Avaliação ecocardiográfica do coração direito em Ratos

Resumo

Este artigo fornece um protocolo para a avaliação ecocardiográfica do tamanho do ventrículo direito e hipertensão pulmonar em camundongos. As aplicações incluem a determinação do fenótipo e avaliação de série em modelos de ratos transgênicos e induzida por toxinas de miocardiopatia e doença vascular pulmonar.

Resumo

Transgênicos e modelos tóxicos de hipertensão arterial pulmonar (HAP) são amplamente utilizados para estudar a fisiopatologia da HAP e investigar terapias potenciais. Dado o custo eo tempo envolvidos na criação de modelos animais da doença, é fundamental que os pesquisadores têm ferramentas para avaliar com precisão a expressão fenotípica da doença. A disfunção ventricular direita é a principal manifestação da hipertensão pulmonar. O ecocardiograma é o esteio da avaliação não invasiva da função do ventrículo direito em modelos de roedores e tem a vantagem de tradução clara para os seres humanos, nos quais a mesma ferramenta é utilizada. Protocolos ecocardiografia Publicado em modelos murinos de HAP estão faltando.

Neste artigo, nós descrevemos um protocolo para avaliar RV e função vascular pulmonar em um modelo do rato de HAP com uma mutação BMPRII dominante negativo, no entanto, este protocolo é aplicável a todas as doenças que afetam a vasculatura pulmonar ou cardíaca direita. Nósfornecer uma descrição detalhada de preparação animal, aquisição de imagem e cálculo hemodinâmico do volume sistólico, débito cardíaco e uma estimativa da pressão da artéria pulmonar.

Introdução

Pressão pulmonar elevada e ventrículo direito (VD) disfunção são as marcas da doença vascular pulmonar em modelos animais e pacientes humanos com hipertensão arterial pulmonar (HAP). Transgênicos e modelos tóxicos (por exemplo, monocrotalina ou hipoxia) da HAP são amplamente utilizados para estudar a fisiopatologia da HAP e investigar terapias potenciais. Dado o custo eo tempo envolvidos na criação de modelos animais da doença, é fundamental que os pesquisadores têm ferramentas para avaliar com precisão a expressão fenotípica da doença.

O ecocardiograma é o esteio da avaliação não invasiva da função ventricular em modelos de roedores ^1,2. O ecocardiograma apresenta a vantagem de tradução claro para os seres humanos, em que a mesma ferramenta é usada. Além disso, alguns modelos genéticos exibem penetração incompleta ^3, a capacidade de identificar de forma não invasiva animais afectados poupa tempo e recursos valiosos. Avaliação não invasiva de diseagravidade se sem sacrificar um animal também permite aos pesquisadores estudar em série os efeitos das terapias de investigação. Isto é especialmente importante dada a rapidez com que as terapias de translação pode progredir para testes em humanos ^4,5.

Em humanos, a avaliação ecocardiográfica de tamanho RV e hipertensão pulmonar é particularmente difícil devido à posição retroesternal e forma irregular da RV ^6. Modelos de roedores têm os desafios adicionais de tamanho pequeno e os batimentos cardíacos extremamente rápida (300-700 batimentos / min). Os avanços recentes, incluindo taxas de quadros mais altas e transdutores pequenos têm melhorado a qualidade de imagem e de imagem consciente, mesmo permitido em alguns protocolos experimentais, embora a maioria de imagens de roedores é feito sob anestesia ^7,8. Protocolos experimentais Excelentes da ecocardiografia em modelos de ratos de HAP foram descritos e validados contra ambos ressonância magnética e hemodinâmica invasiva ^1,9. No entanto, a ecocardiografia publicadoprotocolos em modelos murinos de HAP estão faltando.

Neste artigo, nós descrevemos um protocolo para avaliar RV e função vascular pulmonar em um modelo do rato de HAP com uma mutação BMPRII dominante negativo e um modelo de pós-carga isolado RV após bandagem pulmonar, no entanto, este protocolo é aplicável a todas as doenças que afetam o vasculatura pulmonar ou cardíaca direita. Vamos descrever a preparação dos animais e avaliação detalhada de tamanho RV e função, bem como da artéria pulmonar principal (PA) tamanho. Nós também demonstrar as técnicas e cálculos necessários para estimar o volume sistólico e débito cardíaco. Limitações técnicas impedem estimativas Doppler precisos de pressão pulmonar, mas temos aplicado um substituto bem-validada, artéria pulmonar tempo de aceleração, para estimar a pressão PA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Preparação Equipamento

1. Examine o transdutor de ultra-som para os defeitos. Dependendo do equipamento usado, este passo pode ser desnecessário.
   1. Se uma bolha de ar for observado, retirar o parafuso localizado no lado direito da cabeça do transdutor, e adicionar água esterilizada através do furo com uma agulha G 26. As bolhas de ar no interior da cabeça do transdutor são comuns. Eles vão impedir a aquisição de imagens de qualidade.
   2. Verifique a membrana que cobre a sonda se há vazamentos ou furos. Substitua, se necessário.
2. Abra o software e inicializar a sonda.
   1. Escolha o pacote cardíaca a partir do menu drop-down, junto com o transdutor apropriado. Clique em "inicializar". Use uma sonda 20-60 MHz para os ratos com menos de 35 g, e uma sonda de 15-45 MHz para os ratos superiores a 35 g.
   2. Selecione o operador, animal e data na tela de dados demográficos e selecione "start".

2. Rato Preparatíon Incluindo Anestesia, Depilação, e Posicionamento

1. Anestesia: local com o mouse em uma câmara de indução e anestesiar com uma, table top aparelho de anestesia portátil que contém um vaporizador isoflurano e um recipiente de gás residual.
   1. Definir o vaporizador de 3% com uma taxa de fluxo de oxigénio de 3 L / min. Esta taxa relativamente elevada de anestesia é utilizado para conseguir o efeito anestésico rápida e, portanto, minimizar a resposta de stress que possam influenciar a função cardíaca. A curta duração do protocolo minimiza qualquer potencial risco para o animal. É muito importante para manter sempre a taxa de anestesia da mesma. Este protocolo foi otimizado para uso exclusivo de isoflurano como anestésico, portanto, as condições ideais para outros agentes podem variar de este protocolo. A profundidade mais baixa de anestesia pode ser escolhido, consoante as necessidades experimentais, mas uma vez que um protocolo de anestésico é estabelecida, ela não deve ser mudada. Anestesia afeta a freqüência cardíaca e outrr medidas hemodinâmicas. Portanto, se a profundidade da anestesia é alterada durante uma experiência, os dados não podem ser úteis para as análises. Se vários ratos são para ser trabalhada em um dia, anestesiam-los separadamente.
   2. Monitorar a temperatura ambiente para garantir que ele é o mesmo entre os grupos experimentais. A temperatura ambiente pode afetar vasoreatividade, mesmo quando o mouse está sobre uma mesa aquecida, por isso deve ser monitorado e mantido o mesmo entre os grupos experimentais que serão comparados. Embora este protocolo não medir a temperatura do animal directamente, a temperatura ambiente e a tabela constante assegura que existe pouca variação de temperatura entre os grupos experimentais.
2. Depilação: Remover os pêlos do peito com um creme depilatório após o mouse é anestesiado. Comece a aplicação com um aplicador com ponta de algodão, nas clavículas, e continuar até um pouco abaixo do diafragma.
   1. Posicione o mouse de volta na câmara de anestesia para 1 minpara permitir que o depilatório para trabalhar. Para determinar se a anestesia é eficaz, pressione firmemente o seu polegar contra uma das patas do rato. Se não houver nenhuma retirar, a anestesia é adequada. Se o membro se retira, coloque o mouse de volta na câmara de anestesia por mais um minuto.
   2. Aplicar uma pequena quantidade de lubrificante unguento para os olhos do rato para evitar danos na córnea.
   3. Remover os pêlos do peito com um 2 em x 2 em gaze. O produto químico usado no creme depilatório é cáustico e irá prejudicar a pele se for deixado por muito tempo, por isso deve ser tomado cuidado para remover todo o produto da pele.
   4. Aplique um hidratante da pele após a depilação.
3. Posicionamento: Posicione o mouse em uma posição ventrodorsal sobre uma mesa aquecida definido para 37 ° C. O posicionamento correto é imprescindível para a aquisição de imagens de qualidade. Use uma tabela que pode capturar a temperatura corporal, respiração e freqüência cardíaca. Utilização de um sistema ferroviário integrado todosows para um posicionamento preciso e, posteriormente, a otimização da imagem.
   1. Gentilmente fita para baixo todas as quatro patas e aplicar uma quantidade tamanho centavo de gel transdução no peito.

3. Aquisição de Imagens: Imagem em paraesternal eixo longo Ver

1. Bloquear o transdutor de ultra-som no lugar dentro da montagem do sistema ferroviário, e gire-o 10 ° anti-horário, de modo que a sonda de metal do transdutor é colocado diretamente sobre o coração. Mais especificamente, a sonda deve estar no lado esquerdo do peito, no segundo ou terceiro espaço intercostal, e lateralmente ao esterno.
   1. Manipular os e-x eixos y localizados no sistema ferroviário, até a visão correta é obtido.
   2. Selecione "B Mode". Isto é encontrado na parte superior direita do console do sistema, a fim de projetar uma imagem ao vivo 2D.
   3. Ver as seguintes estruturas anatômicas no monitor:
      1. Todo o coração do ápice para aorta - O ápice será visualizado no canto esquerdo da tela, ea aorta na extrema direita.
      2. O lúmen do ventrículo esquerdo (LV)
      3. Parede posterior do ventrículo esquerdo (DLS)
      4. Septo interventricular (SIV)
      5. O lúmen do ventrículo direito (VD)
      6. Anterior e posterior folhetos da válvula mitral (AML & PML)
      7. Crescente aorta (AO)
      8. Átrio esquerdo (AE)
2. Obter uma medição de diâmetros de aorta nesta exibição, pressionando o botão de digitalização / congelamento para "congelar" a imagem. Em seguida, use o mouse para puxar para trás através do loop de vídeo na parte inferior da imagem até o ventrículo esquerdo é a sístole ea aorta está no seu maior diâmetro.
   1. Clique na ferramenta de medição no canto superior esquerdo da tela e selecione o ícone que se parece com uma linha diagonal. À esquerda, clique com o mouse e desenhar uma linha reta a partir da anterior para a parede posterior da aorta, perpendicular ao longo do seu eixo. Salve, premindo o botão "Quadro Store".
   2. Criar um loop de vídeo com a tecla "Cine Store"

. 4 Aquisição de Imagens: Imagem em paraesternal eixo curto Ver

1. Reposicionar o transdutor de 3 e 9 horas posições (transversais). Angle ligeiramente caudal através da manipulação do transdutor para conseguir a melhor vista da aorta e lúmen do VE. A sonda de metal será posicionado na horizontal e diretamente sobre o esterno.
   1. Manipular os x e y-eixos no sistema ferroviário, até a visão correta é obtido. O lúmen LV será visto, junto com os músculos papilares ântero-lateral e póstero, que são visíveis do lado direito do monitor. Este é o ponto de referência padrão para o eixo menor, indicando a porção média do ventrículo esquerdo, Onde as medições são feitas dimensão. Desviando um pouco do ponto de referência com os X e Y-eixos para trazer estruturas anatômicas diferentes, tendo em vista, será necessário, mas o posicionamento é explicado fazendo referência o ponto de vista acima.
2. Obtenha as seguintes medidas no eixo curto:
   1. Modo B
      1. Duas medidas mais diametrais da aorta.
      2. Três medidas da via de saída pulmonar.
   2. Modo Doppler de onda pulsátil (DP)
      1. Três medições de velocidade integrais de tempo (VTI) da aorta
      2. Três medidas VTI da artéria pulmonar medido apenas proximal à válvula pulmonar.
      3. Medir o tempo de aceleração da artéria pulmonar, traçando a curva VTI desde o início do fluxo de sangue para o pico de velocidade.
   3. Modo M
      1. Três medidas do diâmetro interno do ventrículo esquerdo em diastole (LVIDd)
      2. Três medidas do diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole (LVIDs)
      3. Três medidas do diâmetro interno do ventrículo direito (RVID). O lúmen RV só será visível nesta imagem se for dilatada.
      4. Medir a frequência cardíaca três vezes usando m-mode, traçando a distância entre dois picos diastólica da parede anterior do VE durante três ciclos cardíacos diferentes.
3. B medições modo:
   1. Manipular o eixo Y cranial do ponto de vista músculo papilar, até que a válvula semilunar da aorta entra em foco.
   2. Obter medições da aorta imediatamente acima da válvula em função do maior diâmetro.
   3. Clique na ferramenta de medição no canto superior esquerdo da tela, e selecione o ícone que se parece com uma linha diagonal.
   4. À esquerda, clique com o mouse e desenhar uma linha reta a partir da anterior para a parede posterior da aorta.
   5. Manipular tele x-e y-eixos até a artéria pulmonar principal bifurca. Esta estrutura será visto anteriormente, e para a direita da aorta no monitor.
   6. Manipular o cranial eixo y até o anel da artéria pulmonar principal aparece. Ele não será mais claramente definida como a aorta.
   7. "Congelar" a imagem e obter a medição em sístole.
   8. Coletar três medições no total.
4. Onda pulsátil (DP) medições Doppler: Modo PW é usado principalmente para a avaliação hemodinâmica do fluxo de sangue através das artérias e veias. Neste protocolo, ele será usado para recuperar tempo três velocidade medições integrantes da aorta e da artéria pulmonar.
   1. Traga de volta para a aorta vista como descrito na etapa 4.3.1, e ponto 1.
      1. Selecione "Modo PW". Ele está localizado no canto superior direito do console do sistema e irá produzir uma leitura Doppler do fluxo de sangue através da aorta.
      2. Coloque o savolume de mple pouco acima do nível da válvula aórtica. Poderá ter de ser ajustada ligeiramente para obter envelopes Doppler suficientes As x-e y-eixos. Os envelopes devem ter bordas brancas, e um interior que indica o fluxo sanguíneo laminar oco.
      3. Uma vez que uma visão suficiente é obtida, "congelar" a imagem e traçar a fronteira do envelope Doppler. Isto irá calcular o VTI.
      4. Gire o botão "Angle" localizado no console do sistema no sentido horário até que a linha amarela segmentada visto na imagem no lado direito superior do monitor esteja a 0 °. Esta linha amarela representa o sentido do fluxo de sangue através do vaso. Uma vez que o próprio transdutor tem um ângulo de tal modo a produzir uma vista em corte transversal ou transversal do coração, a linha tem de ser ajustada para 0 °, para se alinharem com o fluxo vertical do sangue através da aorta ascendente.
   2. Colocar o volume de amostra proximal ao nível da válvula pulmonar, no centro dasaída do ventrículo direito e repetir as medições VTI como acima. O fluxo de sangue deve aparecem invertidas, ou em frente do fluxo de sangue em relação à aorta no monitor.
5. Medições em modo M: Modo M proporciona imagiologia de alta resolução temporal do movimento do tecido ao longo de um único feixe de ultra-sons, e é utilizado para quantificar as dimensões da cavidade, como também para estudar valvular, miocárdio e de um recipiente de parede de circulação.
   1. Retomar "Modo B" e reposicionar o transdutor para obter o "vista de referência" (a vista em corte transversal do ventrículo esquerdo ao nível dos músculos papilares).
   2. Pressione "M-mode". Isto produzirá um sinal de vídeo contínuo, no qual o movimento das seguintes estruturas anatómicas será visível como uma "fita". Se dilatados, o lúmen RV aparecerá no topo do feed como uma fita preta muito fina. O septo interventricular (SIV) será visível como uma fita opaca diretamente abaixo da RVlúmen. O lúmen LV será visto logo abaixo os IVS. É o grande espaço negro que ocupa a maior parte da alimentação. Abaixo o lúmen LV é a parede posterior do VE (PPVE), que será visto como uma fita opaca.
   3. Congelar a imagem e puxar para trás através do circuito de vídeo se necessário, para um ponto onde a respiração não está a ocorrer. Quando o rato respira, a aquisição da imagem é interrompida pelo movimento da parede do diafragma e no peito, produzindo, assim, um artefato "manchada" distorcida na alimentação que ocorre com freqüência regular.
   4. Obter os seguintes medições usando o ícone da linha diagonal:
      1. Três medidas de LV acabar dimensão diastólica, que aparece como a maior distância entre o IVS e PPVE.
      2. Três medidas da dimensão sistólica final do VE, que aparece como a menor distância entre o IVS e PPVE.
      3. Três medidas de freqüência cardíaca, o que é feito clicando no ícone de coração e medição de pico sistólicapico sistólico da PPVE.
      4. Se a luz de RV está dilatado, obter três medidas usando o ícone da linha diagonal.
   5. Gravar um loop de vídeo da visão paraesternal eixo curto em "modo B", pressionando o botão "Cine Store".
   6. Vá em "Arquivo", selecione "Browse" Estudo para recapitular suas medidas, clique em "Terminar sessão", e depois "Commit dados da sessão."
   7. Recuperar o mouse, conforme descrito pelo protocolo IACUC, e limpar.
   8. Exportar dados como um arquivo CSV para um pen drive para posterior análise.
6. Calcular os seguintes parâmetros da função cardíaca (Tabela 1):
   1. Área de saída do ventrículo esquerdo
   2. Volume de ejeção do ventrículo esquerdo
   3. Débito cardíaco do ventrículo esquerdo
   4. Fração de encurtamento
   5. Área da artéria pulmonar
   6. Da artéria pulmonar tempo de aceleração
   7. Volume de ejeção do ventrículo direito
   8. O índice cardíaco

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Os principais objectivos deste protocolo são para quantificar o tamanho e função do VD, e para compreender o grau em que a vasculatura pulmonar é doente. Preparação adequada, tanto do rato e ecocardiograma equipamento é essencial para a obtenção de resultados precisos e reprodutíveis. Ratos deveria ter seu peito depilado e membros fixado à plataforma de imagem com fita adesiva. Anestesia, neste caso de isoflurano, é administrado através do nariz do cone. O transdutor deve ser verificado para os defeitos, pa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Modelos de rato de doença, ou transgénico ou relacionados com a toxina, requerem validação fenotípica que o modelo realmente recapitula a doença humana, pretende-se imitar. Esta validação pode muitas vezes ser realizada por a presença ou ausência de uma característica particular, por exemplo, o desenvolvimento de um tumor. No entanto, modelos que levam a alterações hemodinâmicas, como os modelos de constrição da aorta de hipertrofia ventricular esquerda ou nosso modelo transgênico da HAP são mais difí...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 770 High Resolution Micro-Ultrasound System	Visualsonics Inc.		get more info at www.visualsonics.com/products
RMV (Real-Time MicroVisualization) 704B 40 mH Scanhead w/ Encapsulated Transducer	Visualsonics Inc.		get more info at www.visualsonics.com/products
Vevo Integrated Rail System including the Physioogical Monitoring System	Visualsonics Inc.		get more info at www.visualsonics.com/products
Computer Monitor set up for use with the Vevo770	DELL or other General Supplier
Computer Mouse set up for use with the Vevo770	General Supplier
Vevo770 Cardiac Package Software	Visualsonics Inc.		get more info at www.visualsonics.com/products
VetEquip Portable Tabletop Anesthesia Machine with an Isoflurane Vaporizer	VetEquip		get more info at vetequip.com
Activated Charcoal Waste Gas Containers	VetEquip/Vaporguard	931401	get more info at vetequip.com
Puralube Eye Ointment	Henry Schein		get more info at henryschein.com
Ecogel 100 Ultrasound Gel	EcoMed Pharmaceuticals	30GB	get more info at ecomed.com
3M Transpore Tape	Fisher Scientific	1527-0	get more info at fishersci.com
Small Flathead Screwdriver	General Supplier
Sterile H2O	DDI H2O from faucet and then autoclave
6 in Cotton Tipped Applicators	Fisher Scientific		get more info at fishersci.com
Nair (depilatory cream)	General Supplier
2 in x 2 in Gauze Sponges	Fisher Scientific		get more info at fishersci.com