Guiada por imagen de ultrasonido de inyección intracardiaca de desarrollar un modelo de ratón de cáncer de mama metástasis cerebrales Seguido por Longitudinal MRI

Resumen

Un cáncer de cerebro modelo murino de metástasis de mama se establece con ultrasonido intracardiaco inyección guiada por imágenes de células MDA-MB231/Br-GFP. Desarrollo de las metástasis intracraneales multifocales ha sido supervisado longitudinalmente utilizando alta resolución 9.4 T MRI.

Resumen

Metástasis cerebrales del cáncer de mama, que se producen en el 30% de los pacientes con cáncer de mama en estadio IV, se asocia con una elevada mortalidad. La mediana de supervivencia es de sólo 6 meses. Es fundamental contar con modelos animales adecuados para imitar la propagación hemodinámico de las células metastásicas en el escenario clínico. Aquí, estamos introduciendo el uso de la ecografía de pequeños animales para guiar una inyección precisa de las células de cáncer de mama tropical cerebrales en el ventrículo izquierdo de los ratones atímicos. RM longitudinal se utiliza para evaluar la iniciación intracraneal y el crecimiento de las metástasis cerebrales. Inyección intracardiaca guiada por ultrasonido garantiza no sólo una inyección precisa y por la presente una mayor tasa de éxito, pero también disminuyó significativamente la tasa de mortalidad, en comparación con nuestro procedimiento manual anterior. In vivo de alta resolución MRI permite la visualización de lesiones multifocales hiperintensas, tan pequeñas como 310 micras de diámetro en T ₂ imágenes con ponderación a las 3 semanas después de la inyección. Follow de la RM revela el crecimiento del tumor intracraneal y aumento del número de metástasis que distribuyen a lo largo de todo el cerebro.

Introducción

Metástasis cerebral es la neoplasia maligna intracraneal más común en los adultos. El pronóstico es muy malo, con una supervivencia media de 4-6 meses, incluso con tratamiento agresivo. El cáncer de mama es una de las tres principales cánceres primarios con una elevada morbilidad de metástasis cerebral ^1-3. Varias líneas de cáncer de mama cerebro-trópicos son capaces de desarrollar metástasis cerebrales después intracardiaca o inyección intracarotídea ^4. La inyección directa de las células tumorales en el ventrículo izquierdo puede pasar por alto el lecho capilar pulmonar y por lo tanto aumentar la incidencia de la formación de metástasis cerebrales y reducir al mínimo las metástasis viscerales. La línea MDA-MB231Br es una de las líneas humanas de cáncer de mama más utilizados para el desarrollo de metástasis cerebral en modelos de roedores ^5,6.

Al igual que muchos otros estudios ^4,7, hemos llevado a cabo un procedimiento manual de la inyección intracardiaca en nuestros estudios anteriores. Sin embargo, la tasa de éxito sólo 50% se obtuvo con el manual deinyección y una fracción de los ratones murieron a causa de los procedimientos invasivos repetidos si los ensayos anteriores fracasaron. Aquí, estamos introduciendo el uso de un procedimiento de imagen guiada para asegurar la inyección de células de cáncer de mama en busca del cerebro hacia el ventrículo izquierdo de los ratones atímicos. Longitudinal alta resolución MRI se aplica a seguir el desarrollo de las metástasis cerebrales intracraneales.

Protocolo

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center Institucional Cuidado de Animales y el uso.

1. Preparación de las células MDA-MB231/Br-GFP

1. Recuperar y cultivar las células MDA-MB231/Br-GFP (amablemente proporcionados por los Dres. Palmieri y Steeg, NCI) en medio DMEM que contiene 10% de SFB, 1% de glutamina y 1% de penicilina / estreptomicina.
2. Observar la condición de las células y de color del medio, y reemplazar el medio cada 2-3 días.
3. Tripsinizar y recoger las células cuando se alcanza el 80% de confluencia como se indica en los pasos 1.3.1-1.3.5:
   1. Retire el medio viejo por completo y añadir 5 ml de PBS (1x) para lavar las células suavemente. Retire el PBS del plato.
   2. Añadir 1,5 ml de tripsina en el plato; inclinar el plato suavemente para asegurar que todas las células están cubiertas por la tripsina. Coloque el plato de nuevo a la incubadora de células y la mantendrá a 37 ° C durante 1 min.
   3. Sacar la fuente de la incubadora y observarlas células bajo microscopio óptico para asegurar las células desprenden de la placa.
   4. Añadir 3 ml de medio para detener el efecto de la tripsina. Recoger la mezcla de células en un tubo de centrífuga. Centrifugar la mezcla a 2000 rpm durante 5 min.
   5. Retire el medio con cuidado y volver a suspender las células en 5 ml de medio libre de suero hasta que sea homogénea.
4. Contar el número apropiado de células y resuspender en medio DMEM libre de suero con una concentración final de 1,75 x 10 ⁵ células en 100 l de volumen.
   1. Tomar 50 l mezcla de células y añadir 50 l de azul de tripano. Después de mezclar, se toma 10 l mezcla y con cuidado añadir a la diapositiva recuento celular. Utilice varias muestras para asegurar el número de células estimación precisa.
   2. Pegue en la diapositiva recuento celular, uno de los extremos a la vez y el contador de células empieza a contar automáticamente. Tome promedio de todos los resultados del recuento y calcular el número total de células.
   3. Centrifugar las células de nuevo y resuspender enel volumen apropiado de medio libre de suero para dar lugar a la concentración final de 1,75 x 10 ⁵ células/100 l de volumen.
5. Coloque las células en hielo antes de la inyección intracardiaca.

2. Guiada por imagen de ultrasonido de inyección intracardiaca

1. Utilice ratones desnudos hembra (BALB / c nu / nu) entre 6-8 semanas de edad.
2. Entrar en el sistema de imágenes. Inicialice el transductor 704 (40 MHz).
3. Iniciar un nuevo estudio y complete la información.
4. Anestesie (3% isoflurane/100% O ₂ en una cámara de inducción) y mantener los animales con isoflurano (2%) en el 100% de O ₂ (1 dm ³ / min) durante todo el procedimiento a través de un cono de la nariz. La anestesia se confirma cuando se observa ningún reflejo de retirada con pizca dedo del pie.
5. Ajuste la temperatura de la tabla de imagen a 37 ° C. Pegue el ratón anestesiado en la mesa de formación de imágenes se calienta en posición supina.
6. Mantener el gel de ultrasonido a 37 ° C antes de imenvejecimiento. Aplique el gel en el pecho del ratón.
7. Monte el transductor en el soporte. Baje el transductor hasta que se alcanza la profundidad de imagen deseada. Mueva la etapa hasta el ventrículo izquierdo se identifica con la aorta ascendente como punto de referencia (Figura 1 A). Bloquee la etapa en la que se visualiza una vista clara del ventrículo izquierdo.
8. Dibujar 100 l de mezcla de células en una jeringuilla de 1 ml con una aguja de calibre 22. Colocar y fijar la jeringa en el montaje de jeringa.
9. Mueva la jeringa hacia adelante hacia el pecho del ratón y mover con cuidado de lado a lado hasta que la punta de la aguja está en el campo de la imagen de la vista (antes de entrar en el ratón).
10. Ajuste la altura de la aguja y el ángulo para apuntar hacia abajo el ventrículo izquierdo.
11. Penetrar la aguja de la jeringa en el espacio intercostal con prontitud a través de capas de piel y músculo en el ventrículo izquierdo, bajo la guía de la ecografía.
    Una indicación de la inserción con éxito de la aguja en el ventrículo izquierdoCLE es el reflujo de la sangre arterial fresca (de color rosa en contraste con la sangre venosa de color rojo oscuro) en la jeringa
12. Inyectar la mezcla de células lentamente (Figura 1B).
13. Al terminar, retire la aguja, levante el transductor, limpiar el gel de ultrasonido con una gasa humedecida y retire la cinta.
14. Prepare una jaula limpia con una almohadilla precalentado.
15. Colocar el animal en el teclado y observe al animal hasta la recuperación completa.
16. Monitorear el comportamiento del animal cada 24 horas durante dos días.
17. Condiciones generales y signos neurológicos de complicaciones en ratones experimentales se monitorean rutinariamente.

3. MRI Seguimiento del desarrollo del tumor intracraneal

1. Utilice un Tesla imán 9.4 para supervisar el desarrollo de las metástasis cerebrales intracraneales.
2. Iniciar MRI dos semanas después de la implantación del tumor y repetir una vez por semana durante un máximo de tres semanas.
3. Sedar a los animales con un 3% isoflurano y mantenerlos bajo genanestesia ral (1,5% de isoflurano).
4. Controlar y mantener la temperatura corporal del animal y la respiración constante durante todo el experimento.
5. Alta resolución multicorte (14 cortes con 1 mm de espesor, sin espacio) T ₁ - y en _T2 imágenes coronales, que abarca la región del lóbulo frontal en la fosa posterior, se adquieren con los siguientes parámetros: T imágenes potenciadas en _1: girar eco rebanada múltiple (SEMS), TR / TE = 400 msec/20 ms, matriz: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, de resolución del plano: 78 x 78 m ^2. T imágenes ponderadas _2: giro rápido eco de slice múltiple (FSEMS) secuencias, TR / TE = 2500 msec/48 ms, 8 trenes de eco, matriz: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, de resolución del plano: 78 x 78 micras ^28,9.
   Lesiones tumorales aparecen más brillantes que los tejidos cerebrales normales en las imágenes potenciadas _T-2.
6. El tamaño del tumor se determina en _T-2 imágenes ponderadas por esbozar manualmente el accesporción de la masa cing en cada imagen mediante el uso de programas de MATLAB escritas por nosotros ^8.
   Habida cuenta de la mayor parte del tumor diámetros son menores que el espesor de corte (1 mm), el tamaño tumoral se presenta como en la zona de avión y no el volumen.

4. H & E tinción Confirmando las metástasis

1. Sacrificar los ratones inmediatamente después de escanear el último MR, diseccionar los cerebros con tumores e incrustarlo en el medio de octubre y congelado en -80 ° C.
2. Sección de una serie de 10 micras de espesor cerebro coronal especímenes con criostato.
3. Realizar tinción H & E en las secciones del cerebro.

Resultados

Con la alta resolución espacial de la RM (78 micras de resolución del plano), lesiones hiperintensas pueden ser identificados tan pequeñas como 310 micras de diámetro (Figura 2). Dado que las metástasis en este estudio son muy pequeñas y el desarrollo de necrosis y edema es mínima, la lesión hiperintensa en las imágenes potenciadas T _2-realmente representaba la masa tumoral.

Estudios de resonancia magnética longitudinales permiten en la evaluaci...

Discusión

En el presente estudio, hemos demostrado que el ultrasonido de inyección ventricular izquierda guiada por imagen garantiza la precisión de modo que se observó cada animal en este estudio desarrollado metástasis cerebrales y no la muerte del animal. La belleza de la inyección guiada por imagen es que el camino de la penetración de la aguja de la piel y, finalmente, en el ventrículo izquierdo puede ser controlada y ajustada debajo de la imagen, que es distinto del procedimiento manual que requiere estrictos puntos ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30022.01
Trypsin	Mediatech	25-051-C1
Automatic cell counter	BioRad	TC10
Isoflurane	Baxter International Inc.	1001936060
VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System	Visual Sonics Inc.
9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system	Agilent
O.C.T Compound	Sakura Finetek USA	4583