JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

BoTest Матрица нейротоксин ботулизма (BoNT) анализы обнаружения быстро очистить и количественно Бонт из целого ряда образцов матриц. Здесь мы приводим протокол для обнаружения и количественного определения BoNT от обоих твердых и жидких матриц и продемонстрировать анализа с помощью ботокса, помидоры, и молока.

Аннотация

Точное обнаружение и количественное определение ботулинического нейротоксина (ботулинического токсина) в комплексных матриц требуется для фармацевтической, экологических и испытаний образцов пищевых продуктов. Быстрое BoNT тестирование продуктов питания необходим во время вспышки экспертизы, диагностики пациента и тестирования безопасности пищевых продуктов в то время как точная потенции испытания для производства ботулинического токсина типа на основе лекарственного препарата и безопасности пациентов. Широко используется мышь биопроб для тестирования ботулинического токсина очень чувствительна, но не хватает точности и пропускной необходимое для быстрого и регулярного тестирования ботулинического токсина. Кроме того, использование биоанализе в животных привело к призывам лекарственного продукта регулирующими органами и сторонниками за права животных в США и за рубежом, чтобы заменить биоанализ мыши для тестирования ботулинического токсина. Несколько в пробирке запасные анализы были разработаны, которые хорошо работают с очищенной BoNT в простых буферов, но большинство из них не было показано, что применимо к тестированию в очень сложных матриц. Здесь, протокол для обнаруженияBoNT в комплексных матриц с использованием BoTest Matrix анализов представлена. Анализ состоит из трех частей: Первая часть включает в себя подготовку образцов для тестирования, вторая часть является шагом иммунопреципитацию использованием анти-Бонт антител покрытием парамагнитные шарики, чтобы очистить Бонт из матрицы, и третья часть количественно протеолитической изолированной Бонт в Деятельность, использующая флуорогенный репортер. Протокол написана для высокой пропускной тестирования в 96-луночных планшетах с использованием как жидкие, так и твердые матрицы и требует около 2 ч ручного приготовления с всего раз анализе 4-26 часов в зависимости от типа образца, токсинов нагрузки и желаемого чувствительности. Данные представлены для BoNT / A тестирования с забуференным фосфатом физиологическим раствором, лекарственного продукта, культурального супернатанта, 2% молока и свежих томатов и включает обсуждение критических параметров успеха анализа.

Введение

Нейротоксинов ботулина (BoNTs) являются самыми смертоносными вещества, известные, с внутривенных человека смертельных доз оценивается в 1-3 нг / кг 1,2. Семь структурно подобные серотипов BoNT, помечены через G, существует, каждый из которых состоит из тяжелой цепи домена, ответственного за связывание клеток, поглощение, и транслокации в цитозоль и легкой цепи, которая кодирует цинка эндопептидазы 3-5. Изысканный токсичность BoNT результатом, в частности, его специфического связывания и вступление в моторных нейронов в нервно-мышечном соединении 6. Оказавшись внутри нейрона, легкой цепи эндопептидаза специально расщепляет один или несколько из растворимого N-этилмалеимид чувствительных рецепторов белка привязанность фактором (SNARE) белков, необходимых для слияния пузырьков, ингибирования высвобождение нейромедиаторов и приводит к вялым параличом 7-14. Обычно известный как болезнь "ботулизма", паралич диафрагмы и межреберных мышц по BoNT в конечном итоге приводитдыхательная недостаточность и смерть, если ранней диагностики и лечения принимаются.

Человека пищевого ботулизма чаще всего ассоциируется с ботулинического токсина серотипов A, B, E, и F (BoNT / A, BoNT / B, и т.д.) и обычно возникает в результате употребления в пищу загрязненных продуктов питания 15,16, хотя несколько случаев раны ботулизма было зарегистрировано среди потребителей инъекционных наркотиков 17,18. В Соединенных Штатах, детский ботулизм в результате проглатывания Clostridium спор детьми в возрасте до одного является наиболее распространенной формой ботулизма 19-21. Тем не менее, были зарегистрированы пищевые вспышки ботулинического токсина в результате неправильного домашнего консервирования и переработки пищевых продуктов как в Соединенных Штатах и ​​за рубежом. Между 2000-2009 было зарегистрировано по меньшей мере 338 случаев пищевого ботулизма во всем мире в том числе шесть погибших 22. Способность быстро и чутко обнаружить пищевого происхождения вспышек ботулизма является одним из важнейших признаков того, что может помочь ранней диагностики 23,24. Кроме того, методы обнаружения, которые позволяют экономически эффективным и рутинное тестирование питания приведет к улучшению продовольственной безопасности.

Нейронов специфика Бонт и долго биологического полураспада также делает его мощным терапевтическим. В Соединенных Штатах, наркотики ботулинического токсина типа на основе утверждаются по контролю за продуктами и лекарствами для лечения косметических состояний и нервно-мышечных расстройств, связанных в том числе глабеллярных линий, цервикальной дистонии, мигрени, гиперактивного мочевого пузыря, и косоглазия. Многочисленные "не по прямому назначению" приложений задокументированы, в том числе высоких доз лечения тяжелой дисфункцией мышц 25-28. Точная токсин количественное имеет решающее значение для правильного дозирования, как недокомпенсация может привести к неэффективному лечению в то время как передозировка ставит пациентов риску потенциально вредных побочных эффектов. К сожалению, ни стандартизированный протокол потенции анализ не является общим для производителей, в результате чего неравенства четкости блок между ботулинического токсина типа на основе произво наркотиковк.т.н. 29-31.

Стандартный тест на BoNT является биоанализа мыши, в котором BoNT-содержащие образцы инъецировали внутрибрюшинно мышам и количество смертей, зарегистрированных в течение 1-7 дней 16,32,33. Биологический мыши очень чувствительна с пределов обнаружения (LOD) 5-10 пг BoNT / A 34, однако этические опасения по поводу использования животных, высокая стоимость обучения персонала и поддержание объектов животного, длинные раз анализе и отсутствие стандартизированные протоколы привели призывы разработать стандартизированную, животное без Бонт тестирования и методы количественной 35-39. В последнее время несколько альтернативные методы ботулинического токсина количественного были разработаны, которые предлагают мыши или почти мыши чувствительность биопроб 40-49. Эти методы обычно используют флуоресценцию, масс-спектрометрии, или иммунологические методы и предлагают раз опробования значительно короче биопроб мыши без использования животных. Масс-спектрометрии подходов в сочетании с иммунологической TechniqЕЭС были показаны для выявления и количественной BoNT содержится в продуктах питания и других сложных образцов, однако требования к обучению персонала и предел специализированное оборудование этих анализов 50-55. Большинство других альтернативных анализы не всегда применимы к сложной образца тестирования или не хватает пропускной способности, необходимой для регулярного тестирования ботулинического токсина. Сильно варьирует характер образца пищевой вязкости, рН, содержание солей и матричных компонентов представляет особенно трудную задачу, пытаясь развить в пробирке методы анализа с чувствительностью, чтобы соответствовать крайнюю потенцию BoNT. Кроме того, даже простые и относительно доброкачественные буферные системы, такие, как в результате ресуспендированием лекарственных продуктов ботулинического токсина типа на основе, содержат соли, альбумина и сахара стабилизаторы (т.е. наполнители), что значительно повлиять в пробирке BoNT потенции 56. Очистка Токсин требуется для точной деятельности тестирования всех, кроме простейших образцов 56-59.

BoTest Матричные анализы предназначен для быстрого, высокой пропускной способностью, и в соответствии количественное BoNT от очень сложных образцов с использованием оборудования обычно встречаются в научно-исследовательских лабораториях 56,60. Эти анализы использовать парамагнитные шарики, ковалентно связанные с серотипа конкретных анти-ботулинического токсина антител связываться и поглощения Бонт из образца, а затем удалить вмешиваясь матричные соединения промывкой. После промывания, граница протеолитическую активность ботулинического токсина затем количественно в оптимизированном реакционного буфера, используя репортер, совместимый с серотип ботулинического токсина проходит испытания. Эти репортеры флуорогенные белки, состоящие из N-концевой голубой флуоресцентный белок (СФП) фрагмент и желтый флуоресцентный производной (Венера) фрагмент С-концевой белок, связанный с помощью ботулинического токсина подложки, SNAP25 остатков 141-206 или синаптобревин остатков 33-94 составляющих BoTest / E или B / D / F / G репортеры, соответственно 45. Репортер расщепление BoNT контролируется с использованием Förster резонансный перенос энергии (FRET). При тон репортер не повреждена, возбуждение CFP приводит лад с Венеры, закалки эмиссию CFP и интересно излучение Венеры. Расщепление репортера по BoNT предотвращает FRET, что приводит к увеличению эмиссии CFP и снижения выброса Венера. BoNT активность может быть количественно измерена с помощью соотношение количества выбросов CFP и Венеры. LOD ниже 3 мкг возможны из широкого спектра пищевых продуктов с использованием высокой пропускной формат 96-луночный планшет 56. Увеличение чувствительности могут быть получены с использованием больших объемов образцов, так как анализ позволяет концентрацию токсина на поверхности шарика.

Матрица анализы BoTest для BoNTs А, В, Е и F были разработаны и протестированы с пищевой, фармацевтической, и проб окружающей среды 56,60. Здесь мы описываем процедуры для выполнения этих анализов для обнаружения BoNT в низкой сложности (например, фармацевтической, BoNT в буфере) и высокая сложность (например, продукты питания, экологической) образцы. Конкретные методы обработкина несколько типов образцов, рассматриваются в данном протоколе и типов образцов, не описанные здесь, как правило, могут быть адаптированы с помощью комбинации представленных методов. Протокол был разработан и испытан с BoNT / A, но адаптированы к условиям других серотипов ботулинического токсина использовали свою анализов, как показано в другом месте 56,60.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка реагентов для анализа

  1. Thaw 200x дитиотреитола (DTT), 10x Матрица Связывающий буфер (10х буфера для связывания далее), 10x нейтрализации буфера (рН пищевых или несбалансированные образцы только) и 10x BoTest Реакционный буфер (10х реакционного буфера далее) при комнатной температуре (RT) в течение 15 мин или до полного оттаивают. См. Таблицу 1 для списка буферов и реагентов, используемых в данном протоколе. См. Таблицу 2 для списка материалов и оборудования, необходимых для этого протокола.
  2. Vortex талой буферы для 5 сек перемешать. 10x Нейтрализация буфера, 200xDTT и 10x Реакция буфер должен появиться ясно в то время как связывание буфера 10x будет иметь мутный вид. Нагревают 10x реакционного буфера в течение 5 мин при 37 ° С и повторить вихревание, если он появляется облачно следующее размораживание.
  3. Генерация 3,8 мл 1x реакционного буфера.
    1. Этикетка 15 мл коническую трубку "1x реакционного буфера" и добавить 3,42 мл молекулярная биология класс Ватэ-э, 380 мкл 10х Реакция буфера и 19 мкл 200x DTT. Смешайте буфера хорошо инверсии.
    2. Ингибиторы вырезать отдельную ЭДТА без ингибитор протеазы таблетку в кварталах с использованием чистой лезвие и добавить одну четверть таблетки на 1х реакционного буфера (остальные таблетки часть может храниться при 4 ° С для дальнейшего использования). NB протеазы не может быть необходимо, если с использованием очищенного токсина и простые буферы (например, фармацевтические образцов).
    3. Vortex 1x буфер Реакция пока протеазы таблетки полностью не растворится.
  4. Теплый бисер Матрица A (IP-бусы далее) в течение 20 мин при комнатной температуре.
  5. Оттепель репортеру BoTest / E (A / E репортер далее) при комнатной температуре в защищенном от света месте.
  6. Этикетка 15 мл коническую трубку "0,5 мкМ / E-репортер" и добавить 45 мкл 20 мкМ / E репортера складе до 1,8 мл 1x реакционного буфера. Тщательно перемешать с помощью пипетки и хранить на защищенном от света льда.

2. СтоятьARD Образец Кривая поколения

Стандартная кривая описано здесь охватывает 10-30,000 MLD 50 / г пищи или за буфером мл в разведении полулогарифмических (табл. 3). Конечный пользователь может свободно использовать альтернативные концентрации в зависимости от обстоятельств.

  1. Прокалывание и инкубации матрицы с справочного материала. Генерация стандартной кривой с использованием разбавителя из той же матрицей, как неизвестный, по возможности, снизить матричные эффекты. Использование желатина фосфатного буфера (ГПБ) или фосфатно-солевом буфере (PBS) в качестве разбавителя, если дополнительные, BoNT-отрицательных матрица не доступны (например, поле или BoNT вспышка тестирование образец). Генерирование стандартную кривую пики BoNT / A в матрицу выбора после соответствующего протокола ниже.
    1. Образцы низкой сложности (например, PBS, ГПБ, или фармацевтической)
      1. Добавьте 10 мл соответствующего буфера в 15 мл коническую трубку и отложите в сторону. Этот пример будет использован в качестве разбавител дл стандартизации Организацииг кривой и неизвестные разведения (раздел 4).
      2. Добавить 1,2 мл буфера для микроцентрифужных трубки.
      3. ВНИМАНИЕ: Этот шаг использует Бонт и крайняя осторожность должна быть использована при обработке и утилизации любых реагентов и материалов, которые входят в контакт с токсином. Использование средств индивидуальной защиты и правильной утилизации всех материалов должны выполняться в соответствии с Министерством труда США OSHA принципов для BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Добавить BoNT / A в 1,2 мл образца так, чтобы конечная концентрация 30 000 50 MLD / мл (36000 MLD 50 всего).
    2. Образцы Жидкие пищевые (или другие сложные жидкие образцы) Примечание: Первоначальное тестирование рекомендуется определить объем супернатанта оправился от выясненных образцов как твердых частиц (. Например целлюлозно) в жидких матриц будет меняться. Этот протокол предполагает не менее 1,2 мл осветленной надосадочной будет оправился от 1,4 мл SAMPле. Увеличение размера выборки при необходимости.
      1. Добавьте 10 мл жидкой пищи к 15 мл коническую трубку и отложите ее в сторону. Этот образец будет использоваться в качестве разбавителя для стандартной кривой и неизвестных разведения (раздел 4).
      2. Взвесьте пустой 1,5 трубки микроцентрифужных мл и записать его массу.
      3. Добавить 1,4 мл жидкого пищи взвешенной микроцентрифужных трубки.
      4. Взвешивают в микроцентрифужную пробирку и рассчитать массу добавленного образца пищевого путем вычитания массы пустой трубы.
      5. ВНИМАНИЕ: Этот шаг использует Бонт и крайняя осторожность должна быть использована при обработке и утилизации любых реагентов и материалов, которые входят в контакт с токсином. Использование средств индивидуальной защиты и правильной утилизации всех материалов должны выполняться в соответствии с Министерством труда США OSHA принципов для BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Добавить BoNT / A в образце 1,4 мл при конечной концентрации 30 000 50 MLD / г пищи.
      6. Инкубациит.е разбавитель и шипами образцы при комнатной температуре или температуре 4 ° С в течение 2 часов, чтобы дать время BoNT взаимодействовать с пищевой матрицы, имитируя естественное загрязнение.
    3. Образцы твердой пищи (или в других твердых образцов) Примечание: Первоначальное тестирование рекомендуется определить объем супернатанта, выделенного из усредненных и осветленных образцов после добавления 1 мл ГПБ / г пищи. Этот протокол предполагает, что по крайней мере 1,2 мл осветленный супернатант будут восстановлены из 2 г образца. Увеличение размера выборки при необходимости.
      1. Взвесить 10 г твердого образца в 50 мл коническую трубку и отложите в сторону. Это будет использоваться в качестве разбавителя.
      2. Взвесить 2 г твердого образца пищи во второй 50 мл коническую трубку.
      3. ВНИМАНИЕ: Этот шаг использует Бонт и крайняя осторожность должна быть использована при обработке и утилизации любых реагентов и материалов, которые входят в контакт с токсином. Использование средств индивидуальной защиты и правильной утилизации всех материаловс должны выполняться в соответствии с Министерством труда США OSHA принципов для BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Добавить BoNT / A в поверхности 2 г образца в конечной концентрации 30 000 50 MLD / г пищи (60000 общий MLD 50).
      4. Инкубируйте разбавитель и шипами образцов при комнатной температуре или температуре 4 ° С в течение 2 часов, чтобы дать время BoNT взаимодействовать с пищевой матрицы, имитируя естественное загрязнение.
  2. Образец гомогенизации и буфер регулировки. Обработайте шипами стандартного образца кривой и разбавителя сгенерированный выше в зависимости от типа образца.
    1. Низкие образцы сложности
      1. Никакой дополнительной обработки образцов не требуется.
    2. Образцы жидких пищевых продуктов (или другие сложные жидкие образцы)
      1. Нет образец гомогенизации не требуется.
      2. Добавить 140 мкл 10x нейтрализации буфера с 1,4 мл шипами образец и 1 мл 10x Обезвреживаион буфер для разбавителя образца на 10 мл. Смешайте образцы хорошо инверсии.
      3. Частично прояснить оба образца центрифугированием в течение 10 мин при 6000 х г и 4 ° С. Немедленно снять супернатанты и передавать в новые пробирки.
    3. Образцы твердой пищи (или в других твердых образцов)
      1. Добавить 2 мл ГПБ (1 мл ГПБ / г пищи) к 2 г BoNT / A-шипами твердого образца продуктов питания и 10 мл ГПБ в 10 г разбавителя образца.
      2. Гомогенизируют образцы, используя пестик пока полностью не смешиваются. В зависимости от природы пробы, могут быть небольшие куски материала, который не может быть гомогенизируют, который является приемлемым. С другой стороны, могут быть использованы механические методы гомогенизации. Использование блендер не рекомендуется, поскольку это может инактивировать а также аэрозоль токсин.
      3. Добавить объем 1/10th из 10х буфера для нейтрализации разбавителя образца на основе приближенного общего объема (например, 2 мл, если объем 20 мл). ЭкстраполироватьОбщий объем / образец ботулинического токсина А-шипами и добавить объем 1/10th из 10х нейтрализации буфера. Смешайте образцы хорошо инверсии.
      4. Частично прояснить оба образца центрифугированием в течение 10 мин при 6000 х г и 4 ° С. Немедленно снять супернатанты и передавать в новые пробирки.
  3. Подготовка стандартной кривой серийные разведения для тестирования
    1. Использование BoNT / A-шипами стандартного образца кривую, как D1 и nonspiked образец в качестве разбавителя, генерировать оставшиеся стандартных образцов кривой в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках в соответствии с таблицей 3.

3. Подготовка неизвестных образцов

В этом разделе может быть завершена в параллельной секции 2.

  1. Определить количество и разведения неизвестных. Проверьте неизвестных в трех экземплярах, если это возможно.
    1. Для качественных анализов, запускать неизвестные без дальнейшего разбавления, чем требуется для обработки образца, как descriкровать ниже.
    2. Для количественных анализов, подготовка по меньшей мере два 1:10 разбавление образцов, как описано ниже, чтобы гарантировать, что один или более образцов попадают в пределах линейного диапазона ответа анализа. Создать разведения с использованием разбавителя из той же матрицей, как неизвестное, если это возможно, чтобы уменьшить матричные эффекты, как описано в разделе 3. В противном случае, использовать PBS или ГПБ в качестве разбавителя.
  2. Создание и разбавления неизвестных образцов в зависимости от типа образца.
    1. Низкие неизвестных сложности (например, PBS, ГПБ, или фармацевтической)
      1. Добавить по крайней мере, 750 мкл неизвестные микроцентрифужных трубки для генерации Неизвестный разбавление 1.
      2. Добавить 675 мкл разбавителя для двух микропробирок меченых Неизвестный разбавления 2 и 3. Разбавитель будет таким же материал, используемый для стандартной кривой поколения.
      3. Серийно разбавить разбавление 1 путем передачи 75 мкл разведения 1 в разведение 2 трубки и смешивания.
      4. Серийно разбавлятье разведение 2 путем передачи 75 мкл разведения 2 в разведение 3 трубки и смешивания.
    2. Жидкие неизвестные питания (или другие сложные жидкие образцы) Примечание: Первоначальное тестирование рекомендуется определить объем супернатанта оправился от выясненных образцов, как описано в разделе 3. Увеличение размера выборки при необходимости.
      1. Добавить ≥ 875 мкл жидкой неизвестны микроцентрифужных трубки.
      2. Добавить объем 1/10th из 10х нейтрализации буфера образца (например, 87,5 мкл для 875 мкл образца).
      3. Частично уточнить образец центрифугированием в течение 10 мин при 6000 х г и 4 ° С. Сразу передачи супернатант в новую пробирку. Это неизвестно разбавления 1.
      4. Добавить 675 мкл разбавителя для двух труб меченых Неизвестный разбавления 2 и 3. Разбавитель будет таким же обработке материал, используемый для стандартной кривой поколения.
      5. Серийно разбавить разбавление 1 переводомкольцо 75 мкл разведения 1 в разведение 2 трубки и смешивания.
      6. Серийно разбавить разбавление 2 путем передачи 75 мкл разведения 2 в разведение 3 трубки и смешивания.
    3. Твердые неизвестные питания (или в других твердых образцов) Примечание: Первоначальное тестирование рекомендуется определить объем супернатанта оправился от выясненных образцов, как описано в разделе 3. Увеличение размера выборки при необходимости.
      1. Взвесить 2 г твердого неизвестного образца в 50 мл коническую трубку.
      2. Добавить 2 мл ГПБ (1 мл ГПБ / г пищи) к 2 г твердого образца.
      3. Гомогенизируют образцы, как описано в разделе 3.2.3.2.
      4. Добавить объем 1/10th из 10х буфера нейтрализации к образцу на основе приближенного общего объема (например, 0,4 мл если объем 4 мл). Смешайте образцы хорошо инверсии.
      5. Частично уточнить образец центрифугированием в течение 10 мин при 6000 х г и 4 ° С. Immediatelу передачи ≥ 750 мкл супернатанта в микроцентрифужных трубки. Это неизвестно разбавления 1.
      6. Добавить 675 мл разбавителя до двух трубок меченых Неизвестный разбавления 2 и 3. Разбавитель будет таким же обработке материал, используемый для стандартной кривой поколения.
      7. Серийно разбавить разбавление 1 путем передачи 75 мкл разведения 1 в разведение 2 трубки и смешивания.
      8. Серийно разбавить разбавление 2 путем передачи 75 мкл разведения 2 в разведение 3 трубки и смешивания.

4. Окончательная проба Разъяснение

Если тестирование жидкие или твердые образцы продуктов питания, центрифуги все образцы в течение 5 мин при ≥ 14000 мкг в микроцентрифуге в полной мере прояснить образцы. Немедленно снять супернатанты и передавать в новые пробирки.

5. Тарелка Настройка и BoNT / Pull Down

  1. Конкретная схема пластины зависит от приложения, однако, не следует использовать внешние скважин с тем,чтобы избежать краевых эффектов. Каждый неизвестный образец и стандартный образец кривая D1-D8 требуется 3 скважины в то время как образец D9 требуется 6 скважин. Предлагаемый макет пластина показано на рисунке 1.
  2. Добавить 20 мкл 10х буфера для связывания в каждую лунку быть использованы.
  3. Добавить 200 мкл каждого осветленной разбавления и неизвестно к каждому из трех скважин (шесть скважин для D9) для трех экземплярах тестирования. Смешайте пластины в течение 10 сек на микропланшет-смесителе.
  4. Добавить бусинки IP-A.
    1. Вихревые шарики IP-A в течение 10 секунд на максимальной скорости. Продолжить вихревание если шарики не полностью ресуспендировали и однородным.
    2. Внесите 20 мкл IP-Бусы в каждом образце хорошо.
    3. Смешайте пластины в течение 30 сек на микропланшет-смесителе.
  5. Инкубировать при помощи вращающейся пластины инкубатор в течение 2 часов при 750 оборотах в минуту, 25 ° С или комнатной температуре. Проведение теста сильно зависит от генерации и поддержании IP-шарик суспензии в течение всех этапов инкубации. Всегда ресуспендируйте шарики с micropпоздно смеситель после гранулирования и поддерживать приостановку используя орбитальный микропланшетах шейкер в течение всех этапов инкубации.

6. Тарелка Стиральная и бисера Ресуспендирование

  1. Вымойте тарелки вручную или с помощью магнитного шарика-совместимый автоматизированный плоскую шайбу. Автоматизированная промывания планшетов настроен на магнитных шариков значительно увеличивает анализа пропускной способности.
    1. Руководство Стиральная
      1. Этикетка 50 мл коническую трубку "1x промывочного буфера" и добавить 45 мл молекулярная биология класс воды и 5 мл 10x Матрица промывочного буфера. Смешайте буфера хорошо инверсии.
      2. Извлеките пластину с вращающейся пластины инкубаторе.
      3. Сразу же место пластину на 96-луночном магнитный шарик разделительной пластине в течение 5 мин.
      4. Удерживая пластину на 96-луночного разделения магнитного шарик плиты, аккуратно снимите и выбросьте супернатанты из образца скважин с помощью пипетки одно-или многоканальный. Не аспирациибисер-визуально контролировать атмосферный буфер в пипетки для случайного удаления борта. Если удаление свидетелем, мягко добавить содержимое наконечников обратно в скважины, reseparate, и повторите удаление.
      5. Добавить 300 мкл буфера 1x Wash к каждому образцу хорошо.
      6. Полностью ресуспендируют бисером путем смешивания пластины в течение 30 сек на микропланшет-смесителе.
      7. Инкубировать на 96-а магнитное борта разделительной пластины в течение 2 мин.
      8. Снимите и выбросьте супернатанты из образца скважин, как и раньше.
      9. Повторите шаги 6.1.1.5-6.1.1.8 еще три раза в общей сложности 4 стирок.
      10. С пластины на 96-а магнитное борта разделительной пластины, осмотрите скважин для подтверждения даже надосадочную удаление; использовать пипетку, чтобы удалить лишнюю остаточный буфер по мере необходимости. Некоторые буфера останется в скважинах и необходимо позаботиться, чтобы избежать удаления шарик или шарик сушки.
      11. Добавить 50 мкл 1x буфер реакция на каждого образца скважины и смешать тарелку для 30 SEс на микропланшет смесителя полностью ресуспендируют бисером. При необходимости используйте пипетку, чтобы полностью ресуспендируют бисером.
    2. Автоматизированная Стиральная плиты
      1. Установка и программа шайба согласно таблице 4. Чистый и флеш шайба с высоким качеством (например NanoPure) воды.
      2. Премьер-шайба, запустив программу "Премьер".
      3. Извлеките пластину с вращающейся пластины инкубаторе.
      4. Сразу же место пластину на 96-а магнитное борта разделительной пластины на пластины шайбой.
      5. Запустите программу ссылка «Мастер Wash". Первым шагом программы является шагом инкубации 5 мин, где шайба будет стационарным.
      6. После завершения программы, удалить пластину из мойки, добавить 50 мкл 1x реакционного буфера к каждому образцу хорошо, и смешать пластину в течение 30 сек на микропланшет смесителя полностью ресуспендируют бисером. При необходимости используйте пипетку, чтобы полностью ресуспендируют бисером.

    7. Анализ Инициирование и Инкубационный

    1. Добавить 50 мкл 0,5 мкМ / E репортера (см. раздел 1) для каждого образца скважины и перемешивать в течение 30 сек на микропланшет смесителя полностью ресуспендируют бисером.
    2. Добавить 100 мкл воды для каждого неиспользуемого скважины на тарелку, чтобы предотвратить краевые эффекты.
    3. Уплотнение пластину с пластиной герметизирующей лентой и инкубируют планшет с использованием вращающейся пластины инкубатор при 750 оборотах в минуту, 25 ° C или RT. Защитите пластину от света во время инкубации.

    8. Сбор и анализ данных

    Примечание: Этот анализ в режиме реального времени анализ, который может быть измерена несколько раз, пока не будет достигнуто желаемое чувствительность, нет никаких стоп-реагенты. Рекомендуемые начальные время чтения являются 2, 4 и 24 часа в сутки время инкубации с чувствительности анализа возрастает со временем инкубации.

    1. Сбор данных
      1. На каждом читать времени, удалить пластину из вращающейся пластины инкубатора, снять пломбуING ленту, и сразу же поместите пластину на 96-а магнитное борта разделительной пластины. Разрешить шарики, чтобы отделить в течение 2 мин.
      2. Место пластины в микропланшетного и измерять выбросы на ~ 470 и ~ 526 нм при возбуждении в ~ 434 нм.
      3. Если дополнительные время чтения желательно, ресуспендируют бисером в течение 30 сек на микропланшет-смеситель, запечатать пластину, и вернуть пластину к вращающейся пластины инкубаторе.
    2. Анализ данных
      1. Рассчитать отношение выбросов для каждого образца путем деления относительного блок флуоресценции значение (РФС) на 526 нм по значению РФС на 470 нм.
      2. Участок соотношение выбросов по сравнению с журнала [BoNT / A] для стандартных точек данных кривой. В зависимости от BoNT / A диапазоне потенции проверено, сигмоидальная кривую доза-реакция будет получена (см. репрезентативные результаты).
      3. Установите стандартные данные кривой с переменным наклоном доза-реакция кривой Y = Нижняя + (верх-низ) / (1 ​​+10 ^ ((LogEc 50-X) * Hillslope)), где X являетсялогарифм концентрации, Y является ответом, и Y начинается в нижней части и идет к вершине с сигмоидальной форме.
      4. Определить границы обнаружения (LOD), пределы количественного (ПКО) и полумаксимальной эффективной концентрации (ЕС 50). Пределы обнаружения определяются в качестве образца, имеющего соотношение выбросов менее 3 стандартных отклонения (SDS) ниже пустых управления (N = 6). Пределы количественного определяются как образец, имеющий степень эмиссии менее 10 СД ниже пустых управления (N = 6). EC 50 определяется из сигмоидальной кривой подгонки доза-ответ.
      5. Интерполировать потенцию неизвестных образцов против сигмоидальной стандартной кривой доза-реакция.
        1. Для количественных результатов, неизвестный образец в идеале должна находиться в пределах линейной части калибровочной кривой. Аппроксимировать линейной части калибровочной кривой путем расчета общее окно отклика анализ 20-80% (например, если коэффициент эмиссии стандартной кривой гАнгес от 0,5-2,5, линейный диапазон будет часть стандартной кривой в диапазоне от 0,9-2,1).
        2. Для качественных результатов, сравнение неизвестного образца по отношению к LOD и LOQ стандартной кривой.
        3. Не экстраполировать неизвестных образцов за пределы стандартной кривой.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Схема подведения шаги в описанной протокола показано на рисунке 2. Анализ требует от 4-26 часов, чтобы завершить в зависимости от типа образца и желаемой чувствительности анализа, но только ~ 2 часа из практического времени. Анализ проводят в 96-луночных планшетах и, в зависимости ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает процедуры для количественного BoNT / A сложный, голотоксина или Clostridium супернатанта культуры в комплексных матриц. Протокол то же самое, однако, при тестировании других серотипов ботулинического токсина (например BoNT / B, E, и F) с соответствующими Matrix анализ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

FM Даннинг, ТМ Пьяцца, Ф. Zeytin, и туалет Такер являются сотрудниками или владельцы BioSentinel Инк BioSentinel в настоящее время производит и освоен некоторые из реагентов, представленных в данном отчете.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить H. Olivares и Д. Руге за ценные обсуждения и консультации. Это исследование было поддержано частично за счет премии NSF SBIR (МИП-1127245 в BioSentinel Инк) и Министерства обороны контракта (W81XWH-07-2-0045 в BioSentinel Inc.)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection KitBioSentinelA1015Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate readerThermo Fisher Scientific5250040Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation PlateV&P ScientificVP771HOther magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate WasherBioTekELx405 VSRMOptional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
MicrocentrifugeOptional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixerEppendorf22674200
Orbital ShakerUsed at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor TabletsRoche4693132001Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/AMetabiologicsOptional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well PlatesNUNC237105Plates should not be treated
96-well Plate Sealing TapeThermo Fisher Scientific15036

Ссылки

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). , (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. , (2003).
  36. Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. , (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. , (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O'Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience85BoTestClostridium

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены