Ecografia-guiada injeção intracardíaca para desenvolver um modelo do rato de mama metástases do cancro cerebral Seguido por Longitudinal MRI

Resumo

Um modelo do rato de mama câncer no cérebro metástase é estabelecida com ultra-som guiada por imagem injeção intracardíaca de células MDA-MB231/Br-GFP. Desenvolvimento de metástases intracranianas multifocais tem sido monitorada longitudinalmente usando alta resolução de 9.4 T MRI.

Resumo

Metástases cerebrais de câncer de mama, que ocorre em 30% dos pacientes com câncer de mama em estágio IV, está associada com alta mortalidade. A sobrevida média é de apenas 6 meses. É crítico para ter modelos animais adequados para imitar a propagação hemodinâmico das células metastáticas no cenário clínico. Aqui, estamos introduzindo o uso de ultra-sonografia pequeno animal para guiar uma injeção precisa do cérebro células de câncer de mama tropical para o ventrículo esquerdo de ratos pelados atímicos. RM longitudinal é usado para avaliar a iniciação intracraniana e crescimento de metástases cerebrais. Injeção intracardíaca de ultra-som-guiada garante não só uma injeção precisa e vem uma taxa de sucesso mais elevada, mas também diminuiu significativamente a taxa de mortalidade, em comparação com o nosso procedimento manual anterior. In vivo alta resolução de ressonância magnética permite a visualização de lesões multifocais hiperintensas, tão pequeno quanto 310 mM de diâmetro em T imagens _2-ponderadas em 3 semanas após a injecção. Follow-se a RM revela crescimento do tumor intracraniano e aumento do número de metástases que distribuem ao longo de todo o cérebro.

Introdução

Metástase cerebral é a doença maligna intracraniana mais comum em adultos. O prognóstico é extremamente pobre, com uma sobrevida média de 4-6 meses, mesmo com o tratamento agressivo. O câncer de mama é um dos três principais tipos de câncer primário com alta morbidade da metástase cerebral ^1-3. Várias linhas de câncer de mama cérebro-trópicos são capazes de desenvolver metástases cerebrais após intracardíaca ou injeção intracarotídeo ^4. Injeção direta de células tumorais para o ventrículo esquerdo pode ignorar o leito capilar pulmonar e, assim, aumentar a incidência de formação de metástases cerebrais, minimizando metástases viscerais. A linha MDA-MB231Br é uma das linhas de cancro da mama humanas mais utilizados para desenvolver metástase cerebral em modelos de roedores ^5,6.

Como muitos outros estudos ^4,7, temos realizado um procedimento manual de injeção intracardíaca em nossos estudos anteriores. No entanto, apenas 50% taxa de sucesso foi obtido com o manualinjecção e uma fracção de ratinhos morreram devido aos procedimentos invasivos repetidos se os ensaios anteriores falharam. Aqui, estamos introduzindo o uso de um procedimento guiado por imagem para garantir a injeção de células de câncer de mama em busca do cérebro para o ventrículo esquerdo do rato atímico. Longitudinal alta resolução de ressonância magnética é aplicada a acompanhar o desenvolvimento intracraniana de metástases cerebrais.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de University of Texas Southwestern Medical Center Animal Care Institucional e uso.

1. Preparação das Células MDA-MB231/Br-GFP

1. Recuperar e cultura das células MDA-MB231/Br-GFP (gentilmente cedidas pelos Drs. Palmieri e Steeg, NCI) em meio DMEM contendo 10% de FBS, 1% de glutamina e 1% de penicilina / estreptomicina.
2. Observar o estado das células e cor de meio, e substituir meio cada 2-3 dias.
3. Tripsinizar e recolher as células, quando 80% de confluência é alcançado como descrito nas etapas 1.3.1-1.3.5:
   1. Remover o meio antigo por completo e adicione 5 ml de PBS (1x) para lavar as células suavemente. Remover o PBS a partir do prato.
   2. Adicionar 1,5 ml de tripsina no prato; inclinar o prato suavemente para assegurar que todas as células são cobertas por tripsina. Coloque o prato de volta na incubadora celular e mantê-la a 37 ° C durante 1 min.
   3. Leve o prato de incubadora e observaras células em microscópio óptico para assegurar que as células separar do prato.
   4. Adicionar 3 ml de meio para parar o efeito de tripsina. Recolhe-se a mistura de células num tubo de centrífuga. Centrifugar a mistura a 2000 rpm durante 5 min.
   5. Retire cuidadosamente o meio e ressuspender as células em 5 ml de soro meio livre até ficar homogéneo.
4. Contar o número apropriado de células e ressuspender-los em meio DMEM isento de soro com uma concentração final de 1,75 x 10 ⁵ células em 100 uL de volume.
   1. Tome 50 mistura de células mL e adicionar 50 ul Trypan Blue. Após a mistura, levar de 10 mL mistura e adicione cuidadosamente para o slide contagem das células. Use várias amostras para garantir a estimativa do número de células precisa.
   2. Fique no slide contagem de células, uma extremidade de cada vez eo contador de células começa a contar automaticamente. Tome média de todos os resultados de contagem e calcular o número total de células.
   3. Centrifugar as células novamente e ressuspender-los emo volume apropriado de meio isento de soro para resultar na concentração final de 1,75 x 10 ⁵ células/100 uL de volume.
5. Colocar as células em gelo antes da injecção intracardíaca.

2. Ecografia-guiada injeção intracardíaca

1. Use camundongos nu feminino (BALB / c nu / nu) entre 6-8 semanas de idade.
2. Entrar no sistema de imagem. Inicializar o transdutor 704 (40 MHz).
3. Iniciar um novo estudo e preencher as informações.
4. Anestesiar (3% isoflurane/100% O ₂ em uma câmara de indução) e manter os animais com isofluorano (2%) em 100% _de O2 (1 dm ³ / min) durante todo o processo por meio de um cone de nariz. A anestesia é confirmado quando há reflexo de retirada é observado com toe pitada.
5. Regule a temperatura da tabela de imagem de 37 ° C. Tape o rato anestesiado com a tabela de imagem aquecido em posição supina.
6. Manter o gel de ultra-sons a 37 ° C antes de imenvelhecimento. Aplique o gel para o peito do mouse.
7. Monte o transdutor no suporte. Diminuir o transdutor até a profundidade da imagem desejada seja atingida. Mover a etapa até que o ventrículo esquerdo é identificado com a aorta ascendente, como o ponto de referência (Figura 1A). Bloquear o estágio em que uma visão clara do ventrículo esquerdo é visualizado.
8. Desenhar 100 ul de mistura de células para uma seringa de 1 ml com uma agulha G 22. Coloque e fixar a seringa na seringa de montagem.
9. Mova a seringa para a frente em direção ao peito do mouse e mova-o com cuidado lado para o outro até que a ponta da agulha está no campo de imagem de visão (antes de entrar no mouse).
10. Ajuste a altura da agulha e ângulo para apontar para baixo do ventrículo esquerdo.
11. Penetrar a agulha da seringa no espaço intercostal prontamente através de camadas da pele e do músculo para o ventrículo esquerdo, sob a orientação de ultra-sonografia.
    Uma indicação de uma inserção bem sucedida da agulha no interior do ventrículo esquerdocle é o refluxo do sangue arterial fresco (cor-de-rosa, em contraste com o sangue venoso vermelho escuro) com a seringa
12. Injectar a mistura de células lentamente (Figura 1B).
13. Após a conclusão, retirar a agulha, levante o transdutor, limpe o gel de ultra-som com gaze umedecida e remova a fita.
14. Prepare uma gaiola limpa com um bloco pré-aquecido.
15. Colocar o animal na almofada e observar o animal até a recuperação total.
16. Monitorar o comportamento do animal a cada 24 horas, por dois dias.
17. Condições gerais e sinais neurológicos de complicações em ratinhos experimentais são rotineiramente monitorados.

3. Monitoramento MRI de desenvolvimento do tumor intracraniano

1. Use um ímã 9,4 Tesla para monitorar o desenvolvimento intracraniana de metástases cerebrais.
2. Iniciado MRI duas semanas após a implantação do tumor e repita uma vez por semana por até três semanas.
3. Sedar os animais com 3% de isoflurano e mantê-los sob geneanestesia geral (1,5% de isoflurano).
4. Monitorar e manter a temperatura do corpo do animal e constante da respiração durante todo o experimento.
5. Multislice de alta resolução (14 fatias com 1 mm de espessura, sem intervalo) T ₁ - T ₂ e ponderada imagens coronais, que abrange a região do lobo frontal para a fossa posterior, são adquiridos com os seguintes parâmetros: _1-T imagens ponderadas: girar eco fatia múltipla (SEMS), TR / TE = 400 ms msec/20, matriz: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, na resolução do plano: 78 x 78 mM ^2. T imagens _2-ponderada: rotação rápida eco fatia múltipla (FSEMS) seqüências, TR / TE = 2500 msec/48 ms, 8 trens eco, matriz: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, na resolução do plano: 78 x 78 ^ M ^28,9.
   Lesões tumorais parecem mais brilhantes do que os tecidos normais do cérebro em t imagens _{2-ponderados.}
6. O tamanho do tumor é determinado em t imagens _2-ponderados por delinear manualmente o acesciamento porção da massa em cada imagem usando programas MATLAB escritos por nós ^8.
   Dado a maior parte do tumor diâmetros são menores do que a espessura da fatia (1 mm), o tamanho do tumor apresenta-se como na área do plano, em vez de o volume.

4. H & E coloração Confirmando as metástases

1. Sacrificar os ratos imediatamente após a última MR varredura, dissecar os cérebros portadores de tumor e incorporá-lo em meio outubro e congelado em -80 ° C.
2. Seção de uma série de 10 m de espessura cérebro coronal amostras com criostato.
3. Realize H & E coloração nas seções do cérebro.

Resultados

Com a elevada resolução espacial de ressonância magnética (78 mM de resolução do plano), lesões de hiper-intensas podem ser identificados tão pequeno quanto 310 um de diâmetro (Figura 2). Desde as metástases neste estudo são muito pequenos e desenvolvimento de necrose e edema é mínima, a lesão hiperintensas em T imagens _2-ponderados realmente representava a massa tumoral.

Exames de ressonância magnética permitem longitudinais na avaliaçã...

Discussão

No presente estudo, demonstramos que a injeção ventricular esquerda guiada por ultra-sonografia garante a precisão de modo que todos os animais do estudo desenvolveram metástases cerebrais e morte do animal não foi observada. A beleza da injeção guiada por imagem é que o caminho da penetração da agulha da pele e, finalmente, para o ventrículo esquerdo pode ser monitorado e ajustado sob a imagem, o que é distinto do procedimento manual que exige rigorosos marcos anatômicos para seguir.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30022.01
Trypsin	Mediatech	25-051-C1
Automatic cell counter	BioRad	TC10
Isoflurane	Baxter International Inc.	1001936060
VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System	Visual Sonics Inc.
9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system	Agilent
O.C.T Compound	Sakura Finetek USA	4583