JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La neurotoxina botulínica Matriz BoTest (BoNT) ensayos de detección de purificar y cuantificar rápidamente BoNT a partir de una variedad de matrices de muestras. Aquí, se presenta un protocolo para la detección y cuantificación de BoNT a partir de matrices tanto sólidos como líquidos y demostrar el ensayo con BOTOX ®, los tomates y la leche.

Resumen

Se requiere la detección y cuantificación de la neurotoxina botulínica (NTBo) en matrices complejas precisa para la industria farmacéutica, medioambiental, y las pruebas de muestra de alimento. Se necesita prueba rápida BoNT de los productos alimenticios durante el forense del brote, el diagnóstico del paciente, y las pruebas de seguridad de los alimentos mientras que se requiere la prueba de potencia precisa para la fabricación de productos de fármacos basado en la NTBo y la seguridad del paciente. El bioensayo en ratón ampliamente utilizado para la prueba de BoNT es altamente sensible, pero carece de la precisión y el rendimiento necesario para la prueba rápida y rutinaria de BoNT. Además, el uso del bioensayo de los animales ha dado lugar a los llamados de las autoridades reguladoras de medicamentos y productos proponentes derechos de los animales en los EE.UU. y en el extranjero para sustituir el bioensayo en ratones para probar la NTBo. Varios ensayos in vitro de recambio en se han desarrollado que funciona bien con purificada de BoNT en tampones simples, pero la mayoría no han demostrado ser aplicable a prueba en matrices muy complejas. Aquí, un protocolo para la detección deNTBo en matrices complejas utilizando la matriz de ensayos BoTest se presenta. El ensayo consta de tres partes: La primera parte implica la preparación de las muestras para las pruebas, la segunda parte es un paso inmunoprecipitación usando anti-BoNT recubiertas de anticuerpos perlas paramagnéticas para purificar la NTBo de la matriz, y la tercera parte cuantifica proteolítica de la BoNT aislado actividad utilizando un reportero fluorogenic. El protocolo está escrito para las pruebas de alto rendimiento en placas de 96 pocillos utilizando matrices de ambos líquidos y sólidos y requiere alrededor de 2 h de preparación manual con tiempos de ensayo total de 4-26 horas dependiendo del tipo de muestra, la carga de la toxina, y la sensibilidad deseada. Los datos se presentan para las pruebas de BoNT / A con solución salina tamponada con fosfato, un producto farmacéutico, el sobrenadante del cultivo, 2% de leche, y tomates frescos e incluye la discusión de los parámetros críticos para el éxito del ensayo.

Introducción

Neurotoxinas botulínicas (BoNT) son las sustancias más letales conocidos, con dosis letales intravenosas humanos estiman en 3.1 ng / kg 1,2. Siete serotipos de BoNT estructuralmente similares, etiquetadas A a la G, de existir, consistiendo cada uno en un dominio de cadena pesada responsable de la unión celular, la absorción, y la translocación en el citosol y una cadena ligera que codifica una endopeptidasa de zinc 3-5. La exquisita toxicidad de BoNT resulta de, en parte, de su entrada obligatoria y específica en las neuronas motoras en la unión neuromuscular 6. Una vez dentro de la neurona, la endopeptidasa de la cadena ligera escinde específicamente uno o más de la N-etilmaleimida-sensible receptor soluble de proteína de fijación del factor (SNARE) proteínas necesarias para la fusión de vesículas, la inhibición de la liberación de neurotransmisores y que conduce a parálisis flácida 7-14. Comúnmente conocida como la enfermedad "botulismo" parálisis del diafragma y los músculos intercostales por BoNT en última instancia se traduce ense reciben insuficiencia respiratoria y la muerte a menos que el diagnóstico y tratamiento tempranos.

Botulismo alimentario humano es más comúnmente asociado con BoNT serotipos A, B, E y F (BoNT / D, BoNT / B, etc) y por lo general resulta de la ingestión de alimentos contaminados 15,16, aunque, varios casos de botulismo por heridas fueron reportados entre los usuarios de drogas por vía intravenosa 17,18. En los Estados Unidos, el botulismo infantil como resultado de la ingestión de esporas de Clostridium por los niños menores de uno es la forma más común de botulismo 19-21. Sin embargo, se reportaron brotes de origen alimentario BoNT resultantes de conservas caseras impropio y el procesamiento de alimentos, tanto en Estados Unidos como en el extranjero. Entre 2000-2009, se reportaron al menos 338 casos de botulismo transmitido por alimentos en todo el mundo incluyendo a seis víctimas mortales 22. La capacidad de detectar rápidamente y con sensibilidad brotes de botulismo de origen alimentario es un indicador crítico que podría ayudar al diagnóstico precoz 23,24. Por otra parte, los métodos de detección que permiten rentable y las pruebas de rutina de alimentos dará lugar a una mejora de la seguridad alimentaria.

Especificidad neuronal de BoNT y larga vida media biológica también lo convierte en un potente terapéutico. En los Estados Unidos, los medicamentos basados ​​en la NTBo están aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos para el tratamiento de afecciones cosméticas y trastornos relacionados neuromusculares incluidas las líneas del entrecejo, distonía cervical, dolores de cabeza por migraña, la vejiga hiperactiva, y estrabismo. Numerosas aplicaciones "off-label" están documentados, incluyendo los tratamientos de dosis alta para la disfunción muscular severa 25-28. Cuantificación de toxinas precisa es fundamental para la dosificación correcta, ya que una dosis insuficiente puede dar lugar a un tratamiento ineficaz, mientras que una sobredosis pone a los pacientes en riesgo de efectos secundarios potencialmente dañinos. Desafortunadamente, no existe un protocolo ensayo de potencia normalizada se comparte entre los fabricantes, lo que resulta en desigualdades de definición de unidad entre productores de medicamentos a base de BoNT29-31 cts.

La prueba estándar para la NTBo es el bioensayo en ratones en los que las muestras que contienen NTBo se inyectan por vía intraperitoneal en ratones, y el número de muertes registradas más de 1-7 días 16,32,33. El bioensayo en ratones es muy sensible a los límites de detección (LOD) de 5-10 pg de BoNT / A 34, sin embargo, las preocupaciones éticas sobre el uso de animales, el alto costo de la capacitación del personal y el mantenimiento de instalaciones de los animales, los tiempos de ensayo de largo, y la falta de protocolos estandarizados resultaron en llamadas a desarrollar, las pruebas estandarizadas BoNT libre de productos animales y métodos de cuantificación 35-39. Recientemente, varios métodos alternativos de cuantificación BoNT fueron desarrollados que ofrecen ratón o casi ratón sensibilidad bioensayo 40-49. Estos métodos suelen utilizar la fluorescencia, la espectrometría de masa, o métodos inmunológicos y ofrecen tiempos de ensayo considerablemente más corto que el bioensayo en ratones sin el uso de animales. Mass-espectrometría de enfoques combinados con techniq inmunológicaues, se mostró a detectar y cuantificar BoNT contenida en los alimentos y otras muestras complejas, sin embargo, los requisitos de capacitación de personal y equipo especializado límite de estos ensayos de 50-55. La mayoría de los otros ensayos alternativos no son fácilmente aplicables a la prueba de la muestra compleja o carecen del rendimiento necesarios para las pruebas de rutina BoNT. La naturaleza altamente variable de la viscosidad de la muestra de alimentos, pH, contenido de sal, y constituyentes de la matriz presenta un desafío especialmente difícil cuando se trata de desarrollar métodos de ensayo in vitro con sensibilidad para que coincida con la potencia extrema de la NTBo. Por otra parte, incluso los sistemas de amortiguación simples y relativamente benignas, como las que resultan de la resuspensión de los productos farmacéuticos a base de BoNT, contienen sal, albúmina, azúcar y estabilizantes (por ejemplo, excipientes) que impactan significativamente in vitro BoNT potencia 56. Se requiere la purificación de toxinas de las pruebas de actividad precisa de todos pero la más sencilla de las muestras 56-59.

LaBoTest ensayos de Matrix fue diseñada para una rápida y de alto rendimiento, y la cuantificación consistente de BoNT a partir de muestras de alta complejidad utilizando equipos que se encuentran comúnmente en los laboratorios de investigación 56,60. Estos ensayos utilizan perlas paramagnéticas unidas covalentemente a los anticuerpos anti-BoNT específicos de serotipo de atar y secuestrar BoNT de una muestra y luego eliminar la interferencia de compuestos de matriz mediante lavado. Después del lavado, atado actividad proteolítica BoNT se cuantifica entonces en un tampón de reacción optimizado utilizando un reportero compatible con el serotipo BoNT está probando. Estos reporteros son proteínas fluorogénicos que consisten en una proteína fluorescente cian N-terminal (PPC) y un resto derivado de la proteína fluorescente amarilla C-terminal de resto (Venus) unidos por un sustrato de BoNT, residuos de SNAP25 141 a 206 o los residuos de sinaptobrevina 33-94 que constituye la BoTest A / E o B / D / reporteros F / G, respectivamente 45. Reportero escisión por BoNT se vigila por medio de Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET). Cuando tque el reportero está intacta, la excitación de CFP se traduce en FRET a Venus, apagando emisión PPC y emocionante emisión Venus. La escisión del reportero por BoNT impide FRET, lo que lleva a un aumento en la emisión de PPC y disminución en la emisión de Venus. La actividad de BoNT se puede medir cuantitativamente utilizando la relación de las emisiones de la PPC y Venus. LOD por debajo de 3 pg son posibles a partir de una amplia gama de alimentos utilizando un formato de placa de 96 pocillos de alto rendimiento 56. Aumento de la sensibilidad se puede conseguir utilizando volúmenes de muestra más grandes ya que el ensayo permite la concentración de la toxina en la superficie de la perla.

Los ensayos de Matrix BoTest para BoNTs A, B, E y F se desarrollaron y probaron con alimentos, productos farmacéuticos, y las muestras ambientales 56,60. Aquí se describe los procedimientos para la ejecución de estos ensayos para la detección de la NTBo en baja complejidad (por ejemplo, productos farmacéuticos, la NTBo en la memoria intermedia) y alta complejidad (por ejemplo, alimentos, medio ambiente) muestras. Métodos de procesamiento específicospara se abordan varios tipos de muestras en este protocolo y tipos de muestras que no se describen aquí por lo general se pueden adaptar usando una combinación de los métodos presentados. El protocolo fue desarrollado y probado con BoNT / A, pero se puede adaptar a otros serotipos de NTBo utilizando sus respectivos ensayos como se ha demostrado en otras partes 56,60.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Preparación de Reactivos de ensayo

  1. Ditiotreitol 200x Deshielo (TDT), 10x Matrix tampón de unión (10 veces de aquí en adelante tampón de unión), 10x tampón de neutralización (alimentos o muestras de pH desequilibrados solamente), y 10 veces más BoTest tampón de reacción (10x Reacción adelante buffer) a temperatura ambiente (TA) durante 15 minutos o hasta que esté completamente descongelado. Véase la Tabla 1 para obtener una lista de los tampones y reactivos utilizados en este protocolo. Consulte la Tabla 2 para una lista de materiales y equipos necesarios para este protocolo.
  2. Agite los buffers descongelados durante 5 segundos para mezclar. 10x tampón de neutralización, 200xDTT y 10x tampón de reacción debe ser transparente, mientras que el tampón de unión 10x tendrá un aspecto turbio. Caliente el tampón de reacción 10x durante 5 min a 37 ° C y repita vórtex si su aspecto es turbio tras la descongelación.
  3. Generar 3,8 ml de tampón de reacción 1x.
    1. Etiquete un tubo de "tampón de reacción 1x" cónico de 15 ml y añadir 3,42 ml wat grado biología molecularer, 380 l de 10x tampón de reacción, y 19 l 200x TDT. Mezclar bien por inversión búfer.
    2. Inhibidores de cortar una sola tableta de inhibidor de proteasa libre de EDTA en los trimestres utilizando una hoja de afeitar limpia y añadir un cuarto de la tableta para el tampón de reacción 1x (la porción restante de la tableta se puede almacenar a 4 ° C para su uso posterior). NB de la proteasa no puede ser necesario si el uso de la toxina purificada y tampones simples (por ejemplo, muestras farmacéuticas).
    3. Vortex El tampón de reacción 1x hasta que la tableta de la proteasa se haya disuelto completamente.
  4. Caliente las cuentas de la matriz A (perlas IP-A en adelante) durante 20 minutos a temperatura ambiente.
  5. Descongele el reportero BoTest A / E (A / E reportero de aquí en adelante) a temperatura ambiente protegido de la luz.
  6. Etiquete un tubo cónico de 15 ml "0.5 M A / E reportero" y añadir 45 l de la 20 M reportero A / E de stock a 1,8 ml 1x tampón de reacción. Mezcle bien con la pipeta y almacenar en hielo protegido de la luz.

2. Estar de pieard Generación de la curva de la muestra

La curva estándar descrito aquí abarca 10-30,000 MLD 50 / g de alimento o por ml de tampón en diluciones semi-log (Tabla 3). El usuario final es libre de utilizar concentraciones alternativas según sea aplicable.

  1. Adición y la incubación de las matrices con material de referencia. Generar la curva estándar utilizando un diluyente de la misma matriz que el desconocido, si es posible, para reducir los efectos de matriz. Utilizar una solución tampón de fosfato de gelatina (GPB) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) como diluyente, si la matriz adicional, BoNT-negativo no está disponible (por ejemplo, el campo o BoNT brote de prueba de la muestra). Generar la curva estándar por spiking de BoNT / A en la matriz de elección siguiendo el protocolo apropiado a continuación.
    1. Muestras de baja complejidad (por ejemplo, PBS, GPB, o farmacéutico)
      1. Añadir 10 ml del tampón apropiado a un tubo cónico de 15 ml y reservar. Esta muestra se utiliza como diluyente para el standarcurva d y diluciones desconocidos (Sección 4).
      2. Añadir 1,2 ml de tampón a un tubo de microcentrífuga.
      3. ATENCIÓN: Este paso se utiliza la NTBo y la precaución extrema se debe utilizar para la manipulación y eliminación de cualquier reactivos y materiales que entran en contacto con la toxina. El uso de equipo de protección personal y la disposición adecuada de todos los materiales debe realizarse de acuerdo con el Departamento de Trabajo de las directrices de la OSHA para la NTBo (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) EE.UU.. Añadir de BoNT / A a la muestra 1,2 ml de tal manera que la concentración final es 30 000 50 MLD / ml (36000 MLD 50 en total).
    2. Muestras de alimentos líquidos (u otras muestras líquidas complejas) Nota: se recomienda realizar pruebas iniciales para determinar el volumen de sobrenadante recuperado de muestras clarificadas como el material particulado (por ej. Pulpa) en matrices líquidas variará. Este protocolo supone, al menos, 1,2 ml de sobrenadante clarificado se recuperaron de una samp 1.4 mlle. Aumentar el tamaño de la muestra si es necesario.
      1. Añadir 10 ml de líquido de los alimentos a un tubo cónico de 15 ml y déjela a un lado. Esta muestra se utiliza como diluyente para la curva patrón y las diluciones desconocidos (Sección 4).
      2. Pese un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml vacío y registre su masa.
      3. Añadir 1,4 ml de la comida de líquido al tubo de microcentrífuga pesados.
      4. Volver a pesar el tubo de microcentrífuga y calcular la masa de la muestra de alimento añadido restando la masa del tubo de vacío.
      5. ATENCIÓN: Este paso se utiliza la NTBo y la precaución extrema se debe utilizar para la manipulación y eliminación de cualquier reactivos y materiales que entran en contacto con la toxina. El uso de equipo de protección personal y la disposición adecuada de todos los materiales debe realizarse de acuerdo con el Departamento de Trabajo de las directrices de la OSHA para la NTBo (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) EE.UU.. Añadir de BoNT / A a la muestra 1,4 ml a una concentración final de 30.000 MLD 50 / g de alimento.
      6. Incubaciónte El diluyente y pinchos muestras a temperatura ambiente o 4 º C durante 2 horas para dar tiempo a la NTBo para interactuar con la matriz alimentaria, imitando una contaminación natural.
    3. Las muestras sólidas de alimentos (u otras muestras sólidas) Nota: Se recomienda la prueba inicial para determinar el volumen de sobrenadante recuperado de muestras homogeneizadas y aclaradas tras la adición de 1 ml GPB / g de alimento. Este protocolo asume que al menos 1,2 ml aclararon sobrenadante se recuperó de un 2 g de muestra. Aumentar el tamaño de la muestra si es necesario.
      1. Pesar 10 g de muestra sólido en un tubo cónico de 50 ml y reservar. Esto se utiliza como diluyente.
      2. Pesar 2 g de muestra de alimento sólido en un segundo tubo cónico de 50 ml.
      3. ATENCIÓN: Este paso se utiliza la NTBo y la precaución extrema se debe utilizar para la manipulación y eliminación de cualquier reactivos y materiales que entran en contacto con la toxina. El uso de equipo de protección personal y la disposición adecuada de todos los materialess se deben realizar de acuerdo con el Departamento de Trabajo de las directrices de la OSHA para la NTBo (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) EE.UU.. Añadir de BoNT / A a la superficie de la 2 g de muestra a una concentración final de 30.000 MLD 50 / g de alimento (60000 MLD total de 50).
      4. Incubar el diluyente y muestras adicionadas a temperatura ambiente o 4 º C durante 2 horas para dar tiempo a la NTBo para interactuar con la matriz alimentaria, imitando una contaminación natural.
  2. Homogeneización de la muestra y el tampón de ajuste. Procesar la muestra de curva estándar de pinchos y diluyente generada anteriormente de acuerdo con el tipo de muestra.
    1. Muestras de baja complejidad
      1. No se muestra la transformación adicional es necesario.
    2. Muestras de alimentos líquidos (u otras muestras líquidas complejas)
      1. No se muestra la homogeneización es necesario.
      2. Añadir 140 l de tampón 10x La neutralización de los 1,4 ml de pinchos de muestra y 1 ml de 10x Neutralizationes tampón para la muestra de 10 ml de diluyente. Mezcle las muestras por inversión.
      3. Parcialmente aclarar ambas muestras por centrifugación durante 10 min a 6000 x g y 4 º C. Quitarse de inmediato los sobrenadantes y traslado a nuevos tubos.
    3. Muestras de alimentos sólidos (u otras muestras sólidas)
      1. Añadir 2 ml de GPB (1 ml GPB / g de alimento) a la 2 g de BoNT / A-clavó la muestra de alimento sólido y 10 ml GPB a la 10 g de diluyente de la muestra.
      2. Homogeneizar las muestras usando un mortero hasta que se mezcle bien. Dependiendo de la naturaleza de la muestra, puede haber pequeños trozos de material que no se puede homogeneizar, lo cual es aceptable. Alternativamente, se pueden usar métodos de homogeneización mecánicas. El uso de un mezclador no se recomienda ya que puede inactivar así como aerosolizar la toxina.
      3. Añadir un volumen 1/10th de 10x tampón de neutralización a la muestra de diluyente basado en el volumen total aproximada (por ejemplo, 2 ml, si el volumen es de 20 ml). Extrapolarel volumen total de la muestra global / NTBo-enriquecida y agregar volumen 1/10th de 10x tampón de neutralización. Mezcle las muestras por inversión.
      4. Parcialmente aclarar ambas muestras por centrifugación durante 10 min a 6000 x g y 4 º C. Quitarse de inmediato los sobrenadantes y traslado a nuevos tubos.
  3. Preparar diluciones seriadas de la curva estándar para la prueba
    1. Uso de la / A-muestra marcada de la curva estándar de BoNT como D1 y la muestra nonspiked como diluyente, generar las muestras de la curva estándar restantes en 1,5 ml de tubos de microcentrífuga de acuerdo con la Tabla 3.

3. Preparar Muestras desconocidas

En esta sección se puede completar de forma paralela a la sección 2.

  1. Determinar el número y las diluciones de incógnitas. Pruebe incógnitas por triplicado si es posible.
    1. Para los ensayos cualitativos, ejecute las incógnitas sin dilución adicional que requiere para procesar la muestra como se descricama abajo.
    2. Para los ensayos cuantitativos, preparar al menos dos muestras de 01:10 de dilución, como se describe a continuación, para garantizar que una o más muestras están comprendidas en el intervalo lineal de la respuesta del ensayo. Generar diluciones utilizando un diluyente de la misma matriz que lo desconocido, si es posible, para reducir los efectos de matriz como se describe en la Sección 3. De lo contrario, utilizar PBS o GPB como el diluyente.
  2. Generar y diluyendo muestras desconocidas según el tipo de muestra.
    1. Incógnitas de baja complejidad (por ejemplo, PBS, GPB, o farmacéutico)
      1. Agregue por lo menos 750 l desconocidos a un tubo de microcentrífuga para generar Desconocido dilución 1.
      2. Añadir 675 l de diluyente a dos tubos de microcentrífuga etiquetados Desconocido dilución 2 y 3. El diluyente será el mismo material utilizado para la generación de la curva estándar.
      3. En serie diluir dilución 1 mediante la transferencia de 75 l de dilución 1 en el tubo de dilución 2 y mezclar.
      4. En serie DILUTe dilución 2 mediante la transferencia de 75 l de dilución 2 en el tubo de dilución y mezcla 3.
    2. Incógnitas alimenticios líquidos (u otras muestras líquidas complejas) Nota: se recomienda realizar pruebas iniciales para determinar el volumen de sobrenadante recuperado de muestras clarificadas como se discutió en la Sección 3. Aumentar el tamaño de la muestra si es necesario.
      1. Añadir ≥ 875 l de lo desconocido líquido a un tubo de microcentrífuga.
      2. Añadir un volumen 1/10th de 10x tampón de neutralización de la muestra (por ejemplo, 87,5 l de una muestra de 875 l).
      3. Parcialmente aclarar la muestra por centrifugación durante 10 min a 6000 x g y 4 º C. Inmediatamente transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Esto es desconocido dilución 1.
      4. Añadir 675 l de diluyente a dos tubos etiquetados Desconocido dilución 2 y 3. El diluyente será el mismo material procesado utilizado para la generación de la curva estándar.
      5. En serie diluir dilución 1 por transferenciaanillo de 75 l de dilución 1 en el tubo de dilución 2 y la mezcla.
      6. En serie diluir dilución 2 mediante la transferencia de 75 l de dilución 2 en el tubo de dilución 3 y mezcla.
    3. Incógnitas alimento sólido (u otras muestras sólidas) Nota: Se recomienda la prueba inicial para determinar el volumen de sobrenadante recuperado de muestras clarificadas como se discutió en la Sección 3. Aumentar el tamaño de la muestra si es necesario.
      1. Pesar 2 g de muestra desconocido sólido en un tubo cónico de 50 ml.
      2. Añadir 2 ml GPB (1 ml GPB / g de alimento) a la 2 g de la muestra sólida.
      3. Homogeneizar las muestras como se describe en la Sección 3.2.3.2.
      4. Añadir un volumen 1/10th de 10x tampón de neutralización a la muestra basada en el volumen total aproximada (por ejemplo, 0,4 ml, si el volumen es 4 ml). Mezcle las muestras por inversión.
      5. Parcialmente aclarar la muestra por centrifugación durante 10 min a 6000 x g y 4 º C. INMEDIATAMtransferencia y ≥ 750 l sobrenadante a un tubo de microcentrífuga. Esto es desconocido dilución 1.
      6. Añadir 675 ml de diluyente a dos tubos etiquetados Desconocido dilución 2 y 3. El diluyente será el mismo material procesado utilizado para la generación de la curva estándar.
      7. En serie diluir dilución 1 mediante la transferencia de 75 l de dilución 1 en el tubo de dilución 2 y mezclar.
      8. En serie diluir dilución 2 mediante la transferencia de 75 l de dilución 2 en el tubo de dilución 3 y mezcla.

4. Aclaración de la muestra final

Si el líquido de las pruebas o muestras de alimentos sólidos, centrífuga de todas las muestras durante 5 minutos a 14.000 xg ≥ en una microcentrífuga para aclarar plenamente las muestras. Quitarse de inmediato los sobrenadantes y traslado a nuevos tubos.

5. Configuración de placa y BoNT / A Tire hacia abajo

  1. El diseño de la placa específica depende de la aplicación, sin embargo, no use los pozos externos con el fin depara evitar los efectos de borde. Cada muestra desconocida y muestra patrón curva D1-D8 requiere 3 pozos mientras que la muestra D9 requiere 6 pozos. Un diseño de la placa sugerido se muestra en la Figura 1.
  2. Añadir 20 l de 10x tampón de unión a cada pocillo para ser usado.
  3. Añadir 200 l de cada dilución aclarado y desconocido para cada uno de los tres pozos (seis pozos para D9) para las pruebas por triplicado. Mezcle la placa durante 10 segundos en una mezcladora de microplaca.
  4. Agregue las cuentas de IP-A.
    1. Vortex las cuentas IP-A durante 10 segundos a la velocidad más alta. Continuar agitación vorticial si los granos no están completamente resuspendieron y homogénea.
    2. Pipeta 20 l IP-A cuentas a cada pocillo de muestra.
    3. Mezcle la placa durante 30 segundos en una mezcladora de microplaca.
  5. Incubar la placa utilizando una placa de incubadora giratoria durante 2 horas a 750 rpm, 25 ° C o temperatura ambiente. El rendimiento del ensayo es altamente dependiente de la generación y el mantenimiento de la IP-Una suspensión de microesferas durante todas las etapas de incubación. Perlas siempre resuspender con un Micrófono dmezclador de tarde después de la granulación y mantener la suspensión usando una placa de microtitulación orbital agitador durante todas las etapas de incubación.

6. Lavado de la Plata y Abalorio Resuspensión

  1. Lavar las placas ya sea a mano o mediante el uso de un grano compatible con lavador de placas automatizado magnética. Un lavador de placas automático configurado para los granos magnéticos aumenta en gran medida el rendimiento del ensayo.
    1. Lavado Manual
      1. Etiquete un tubo cónico de 50 ml "tampón de lavado 1X" y añadir 45 ml de agua de grado biología molecular y 5 ml de tampón de lavado 10x Matrix. Mezclar bien por inversión búfer.
      2. Retirar la placa de la placa de la incubadora rotativa.
      3. Colocar inmediatamente la placa en una placa de separación 96 pocillos perla magnética durante 5 min.
      4. Mientras se mantiene la placa en la placa de 96 pocillos de separación de cuentas magnéticas, retire con cuidado y deseche los sobrenadantes de los pocillos de la muestra utilizando una pipeta multicanal de una o. No aspirarcuentas-visualmente supervisar el búfer aspirado en la punta de la pipeta para la eliminación de cuentas accidental. Si es testigo de la eliminación, añadir con cuidado los Contenidos de recomendaciones de vuelta al pozo, reseparate, y repetir la extracción.
      5. Añadir 300 l de tampón de lavado 1X a cada pocillo de muestra.
      6. Resuspender completamente las perlas mezclando la placa durante 30 segundos en una mezcladora de microplaca.
      7. Incubar la placa en la placa de separación de 96 pocillos perla magnética durante 2 min.
      8. Retire y deseche los sobrenadantes de los pocillos de muestras como antes.
      9. Repita los pasos 6.1.1.5-6.1.1.8 tres veces más para un total de 4 lavados.
      10. Con la placa en la placa de separación de 96 pocillos perla magnética, una inspección visual de los pozos para confirmar incluso eliminación de sobrenadante, el uso de una pipeta para eliminar el exceso de tampón residual como sea necesario. Algunos búfer se mantendrá en los pozos y se debe tener cuidado para evitar la eliminación de cuentas o el secado del grano.
      11. Añadir 50 l de tampón de reacción 1X a cada pocillo de la muestra y mezclar la placa durante 30 síc en un mezclador de microplacas para resuspender completamente las perlas. Si es necesario, use una pipeta para volver a suspender totalmente las cuentas.
    2. Lavado automatizado Plate
      1. Configuración y programa de la lavadora de acuerdo con la Tabla 4. Limpie y enjuague la lavadora con alta calidad (por ejemplo nanopura) de agua.
      2. Prepare la lavadora mediante la ejecución del programa "Prime".
      3. Retirar la placa de la placa de la incubadora rotativa.
      4. Inmediatamente colocar la placa en la placa de separación de 96 pocillos de cuentas magnéticas en el lavador de placas.
      5. Ejecute el programa de enlace "Maestro Wash". El primer paso del programa es un paso de incubación de 5 min, donde la lavadora se encuentre estacionado.
      6. Tras la finalización del programa, retire la placa de la lavadora, añadir 50 l de tampón de reacción 1X a cada pocillo de muestra, y mezclar la placa durante 30 segundos en un mezclador de microplacas para volver a suspender totalmente las cuentas. Si es necesario, use una pipeta para volver a suspender totalmente las cuentas.

7. Ensayo Iniciación e Incubación

  1. Añadir 50 reportero l 0,5 M de A / E (véase la Sección 1) a cada pocillo de muestra y se mezcla durante 30 seg en un mezclador de microplacas para resuspender completamente las perlas.
  2. Añadir 100 ml de agua a cada pozo sin usar en la placa para evitar los efectos de borde.
  3. Sellar la placa con cinta de sellado de la placa y se incuba la placa utilizando una placa de incubadora que gira a 750 rpm, 25 ° C o temperatura ambiente. Proteja la placa de la luz durante la incubación.

8. Recopilación y análisis de datos

Nota: Este ensayo es un ensayo en tiempo real que se puede medir varias veces hasta que se obtiene la sensibilidad deseada, no hay reactivos de parada necesarios. Los tiempos de lectura iniciales recomendados son 2, 4, y 24 horas de tiempo de incubación con la sensibilidad del ensayo aumentando con el tiempo de incubación.

  1. La recolección de datos
    1. En cada tiempo de leer, retirar la placa de la placa de la incubadora rotativa, retire el selloción de cintas, e inmediatamente colocar la placa en la placa de separación de 96 pocillos con perlas magnéticas. Permita que los granos se separen durante 2 min.
    2. Colocar la placa en el lector de microplacas y medir las emisiones a ~ 470 y ~ 526 nm bajo excitación a ~ 434 nm.
    3. Si se desean tiempos de lectura adicionales, resuspender las perlas durante 30 segundos en el mezclador de microplacas, cerrar de nuevo la placa, y devolver la placa a la placa de la incubadora rotativa.
  2. Análisis de los datos
    1. Calcular la relación de emisión para cada muestra dividiendo la unidad de fluorescencia relativa (RFU) valor a 526 nm por el valor de RFU a 470 nm.
    2. Representar la relación de emisión frente al log [BoNT / A] para los puntos de datos de la curva estándar. Dependiendo de la BoNT / A Gama de potencia probado, se obtendrá una curva dosis-respuesta sigmoidal (ver resultados representativos).
    3. Coloque los datos de la curva estándar con el pendiente variable curva dosis-respuesta Y = + Bottom (superior-inferior) / (1 ​​+10 ^ ((LogEc 50-X) * Hillslope)) donde X es ellogaritmo de la concentración, Y es la respuesta, e Y comienza en la parte inferior y va a la parte superior con una forma sigmoidal.
    4. Determinar los límites de detección (LOD), límites de cuantificación (LC), y la concentración efectiva media máxima (EC50). Los límites de detección se definen como una muestra que tiene una relación de emisión a menos de 3 desviaciones estándar (DE) por debajo de los controles en blanco (n = 6). Límites de cuantificación se definen como una muestra que tiene una relación de emisión de menos de 10 desviaciones estándar por debajo de los controles en blanco (n = 6). CE 50 se determina a partir de la curva de ajuste de dosis-respuesta sigmoidal.
    5. Interpolar la potencia de las muestras desconocidas contra la curva estándar de dosis-respuesta sigmoidal.
      1. Para resultados cuantitativos, la muestra desconocida idealmente debe caer dentro de la porción lineal de la curva estándar. Aproximado de la porción lineal de la curva estándar mediante el cálculo de la ventana de respuesta de ensayo total de 20-80% (por ejemplo, si la relación de emisión de la curva estándar ranges 0,5 a 2,5, el intervalo lineal sería la porción de la curva estándar que varía desde 0,9 hasta 2,1).
      2. Para resultados cualitativos, comparar la muestra desconocida contra la LOD y LOQ de la curva estándar.
      3. No extrapolar muestras desconocidas más allá de los límites de la curva estándar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Un diagrama que resume los pasos en el protocolo descrito se muestra en la Figura 2. El ensayo requiere entre 4-26 horas en completarse, dependiendo del tipo de muestra y la sensibilidad del ensayo deseado, pero sólo ~ 2 horas de tiempo de práctica. El ensayo se realiza en placas de 96 pocillos y, dependiendo del tipo de prueba que se lleva a cabo, permite realizar pruebas por triplicado de hasta 20 muestras incluidas las normas por placa.

La Figura 3 mues...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Este protocolo describe los procedimientos para la cuantificación de BoNT / A complejo holotoxina o Clostridium sobrenadante de cultivo en matrices complejas. El protocolo es el mismo, sin embargo, al probar otra serotipos de BoNT (por ejemplo BoNT / B, E y F) con sus respectivos ensayos Matrix 56,60, aunque la sensibilidad del ensayo variará según los serotipos y ensayos. Este protocolo no tiene en cuenta para cada tipo de muestra posible y algunas modificaciones puede ser necesaria depe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgaciones

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin y WC Tucker son empleados o propietarios de BioSentinel Inc. BioSentinel actualmente fabrica y ha comercializado algunos de los reactivos que se presentan en este informe.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a H. Olivares y D. Ruge para las discusiones y consejos valiosos. Esta investigación fue financiada en parte por un premio NSF SBIR (IIP-1.127.245 a BioSentinel Inc.) y un Departamento de Defensa contrato (W81XWH-07-2-0045 a BioSentinel Inc.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection KitBioSentinelA1015Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate readerThermo Fisher Scientific5250040Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation PlateV&P ScientificVP771HOther magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate WasherBioTekELx405 VSRMOptional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
MicrocentrifugeOptional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixerEppendorf22674200
Orbital ShakerUsed at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor TabletsRoche4693132001Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/AMetabiologicsOptional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well PlatesNUNC237105Plates should not be treated
96-well Plate Sealing TapeThermo Fisher Scientific15036

Referencias

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). , (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. , (2003).
  36. Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. , (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. , (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O'Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Neurocienciabotul nicaan lisis de alimentosdetecci ncuantificaci nmatrices complejasMatrix BoTestClostridiumlas pruebas de potencia

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados