Ultrasound Imaging guidée injection intracardiaque de développer un modèle de souris de cancer du sein métastases cérébrales Suivi par IRM longitudinale

Résumé

Un modèle murin de cancer du cerveau de métastase est établi par échographie injection intracardiaque guidée par imagerie de cellules MDA-MB231/Br-GFP. Développement des métastases intracrâniennes multifocales a été suivie longitudinalement en utilisant à haute résolution de 9,4 T IRM.

Résumé

cerveau du cancer du sein métastatique, survenant dans 30% des patients atteints de cancer du sein au stade IV, est associée à une mortalité élevée. La médiane de survie est de seulement 6 mois. Il est essentiel d'avoir des modèles animaux appropriés pour imiter la propagation de l'hémodynamique des cellules métastatiques dans le scénario clinique. Ici, nous présentons l'utilisation de l'imagerie du petit animal ultrasons pour guider une injection précise des cellules cancéreuses du sein tropicale du cerveau dans le ventricule gauche de la souris nude athymiques. IRM longitudinal est utilisée pour l'évaluation de l'initiation et de la croissance intra-crânienne de métastases cérébrales. Injection intracardiaque guidée par échographie assure non seulement une injection précise et présente un taux de réussite plus élevé, mais a également diminué de manière significative le taux de mortalité, par rapport à notre manuel de procédure précédente. In vivo IRM à haute résolution permet la visualisation des lésions multifocales hyperintenses, aussi petit que 310 um de diamètre sur T ₂ images pondéré à 3 semaines après l'injection. Follow-up IRM révèle une croissance de tumeur intracrânienne et l'augmentation du nombre de métastases qui distribuent tout au long de l'ensemble du cerveau.

Introduction

métastases du cerveau est la tumeur maligne la plus fréquente intracrânienne chez les adultes. Le pronostic est très mauvais, avec une médiane de survie de 4-6 mois, même avec un traitement agressif. Le cancer du sein est l'un des trois principaux cancers primaires avec une morbidité élevé de métastases cérébrales ^1-3. Plusieurs lignées de cancer du sein cerveau-tropique sont capables de développer des métastases cérébrales après injection intracardiaque ou intracarotidienne ^4. L'injection directe de cellules tumorales dans le ventricule gauche peut contourner le lit capillaire pulmonaire et d'augmenter ainsi l'incidence de la formation de métastases cérébrales, tout en minimisant les métastases viscérales. La ligne MDA-MB231Br est l'une des lignées de cancer du sein le plus largement utilisé droits pour développer des métastases cérébrales dans des modèles rongeurs ^5,6.

Comme de nombreuses autres études ^4,7, nous avons effectué une procédure manuelle de l'injection intra-cardiaque dans nos études précédentes. Cependant, seulement 50% de taux de succès a été obtenu avec l'emploiinjection et une fraction de souris sont mortes des procédures invasives répétées si les essais antérieurs ont échoué. Ici, nous présentons l'utilisation d'une procédure d'imagerie guidée pour garantir l'injection de cellules de cancer du sein cerveau cherchant dans le ventricule gauche de souris athymiques. Longitudinal IRM à haute résolution est appliqué à suivre le développement intracrânienne des métastases cérébrales.

Protocole

Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université du Texas Southwestern Centre médical.

Une. Préparation des cellules MDA-MB231/Br-GFP

1. Récupérer et culture des cellules MDA-MB231/Br-GFP (aimablement fournies par les Drs. Palmieri et Steeg, NCI) dans du milieu DMEM contenant 10% de FBS, 1% de glutamine et 1% de pénicilline / streptomycine.
2. Observer l'état des cellules et la couleur du support, et de le remplacer milieu tous les 2-3 jours.
3. Trypsiniser et recueillir les cellules lorsque 80% de confluence est atteinte, comme indiqué dans les étapes 1.3.1-1.3.5:
   1. Retirer l'ancien milieu complètement et ajouter 5 ml de PBS (1x) pour laver en douceur les cellules. Retirez le PBS dans le plat.
   2. Ajouter 1,5 ml de trypsine dans le plat, incliner le plat doucement pour assurer toutes les cellules sont couverts par la trypsine. Mettre le plat de nouveau à l'incubateur de cellules et le maintenir à 37 ° C pendant 1 min.
   3. Sortez le plat du incubateur et observerles cellules sous le microscope optique pour s'assurer que les cellules se détachent de l'antenne.
   4. Ajouter 3 ml de milieu pour arrêter l'effet de la trypsine. Recueillir le mélange de cellules dans un tube de centrifugation. Centrifuger le mélange à 2000 tpm pendant 5 min.
   5. Retirer soigneusement le milieu et remettre en suspension les cellules dans un milieu exempt de 5 ml de sérum jusqu'à homogénéité.
4. Compter le nombre approprié de cellules et remettre en suspension dans du milieu DMEM sans sérum avec une concentration finale de 1,75 x 10 ⁵ cellules dans un volume de 100 ul.
   1. Prenez mélange de cellules pi 50 et ajouter 50 ul bleu Trypan. Après le mélange, prendre 10 mélange de pi et soigneusement ajouter à la diapositive de comptage de cellules. Utilisez plusieurs tests afin de s'assurer précise le nombre de cellules estimation.
   2. Coller à la lame de comptage des cellules, une extrémité à la fois et le compteur de cellules commence à compter automatiquement. Prendre la moyenne de tous les résultats de comptage et calculer le nombre total de cellules.
   3. Centrifuger les cellules et remettre en suspension à nouveau dans lesle volume approprié de milieu sans sérum pour aboutir à la concentration finale de 1,75 x 10 ⁵ cellules/100 ul volume.
5. La place des cellules sur la glace avant injection intracardiaque.

2. Ultrasound Imaging guidée injection intracardiaque

1. Utilisez la souris nu féminin (BALB / c nu / nu) entre 6-8 semaines.
2. Connectez-vous au système d'imagerie. Initialiser le transducteur 704 (40 MHz).
3. Lancer une nouvelle étude et remplir les informations.
4. Anesthésier (3% isoflurane/100% O ₂ dans une chambre d'induction) et de maintenir les animaux avec de l'isoflurane (2%) à 100% _de O ₂ (1 dm ³ / min) pendant l'ensemble de la procédure par l'intermédiaire d'un cône de nez. L'anesthésie est confirmé en l'absence de réflexe de retrait est observé avec pincement de l'orteil.
5. Régler la température de la table de formation d'image à 37 ° C. Collez la souris anesthésiée à la table d'imagerie chauffée en position couchée.
6. Gardez le gel à ultrasons à 37 ° C avant l'imvieillissement. Appliquer le gel sur la poitrine de la souris.
7. Montez la sonde dans le support. Abaissez le transducteur jusqu'à la profondeur d'imagerie désirée est atteinte. Déplacez la scène jusqu'à ce que le ventricule gauche est identifié avec l'aorte ascendante comme le point de repère (figure 1A). Verrouiller le stade où une vision claire de ventricule gauche est visualisée.
8. Tracer 100 ul de mélange de cellules dans une seringue de 1 ml avec une aiguille 22 G. Placer et fixer la seringue sur le montage de seringue.
9. Déplacez la seringue vers l'avant vers la poitrine de la souris et déplacer avec précaution côté à l'autre jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille est dans le champ de vision d'imagerie (avant d'entrer dans la souris).
10. Réglez la hauteur de l'aiguille et de l'angle de viser vers le bas le ventricule gauche.
11. Pénétrer l'aiguille de la seringue dans l'espace intercostale rapidement à travers les couches de la peau et des muscles dans le ventricule gauche, sous la direction de l'imagerie par ultrasons.
    Une indication de l'insertion réussie de l'aiguille dans le ventricule gauchecle est le reflux de sang artériel frais (de couleur rose à la différence de sang veineux rouge sombre) dans la seringue,
12. Injecter le mélange de cellules lentement (figure 1B).
13. À la fin, retirer l'aiguille, soulever le transducteur, nettoyer le gel à ultrasons avec de la gaze humide et enlever le ruban.
14. Préparer une cage propre avec un tampon préchauffé.
15. Placez l'animal sur le pavé et observer l'animal jusqu'à guérison complète.
16. Surveiller le comportement de l'animal toutes les 24 heures pendant deux jours.
17. Conditions générales et les signes neurologiques de complications chez les souris expérimentales sont régulièrement contrôlés.

3. Surveillance IRM de la tumeur intracrânienne développement

1. Utilisez un aimant Tesla 9.4 pour suivre le développement intracrânienne des métastases cérébrales.
2. Initier IRM deux semaines après implantation de la tumeur et répéter une fois par semaine pendant trois semaines.
3. Endormir les animaux avec 3% d'isoflurane et de les maintenir sous gèneanesthésie ral (1,5% de l'isoflurane).
4. Surveiller et maintenir la température du corps de l'animal et de la respiration constante tout au long de l'expérience.
5. Résolution multislice élevé (14 tranches avec 1 mm d'épaisseur, pas d'écart) T ₁ - et T ₂ pondéré images coronales, couvrant la région du lobe frontal à la fosse postérieure, sont acquises avec les paramètres suivants: T images _{1-pondérés:} écho de spin tranche multiple (SEMS), TR / TE = 400 ms msec/20, matrice: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, en résolution du plan: 78 x 78 um ^2. T images _{2-pondérés:} écho de spin rapide tranche multiple (FSEMS) des séquences, TR / TE = 2500 msec/48 ms, 8 trains d'écho, matrice: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, en résolution du plan: 78 x 78 um ^28,9.
   lésions tumorales semblent plus lumineux que les tissus cérébraux normaux sur des T-images _{2-pondérés.}
6. taille de la tumeur est déterminée sur T images _2-pondérés en décrivant manuellement le enhanpartie de la masse cement sur ​​chaque image à l'aide de programmes MATLAB écrites par nous ^8.
   Compte tenu de la majeure partie de la tumeur diamètres sont plus petits que l'épaisseur des tranches (1 mm), la taille de la tumeur est présenté comme dans la zone de plan plutôt que le volume.

4. H & E coloration Confirmant les métastases

1. Sacrifier les souris immédiatement après le dernier MR scanner, disséquer les cerveaux porteurs de tumeurs et l'intégrer dans un milieu PTOM et figé dans -80 ° C.
2. Section d'une série de 10 um d'épaisseur cerveau coronale spécimens avec cryostat.
3. Effectuer coloration H & E de sections de cerveau.

Résultats

Avec la haute résolution spatiale de l'IRM (78 um dans la résolution de l'avion), les lésions hyperintenses peuvent être identifiés aussi petit que 310 m de diamètre (figure 2). Depuis les métastases dans cette étude sont très faibles et le développement de la nécrose et de l'œdème est minime, la lésion hyperintense en T ₂ images pondérées représentait vraiment la masse de la tumeur.

Des études longitudinales permettent d'IRM ...

Discussion

Dans la présente étude, nous avons démontré que l'injection ventriculaire gauche imagerie guidée ultrasons garantit la précision de sorte que tous les animaux de cette étude développé des métastases cérébrales et aucune mort de l'animal a été observé. La beauté de l'injection guidée par l'image, c'est que le chemin de la pénétration de l'aiguille de la peau et enfin dans le ventricule gauche peut être contrôlé et ajusté sous l'image, qui est distincte de la procédure m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30022.01
Trypsin	Mediatech	25-051-C1
Automatic cell counter	BioRad	TC10
Isoflurane	Baxter International Inc.	1001936060
VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System	Visual Sonics Inc.
9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system	Agilent
O.C.T Compound	Sakura Finetek USA	4583