla parete posteriore dell'aorta, perpendicular al suo asse lungo. Salvare premendo il pulsante "Store Frame".
   2. Creare un loop video premendo "Cine Store"

. 4 Acquisizione di immagini: Imaging in parasternale asse corto View

1. Riposizionare il trasduttore alle 3 e 9 posizioni (trasversali). Angolo leggermente caudale manipolando il trasduttore di montaggio per ottenere la migliore visualizzazione dell'aorta e lume LV. La sonda di metallo sarà posizionato orizzontalmente e direttamente sopra lo sterno.
   1. Manipolare le X e Y assi sul sistema ferroviario fino ad ottenere la corretta visione. Il lume LV saranno visti, insieme con i muscoli papillari anterolaterale e postero, visibili sulla destra del monitor. Questo è il punto di riferimento standard per l'asse corto, indicando la metà porzione del ventricolo sinistro, In cui vengono effettuate le misurazioni dimensionali. Deviando leggermente dal punto di riferimento con le X e Y assi per portare diverse strutture anatomiche in vista sarà necessario, ma il posizionamento è spiegata facendo riferimento alla vista sopra.
2. Ottenere le seguenti misure in asse corto:
   1. Modalità B
      1. Due misurazioni più diametrali dell'aorta.
      2. Tre misure del tratto di efflusso polmonare.
   2. Modalità onda Doppler pulsato (PW)
      1. Tre misure integrali temporali velocità (VTI) dell'aorta
      2. Tre misurazioni VTI dell'arteria polmonare misurati solo prossimale alla valvola polmonare.
      3. Misurare dell'arteria polmonare tempo di accelerazione tracciando la curva VTI dall'inizio del flusso di sangue al picco di velocità.
   3. Modalità M
      1. Tre misurazioni del diametro interno del ventricolo sinistro diastole (LVIDd)
      2. Tre misure del diametro interno del ventricolo sinistro in sistole (LVIDs)
      3. Tre misure del diritto diametro interno del ventricolo (RVID). Il lume RV saranno visibili solo in questa vista, se è dilatato.
      4. Misurare la frequenza cardiaca tre volte utilizzando m-mode tracciando la distanza tra due picchi diastolica della parete anteriore del ventricolo sinistro durante tre cicli cardiaci differenti.
3. Modalità B misure:
   1. Manipolare l'asse Y cranialmente dalla vista muscolo papillare, finché la valvola semilunare dell'aorta viene messa a fuoco.
   2. Ottenere misurazioni dell'aorta appena sopra la valvola a maggior diametro.
   3. Fare clic sullo strumento di misura nell'angolo in alto a sinistra dello schermo, e selezionare l'icona che appare come una linea diagonale.
   4. Sinistro fare clic con il mouse e disegnare una linea retta dal anteriori alla parete posteriore dell'aorta.
   5. Manipolare tche X e Y assi fino alla principale arteria polmonare si biforca. Tale struttura sarà visto anteriormente, ed a destra dell'aorta sul monitor.
   6. Manipolare il cranialmente asse y fino al anello della principale arteria polmonare entra in vista. Non sarà come chiaramente definito come l'aorta.
   7. "Freeze" l'immagine e avere la misura in sistole.
   8. Raccogliere tre misurazioni in totale.
4. Onda pulsata (PW) misurazioni Doppler: Modalità PW viene utilizzato principalmente per la valutazione emodinamica del flusso sanguigno attraverso le arterie e le vene. In questo protocollo, verrà utilizzato per recuperare tre misurazioni integrali temporali velocità della aorta e l'arteria polmonare.
   1. Portare l'aorta di nuovo in vista, come descritto al punto 4.3.1, e punto punto 1.
      1. Selezionare "Modalità PW". Questo si trova nell'angolo superiore destro della console di sistema e si ottiene una lettura Doppler del flusso di sangue attraverso l'aorta.
      2. Posizionare la saVolume mple appena sopra il livello della valvola aortica. X e Y assi potrebbe essere necessario modificare leggermente per ottenere buste Doppler sufficienti. Le buste devono avere bordi bianchi, e una cavità interna che indica laminare il flusso di sangue.
      3. Una volta ottenuta una visione sufficiente, "congelare" l'immagine e tracciare il confine della busta Doppler. Questo calcolerà il VTI.
      4. Ruotare la manopola "Angle" che si trova sulla console del sistema in senso orario fino a quando la linea gialla segmentata si vede nell'immagine in alto a destra del monitor è a 0 °. Questa linea gialla rappresenta la direzione del flusso di sangue attraverso il vaso. Poiché il trasduttore stesso è angolato in modo tale da produrre una vista in sezione trasversale o del cuore, la linea deve essere regolato a 0 °, per allinearsi con il flusso verticale del sangue attraverso l'aorta ascendente.
   2. Posizionare il prossimale volume del campione al livello della valvola polmonare nel centro delefflusso del ventricolo destro tratto e ripetere le misurazioni VTI come sopra. Il flusso di sangue dovrebbe apparire invertita, o di fronte al flusso di sangue in relazione alla aorta sul monitor.
5. Misurazioni modalità M: immagini M-mode fornisce alta risoluzione temporale del moto tessuto lungo un singolo fascio di ultrasuoni, e viene utilizzato per quantificare dimensioni della cavità, nonché di studiare valvolare, infarto, e il movimento della parete del vaso.
   1. Riprendere "Modalità B" e riposizionare il trasduttore avere la "vista di riferimento" (vista in sezione trasversale del ventricolo sinistro a livello dei muscoli papillari).
   2. Premere il tasto "M-mode". Ciò produrrà un feed video continuo in cui il movimento delle seguenti strutture anatomiche sarà visibile come un "nastro". Se dilatato, il lume RV appariranno nella parte superiore del feed come un sottile nastro nero. Il setto interventricolare (IVS) sarà visibile come un nastro opaco direttamente sotto il camperlumen. Il lume LV saranno visibili direttamente sotto le IVS. È il grande spazio nero che occupa la maggior parte del mangime. Sotto il lume LV è la parete posteriore LV (LVPW) che sarà visto come un nastro opaco.
   3. Congelare l'immagine e tirare indietro attraverso il ciclo di video, se necessario, ad un punto in cui la respirazione non si sta verificando. Quando le respira topo, l'acquisizione delle immagini sia interrotta da movimento del diaframma e torace, producendo così un distorto artefatto "spalmato" nel mangime che si verifica con frequenza regolare.
   4. Ottenere le seguenti misure tramite l'icona linea diagonale:
      1. Tre misure di LV finiscono dimensione diastolica, che appare come la più grande distanza tra l'IVS e LVPW.
      2. Tre misure di LV dimensione sistolica fine, che appare come la distanza più breve tra l'IVS e LVPW.
      3. Tre misure di frequenza cardiaca, che è fatto facendo clic sull'icona cuore e la misurazione di picco sistolico apicco sistolico della LVPW.
      4. Se il lume RV è dilatato, avere tre misurazioni utilizzando l'icona linea diagonale.
   5. Registrare un video a ciclo continuo del corto parasternale asse di visualizzazione in modalità "B" premendo il tasto "Cine Store".
   6. Vai su "File", selezionare "Sfoglia Study" per ricapitolare le vostre misure, fare clic su "Fine sessione", e poi "Commit dati di sessione."
   7. Recuperare il mouse come indicato dal protocollo IACUC, e ripulire.
   8. Esportare dati in un file CSV per un thumb drive per la successiva analisi.
6. Calcolare i seguenti parametri di funzionalità cardiaca (Tabella 1):
   1. Ventricolo sinistro dell'area tratto di efflusso
   2. Ventricolo sinistro gittata sistolica
   3. Ventricolo sinistro gittata cardiaca
   4. Accorciamento frazionale
   5. Area arteria polmonare
   6. Arteria polmonare tempo di accelerazione
   7. Diritto volume di eiezione del ventricolo
   8. Indice cardiaco

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

I principali obiettivi di questo protocollo sono di quantificare le dimensioni e la funzione RV, e per capire in che misura il sistema vascolare polmonare è malato. Adeguata preparazione delle apparecchiature sia il mouse e ecocardiografia è essenziale per ottenere risultati accurati e riproducibili. I topi avrebbero dovuto depilare il petto e agli arti fissato alla piattaforma di imaging con nastro adesivo. Anestesia, in questo caso isoflurano, viene somministrata con cono di naso. Il trasduttore deve essere controll...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Modelli murini della malattia, sia transgenica o tossine legate, richiedono la convalida fenotipica che il modello effettivamente ricapitola la malattia umana è destinato a emulare. Tale convalida può avere con la presenza o assenza di una particolare funzione, per esempio lo sviluppo di un tumore. Tuttavia, i modelli che si traducono in alterazioni emodinamiche come i modelli di costrizione aortica di ipertrofia ventricolare sinistra o il nostro modello transgenico della PAH sono più difficili da confermare. Questi ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 770 High Resolution Micro-Ultrasound System	Visualsonics Inc.		get more info at www.visualsonics.com/products
RMV (Real-Time MicroVisualization) 704B 40 mH Scanhead w/ Encapsulated Transducer	Visualsonics Inc.		get more info at www.visualsonics.com/products
Vevo Integrated Rail System including the Physioogical Monitoring System	Visualsonics Inc.		get more info at www.visualsonics.com/products
Computer Monitor set up for use with the Vevo770	DELL or other General Supplier
Computer Mouse set up for use with the Vevo770	General Supplier
Vevo770 Cardiac Package Software	Visualsonics Inc.		get more info at www.visualsonics.com/products
VetEquip Portable Tabletop Anesthesia Machine with an Isoflurane Vaporizer	VetEquip		get more info at vetequip.com
Activated Charcoal Waste Gas Containers	VetEquip/Vaporguard	931401	get more info at vetequip.com
Puralube Eye Ointment	Henry Schein		get more info at henryschein.com
Ecogel 100 Ultrasound Gel	EcoMed Pharmaceuticals	30GB	get more info at ecomed.com
3M Transpore Tape	Fisher Scientific	1527-0	get more info at fishersci.com
Small Flathead Screwdriver	General Supplier
Sterile H2O	DDI H2O from faucet and then autoclave
6 in Cotton Tipped Applicators	Fisher Scientific		get more info at fishersci.com
Nair (depilatory cream)	General Supplier
2 in x 2 in Gauze Sponges	Fisher Scientific		get more info at fishersci.com