Isolamento e Quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os BoTest Matrix Ensaios

Resumo

A neurotoxina botulínica BoTest Matrix (BoNT) ensaios de detecção de purificar e quantificar rapidamente BoNT a partir de uma variedade de matrizes de amostra. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de BoNT a partir de matrizes sólidos e líquidos e demonstrar o ensaio com BOTOX, tomate e leite.

Resumo

Detecção e quantificação de neurotoxina botulínica (TB) em matrizes complexas exacta é necessário para produtos farmacêuticos, ambientais e de teste da amostra de alimento. É necessário o teste rápido BoNT de alimentos durante surto forense, o diagnóstico do paciente e testes de segurança de alimentos, enquanto for necessário os testes de potência exata para fabricação de produtos à base de drogas BoNT e segurança do paciente. O bioensaio amplamente utilizado para testes de BoNT é altamente sensível, mas não tem a precisão e rendimento necessário para o teste rápido e rotineiro BoNT. Além disso, o uso do bio-ensaio de animais resultou em apelos de autoridades reguladoras de produtos de drogas e defensores dos direitos dos animais em os EUA e no exterior para substituir o bioensaio em ratos para testar BoNT. Vários ensaios in vitro de substituição têm sido desenvolvidos que funcionam bem com BoNT purificada em tampões simples, mas a maior parte não tem sido mostrado para ser aplicável a ensaios em matrizes altamente complexas. Aqui, um protocolo para a detecção deBoNT em matrizes complexas utilizando os BoTest Matrix ensaios é apresentado. O ensaio consiste em três partes: A primeira parte envolve a preparação das amostras para teste, a segunda parte é um passo de imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-BoNT esferas paramagnéticas revestidas de anti-corpo para purificar BoNT a partir da matriz, e a terceira parte quantifica proteolítica da BoNT isolado atividade usando um repórter fluorogênico. O protocolo é escrito para o teste de alto rendimento em placas de 96 poços utilizando matrizes tanto de líquidos e sólidos e requer cerca de 2 hr da preparação manual com tempos totais de doseamento de 4-26 horas, dependendo do tipo de amostra, carga de toxinas, e sensibilidade desejada. Os dados são apresentados para BoNT / D teste com solução salina tamponada com fosfato, um medicamento, o sobrenadante de cultura, de 2% de leite, e os tomates frescos e inclui a discussão de parâmetros críticos para o sucesso do ensaio.

Introdução

Neurotoxinas botulínicas (BoNTs) são as substâncias mais letais conhecidos, com doses letais humanos intravenosos estimadas em 1-3 ng / kg ^1,2. Sete serotipos estruturalmente semelhantes de BoNT, rotulados de A a G, existem, cada um constituído por um domínio de cadeia pesada responsável pela ligação à célula, a absorção e a translocação para o citosol e uma cadeia leve que codifica uma endopeptidase de zinco ^3-5. A toxicidade requintado de BoNT resulta, em parte, a sua entrada obrigatória e específica para os neurônios motores na junção neuromuscular ^6. Uma vez dentro do neurônio, a endopeptidase cadeia leve cliva especificamente um ou mais do-N-sensível etilmaleimida receptor solúvel da proteína fator de fixação (SNARE) proteínas necessárias para a fusão das vesículas, inibindo a liberação de neurotransmissores e levando a paralisia flácida ^7-14. Vulgarmente conhecida como a doença "botulismo", paralisia do diafragma e músculos intercostais por BoNT finalmente, resulta eminsuficiência respiratória e morte, a menos que o diagnóstico precoce eo tratamento são recebidos.

Transmitidas por alimentos Humano botulismo é mais comumente associado com BoNT sorotipos A, B, E e F (BoNT / A, BoNT / B, etc) e, geralmente, resulta da ingestão de alimentos contaminados ^15,16, embora, vários casos de botulismo de feridas foram relatados entre os usuários de drogas injetáveis ^​​17,18. Nos Estados Unidos, o botulismo infantil resultante da ingestão de esporos de Clostridium por crianças com menos de um ano de idade é a forma mais comum de botulismo ^19-21. No entanto, de origem alimentar surtos BoNT resultantes de conservas casa imprópria e processamento de alimentos foram relatados, tanto nos Estados Unidos e no exterior. Entre 2000-2009, pelo menos 338 casos de botulismo alimentar foram relatados em todo o mundo, incluindo seis mortes ^22. A capacidade de detectar com rapidez e sensibilidade surtos de botulismo de origem alimentar é uma indicação importante que pode auxiliar no diagnóstico precoce ^23,24. Além disso, os métodos de detecção que permitem que o custo-benefício e análise de alimentos de rotina vai levar à melhoria da segurança alimentar.

Especificidade neuronal do BoNT e longa meia-vida biológica, também faz com que seja um agente terapêutico potente. Nos Estados Unidos, as drogas à base de BoNT são aprovados pela Food and Drug Administration para o tratamento de condições de cosméticos e perturbações relacionadas com neuromusculares incluindo linhas glabelares, distonia cervical, enxaqueca, bexiga hiperactiva, e estrabismo. Inúmeras aplicações "off-label" são documentados, incluindo tratamentos com altas doses para a disfunção muscular grave ^25-28. Accurate quantificação de toxina é fundamental para o doseamento correcto, como subdoses podem conduzir a um tratamento ineficaz, enquanto sobredosagem coloca os doentes em risco de efeitos secundários potencialmente prejudiciais. Infelizmente, nenhum protocolo de teste de potência padronizada é compartilhada entre fabricantes, resultando em desigualdades definição unidade entre produtores de drogas baseado em BoNTcts ^29-31.

O teste padrão para BoNT é o bioensaio em que BoNT contendo amostras são injetadas por via intraperitoneal em camundongos e os números de óbitos registrados mais de 1-7 dias ^16,32,33. O bioensaio é muito sensível com limites de detecção (LOD) de 5-10 pg BoNT / A ^34, no entanto, as preocupações éticas sobre o uso de animais, o alto custo de treinamento de pessoal e manutenção de instalações de animais, longos tempos de ensaio, bem como a falta de protocolos padronizados resultou em chamadas para desenvolver padronizado, livre de animal testes BoNT e métodos de quantificação ^35-39. Recentemente, vários métodos alternativos de quantificação BoNT foram desenvolvidos que oferecem mouse ou quase-rato sensibilidade bioensaio ^40-49. Esses métodos geralmente usam de fluorescência, espectrometria de massa, ou métodos imunológicos e oferecer tempos de ensaio consideravelmente mais curto que o bioensaio em ratos sem uso de animais. Espectrometria de massa combinada com abordagens techniq imunológicaues foram mostrados para detectar e quantificar BoNT contida nos alimentos e outras amostras complexas, no entanto, os requisitos de formação de pessoal e equipamento especializado limite Estes ensaios ^50-55. A maioria dos outros ensaios alternativos não são facilmente aplicáveis ​​a testes de amostras complexas ou não têm o rendimento necessário para o teste BoNT rotina. A natureza altamente variável de viscosidade da amostra de alimento, pH, teor de sal, e constituintes da matriz apresenta um desafio especialmente difícil quando tentando desenvolver métodos in vitro de ensaio com sensibilidade para combinar a potência extrema de BoNT. Além disso, mesmo sistemas de tampão simples e relativamente benignas, tais como os que resultam da libertação de medicamentos à base de BoNT, conter sal, albumina, e estabilizadores de açúcar (isto é, excipientes) que ter um impacto significativo na potência in vitro de BoNT ^56. Purificação Toxina é necessário para testes atividade precisa de todos, mas a mais simples das amostras ^56-59.

OBoTest ensaios Matrix foram projetados para rápida, de alta taxa de transferência, e quantificação consistente de BoNT a partir de amostras de alta complexidade, utilizando equipamentos comumente encontrados em laboratórios de pesquisa ^56,60. Estes ensaios use esferas paramagnéticas covalentemente ligadas a anticorpos anti-BoNT sorotipo-específicos para ligar e seqüestrar BoNT de uma amostra e, em seguida, remover a interferir compostos de matriz por lavagem. Após a lavagem, a atividade proteolítica limite BoNT é então quantificada em um tampão de reação otimizada usando um repórter compatível com o sorotipo BoNT sendo testado. Estes repórteres são proteínas f luorogénicos que consistem de uma proteína fluorescente ciano N-terminal (PCP) e uma porção proteína fluorescente amarela derivado do C-terminal (Vénus) radical ligado por um substrato de BoNT, os resíduos 141-206 ou os resíduos de SNAP25 sinaptobrevina 33-94 constituindo o BoTest A / E ou B / D / F repórteres / g, respectivamente ^45. Repórter clivagem por BoNT é monitorado usando Förster transferência de energia por ressonância (FRET). Quando tO repórter está intacta, excitação do PCP resulta em FRET a Vênus, extinguindo PCP emissão e emissão Vênus emocionante. A clivagem do repórter por BoNT impede FRET, levando a um aumento na emissão de PCP e diminuição da emissão de Vénus. Actividade de BoNT pode então ser medida quantitativamente usando a razão das emissões PCP e Vénus. LOD inferior a 3 pg são possíveis a partir de uma vasta gama de alimentos, utilizando um formato de placa de 96 poços de alto rendimento ^56. O aumento de sensibilidade pode ser obtido usando os volumes de amostra maiores uma vez que o ensaio permite a concentração de toxina na superfície do grânulo.

Os ensaios Matrix BoTest para BoNTs A, B, E, e F foram desenvolvidos e testados com alimentos, produtos farmacêuticos e amostras ambientais ^56,60. Aqui, nós descrevemos processos para a execução destes ensaios para a detecção de BoNT em baixa complexidade (por exemplo, produtos farmacêuticos, BoNT em tampão) e alta complexidade (por exemplo, alimentos, ambiental) amostras. Métodos de processamento específicospara vários tipos de amostras são abordadas neste protocolo e tipos de amostras não descritos aqui geralmente pode ser adaptado usando uma combinação dos métodos apresentados. O protocolo foi desenvolvido e testado com BoNT / A, mas pode ser adaptado para outros serótipos de BoNT utilizando os seus respectivos ensaios, como demonstrado em outros lugares ^56,60.

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Protocolo

1. Preparação de ensaio Reagentes

1. Thaw ditiotreitol 200x (DTT), 10x Matrix Binding Buffer (10x Binding seguir buffer), 10x tampão de neutralização (apenas alimentos ou de pH amostras desequilibradas) e 10x tampão de reação BoTest (doravante 10x Reaction buffer) à temperatura ambiente (RT) por 15 min ou até que esteja completamente descongelado. Ver Tabela 1 para uma lista de buffers e dos reagentes utilizados neste protocolo. Ver Tabela 2 para uma lista de materiais e equipamentos necessários para esse protocolo.
2. Agitar no vortex os buffers descongelados para 5 segundos para misturar. 10x tampão de neutralização, 200xDTT, e tampão de reacção 10x deve aparecer claro, enquanto o tampão de ligação 10x terá uma aparência turva. Aquecer o tampão de reacção 10 x durante 5 minutos a 37 ° C e repetir vórtex se apresentar turva seguinte descongelamento.
3. Gerar 3,8 ml de tampão de reacção 1x.
   1. Rotular um "tampão de reação 1x" 15 ml cônico tubo e adicionar 3,42 ml de biologia molecular grau water, tampão de reação de 380 mL de 10x, e 19 mL de 200x TDT. Misturar tampão bem por inversão.
   2. Inibidores de cortar um único inibidor da protease livre de EDTA comprimido em quadrantes, usando uma lâmina limpa e adicionar um quarto do comprimido para o tampão de reacção 1x (a parte restante comprimido pode ser armazenado a 4 ° C para uso posterior). NB protease não pode ser necessário se usar a toxina purificada e buffers simples (por exemplo, amostras farmacêuticas).
   3. Vortex o tampão de reacção 1x até que o comprimido de protease é totalmente dissolvido.
4. Aquecer os grânulos da matriz A (esferas de IP-A seguir) durante 20 min a RT.
5. Descongelar o repórter BoTest A / E (A / E repórter a seguir) a TA protegido da luz.
6. Rotular um tubo de 15 ml "0,5 mM A / E repórter" e adicionar 45 mL de 20 mM estoque A / E repórter ml de tampão de reação 1,8 1x. Misturar bem por pipetagem e armazenar em gelo ao abrigo da luz.

2. Suporteard Geração Curve Amostra

A curva padrão descrito aqui abrange 10-30,000 MLD ₅₀ / g de alimento ou por ml de tampão em diluições semi-log (Tabela 3). O usuário final é livre para usar concentrações alternadas conforme aplicável.

1. Spiking e incubando as matrizes com o material de referência. Gerar a curva padrão, utilizando um diluente da mesma matriz que a desconhecida, se possível, para reduzir os efeitos da matriz. Utilize tampão de fosfato de gelatina (GPB) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) como diluente, se matriz adicional, BoNT-negativa não está disponível (por exemplo, campo ou o teste da amostra de BoNT surto). Gerar a curva padrão por cravação de BoNT / A para a matriz de escolha apropriada seguindo o protocolo abaixo.
   1. Amostras de baixa complexidade (por exemplo, PBS, GPB, ou farmacêutico)
      1. Adicionar 10 ml da solução tampão apropriada a um tubo de 15 ml e de lado. Este exemplo vai ser utilizada como diluente para a standard curva e diluições desconhecidos (Seção 4).
      2. Adicionar 1,2 ml de tampão a um tubo de microcentrífuga.
      3. ATENÇÃO: Esta etapa usa BoNT e extremo cuidado deve ser usado no manuseio e eliminação de quaisquer reagentes e materiais que entram em contacto com a toxina. O uso de equipamentos de proteção individual e destinação adequada de todos os materiais devem ser realizadas de acordo com o Departamento de Trabalho diretrizes da OSHA para BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) dos EUA. Adicionar BoNT / A para a 1,2 ml da amostra de tal modo que a concentração final é de 30.000 MLD ₅₀ / ml (36.000 MLD ₅₀ no total).
   2. Amostras de alimentos líquidos (ou outras amostras líquidas complexos) Nota: O teste inicial é recomendado para determinar o volume de sobrenadante recuperado a partir de amostras clarificadas como o material particulado (. Celulose, por exemplo) em matrizes líquidas irá variar. Este protocolo assume pelo menos 1,2 ml de sobrenadante clarificado será recuperado a partir de um samp 1,4 mlle. Aumentar tamanho da amostra, se necessário.
      1. Adicionar 10 ml do alimento líquido para um tubo cônico de 15 ml e reserve. Esta amostra será utilizado como diluente para a curva padrão e diluições desconhecidos (Seção 4).
      2. Pesar um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml vazio e gravar sua massa.
      3. Adicionar 1.4 ml do produto alimentar líquido para o tubo de microcentrífuga pesado.
      4. Pesar de novo o tubo de microcentrífuga e calcular a massa da amostra de alimento adicionado, subtraindo a massa do tubo vazio.
      5. ATENÇÃO: Esta etapa usa BoNT e extremo cuidado deve ser usado no manuseio e eliminação de quaisquer reagentes e materiais que entram em contacto com a toxina. O uso de equipamentos de proteção individual e destinação adequada de todos os materiais devem ser realizadas de acordo com o Departamento de Trabalho diretrizes da OSHA para BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) dos EUA. Adicionar BoNT / A para a amostra de 1,4 ml a uma concentração final de 30.000 MLD ₅₀ / g de alimento.
      6. Incubaçãote o diluente e amostras à TA ou a 4 ° C durante 2 horas para se obter o tempo de BoNT para interagir com a matriz do alimento, imitando uma contaminação natural.
   3. As amostras sólidas de alimentos (ou outras amostras sólidas) Nota: O teste inicial é recomendado para determinar o volume de sobrenadante recuperado a partir de amostras homogeneizadas e esclarecidas após a adição de 1 ml GPB / g de alimentos. Este protocolo pressupõe que, pelo menos, 1,2 ml de sobrenadante clarificado será recuperada a partir de uma amostra de 2 g. Aumentar tamanho da amostra, se necessário.
      1. Pesar 10 g de amostra sólida em um tubo cônico de 50 ml e reserve. Isto será utilizado como diluente.
      2. Pesar 2 g sólida amostra de alimento em um segundo tubo cônico de 50 ml.
      3. ATENÇÃO: Esta etapa usa BoNT e extremo cuidado deve ser usado no manuseio e eliminação de quaisquer reagentes e materiais que entram em contacto com a toxina. O uso de equipamentos de proteção individual e destinação adequada de todo o materials deve ser realizada de acordo com o Departamento de Trabalho diretrizes da OSHA para BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) dos EUA. Adicionar BoNT / A para a superfície da amostra de 2 g a uma concentração final de 30.000 MLD ₅₀ / g de alimento (60.000 MLD total de _50).
      4. Incubar o diluente e amostras misturadas à TA ou a 4 ° C durante 2 horas para se obter o tempo de BoNT para interagir com a matriz do alimento, imitando uma contaminação natural.
2. Ajuste de homogeneização da amostra e tampão. Processar a amostra curva padrão cravado e diluente gerado acima de acordo com o tipo de amostra.
   1. Amostras de baixa complexidade
      1. Sem posterior processamento da amostra é necessário.
   2. Amostras de alimentos líquidos (ou outras amostras líquidas complexas)
      1. Nenhuma amostra de homogeneização é necessário.
      2. Adicionar 140 mL de buffer 10x Neutralização de 1,4 ml cravado amostra e 1 ml de 10x Neutralizatiões de tampão à amostra de 10 ml de diluente. Misture bem as amostras por inversão.
      3. Pouco esclarecer ambas as amostras por centrifugação durante 10 min a 6.000 x g e 4 ° C. Remover imediatamente o sobrenadante e transferir para novos tubos.
   3. Amostras de alimentos sólidos (ou outras amostras sólidas)
      1. Adicionar 2 ml GPB (1 ml GPB / g de alimentos) para a 2 g BoNT / cravado-A amostra de alimentos sólidos e 10 ml GPB a 10 g de amostra diluente.
      2. Homogeneizar as amostras usando um pilão até ficar bem misturado. Dependendo da natureza da amostra, pode haver pequenas porções de material que não pode ser homogeneizadas, o que é aceitável. Alternativamente, podem ser utilizados métodos de homogeneização mecânica. Utilização de um misturador não é recomendada, uma vez que podem inactivar bem como nebulizar a toxina.
      3. Adicionar o volume 1/10th de 10x tampão de neutralização para o diluente de amostra com base no volume total aproximada (por exemplo, 2 ml, se o volume a 20 ml). Extrapolaro volume total da BoNT / cravado-se uma amostra e adicionar o volume 1/10th de 10x tampão de neutralização. Misture bem as amostras por inversão.
      4. Pouco esclarecer ambas as amostras por centrifugação durante 10 min a 6.000 x g e 4 ° C. Remover imediatamente o sobrenadante e transferir para novos tubos.
3. Preparar diluições em série da curva padrão para o teste
   1. Usando a BoNT / cravado-se uma amostra da curva padrão como D1 e a amostra nonspiked como diluente, gerar as restantes amostras da curva padrão em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga de acordo com a Tabela 3.

3. Prepare amostras desconhecidas

Esta seção pode ser concluída em paralelo com a secção 2.

1. Determinar o número de incógnitas e diluições. Teste incógnitas em triplicado, se possível.
   1. Para ensaios qualitativos, execute as incógnitas sem qualquer diluição adicional do que o necessário para processar a amostra como descricama abaixo.
   2. Para os ensaios quantitativos, preparam-se pelo menos duas amostras de diluição 1:10, tal como descrito abaixo, para assegurar que um ou mais amostras de cair dentro do intervalo linear da resposta do ensaio. Gerar diluições usando um diluente da mesma matriz que a desconhecida, se possível, para reduzir os efeitos da matriz, tal como descrito na Seção 3. Caso contrário, usam PBS ou GPB como o diluente.
2. Gerando e diluindo amostras desconhecidas acordo com o tipo de amostra.
   1. Incógnitas baixa complexidade (por exemplo, PBS, GPB, ou farmacêutico)
      1. Adicionar pelo menos 750 mL desconhecidos para um tubo de microcentrífuga para gerar diluição Desconhecido 1.
      2. Adicionar 675 ul de diluente para dois tubos de microcentrífuga rotulados diluição Desconhecido 2 e 3. O diluente será o mesmo material usado para a geração da curva padrão.
      3. Diluir em série de diluição 1 transferindo 75 ul de diluição de 1 para dentro do tubo de diluição 2 e misturar.
      4. Serially dilute diluição 2, transferindo 75 ul de diluição de 2 para o tubo de diluição de 3 e misturar.
   2. Incógnitas alimentos líquidos (ou outras amostras líquidas complexas) Nota: O teste inicial é recomendado para determinar o volume de sobrenadante recuperado a partir de amostras esclarecidas, como discutido na Seção 3. Aumentar tamanho da amostra, se necessário.
      1. Adicionar ≥ 875 ul do desconhecido líquido para um tubo de microcentrífuga.
      2. Adicionar volume de 1/10th de 10x tampão de neutralização para a amostra (por exemplo, 87,5 mL de uma amostra de 875 mL).
      3. Pouco clarificar a amostra através de centrifugação durante 10 min a 6.000 x g e 4 ° C. Imediatamente transferir o sobrenadante para um novo tubo. Esta é a diluição Desconhecido 1.
      4. Adicionar 675 ul de diluente para dois tubos etiquetados diluição Desconhecido 2 e 3. O diluente será o mesmo material usado para a geração processado curva padrão.
      5. Diluir em série diluição de 1 por transferênciaanel 75 ul de diluição de 1 para o tubo 2 a diluição e mistura.
      6. Diluir em série de diluição 2, transferindo 75 ul de diluição de 2 para o tubo de diluição de 3 e misturar.
   3. Incógnitas sólidos alimentares (ou outras amostras sólidas) Nota: O teste inicial é recomendado para determinar o volume de sobrenadante recuperado a partir de amostras esclarecidas, como discutido na Seção 3. Aumentar tamanho da amostra, se necessário.
      1. Pesar 2 g sólida desconhecido amostra em um tubo cônico de 50 ml.
      2. Adicionar 2 ml de GPB (1 ml GPB / g de alimento) a 2 g da amostra sólida.
      3. Homogeneizar as amostras conforme descrito na Seção 3.2.3.2.
      4. Adicionar o volume 1/10th de 10x tampão de neutralização para a amostra baseada no volume total aproximada (por exemplo, 0,4 ml, se o volume é de 4 ml). Misture bem as amostras por inversão.
      5. Pouco clarificar a amostra através de centrifugação durante 10 min a 6.000 x g e 4 ° C. Immediateltransferência y ≥ 750 ul de sobrenadante para um tubo de microcentrífuga. Esta é a diluição Desconhecido 1.
      6. Adicionar 675 ml de diluente para dois tubos etiquetados diluição Desconhecido 2 e 3. O diluente será o mesmo material usado para a geração processado curva padrão.
      7. Diluir em série de diluição 1 transferindo 75 ul de diluição de 1 para dentro do tubo de diluição 2 e misturar.
      8. Diluir em série de diluição 2, transferindo 75 ul de diluição de 2 para o tubo de diluição de 3 e misturar.

4. Esclarecimento amostra final

Se o teste de amostras de alimentos líquidos ou sólidos, centrifugar todas as amostras durante 5 min a ≥ 14.000 xg numa microcentrífuga para esclarecer completamente as amostras. Remover imediatamente o sobrenadante e transferir para novos tubos.

5. Configuração Placa e BoNT / A Pull Down

1. O layout da placa específica é dependente de aplicação, no entanto, não use os poços fora de formapara evitar efeitos de borda. Cada amostra desconhecida e da amostra curva padrão D1-D8 requer 3 poços, enquanto amostra D9 requer 6 poços. A disposição da placa sugerida é mostrada na Figura 1.
2. Adicionar 20 ul de tampão de ligação 10x a cada cavidade a ser usada.
3. Adicionar 200 mL de cada diluição esclarecidas e desconhecido para cada um dos três poços (seis poços para D9) para testes triplicado. Misture a placa durante 10 segundos num misturador de microplacas.
4. Adicionar os grânulos de IP-A.
   1. Vortex as contas IP-A para 10 seg na velocidade mais alta. Continuar vórtex se contas não são totalmente ressuspenso e homogênea.
   2. Pipetar 20 ul grânulos IP-A a cada amostra.
   3. Misture a placa durante 30 segundos num misturador de microplacas.
5. Incubar a placa utilizando uma placa incubadora rotativa durante 2 horas a 750 rpm, 25 ° C ou TA. O desempenho do ensaio é altamente dependente de gerar e manter o IP-A suspensão de esferas durante todas as etapas de incubação. Grânulos sempre ressuspender com um Microfonesmisturador de tarde após a peletização ea manter a suspensão utilizando uma placa de microtitulação shaker orbital durante todas as etapas de incubação.

6. Lavar prato e Bead ressuspensão

1. Lavar as placas à mão ou usando um cordão compatível com placa magnética automatizado lavadora. Um lavador de placas automático configurado para esferas magnéticas aumenta muito ensaio rendimento.
   1. Lavagem manual
      1. Rotular um tubo de 50 ml "tampão de lavagem 1X" e adicione 45 ml de biologia molecular da água grau e 5 ml 10x Matrix Wash Buffer. Misturar tampão bem por inversão.
      2. Remova a placa da placa rotativa incubadora.
      3. Colocar imediatamente o prato sobre uma placa de separação 96 bem grânulo magnético durante 5 min.
      4. Mantendo a placa sobre a placa de separação magnética talão 96 cavidades, suavemente remover e descartar os sobrenadantes dos poços de amostra, utilizando uma pipeta multi-canal único ou. Não aspiraresferas de monitorar visualmente o buffer aspirado na ponta da pipeta para a remoção acidental de contas. Se a remoção é testemunhado, adicione delicadamente o conteúdo da ponta de volta para o bem, reseparate, e repetir a remoção.
      5. Adicionar 300 mL de buffer 1x de lavagem a cada amostra.
      6. Totalmente ressuspender as esferas através da mistura da placa durante 30 segundos num misturador de microplacas.
      7. Incubar a placa sobre a placa de separação 96 bem esfera magnética durante 2 min.
      8. Remover e descartar os sobrenadantes dos poços de amostra, tal como antes.
      9. Repita os passos 6.1.1.5-6.1.1.8 mais três vezes, para um total de quatro lavagens.
      10. Com a placa sobre a placa de separação 96 bem esférulas magnéticas, inspeccionar visualmente os poços para confirmar ainda a remoção do sobrenadante, utilizar uma pipeta para remover o excesso de tampão residual, conforme necessário. Alguns tampão irá permanecer nos poços e deve ser tomado cuidado para evitar a remoção do grânulo ou secagem do grânulo.
      11. Adicionar tampão de reacção 50 ul de 1x em cada poço de amostra e misturar a placa de 30 sic num agitador de microplacas para ressuspender completamente os grânulos. Se necessário, utilizar uma pipeta para ressuspender completamente os grânulos.
   2. Lavar placa automatizada
      1. Configuração e programa a máquina de lavar de acordo com a Tabela 4. Limpe e lave a máquina de lavar com alta qualidade (por exemplo, nanopura) de água.
      2. Primeiro a máquina de lavar, executando o programa "Prime".
      3. Remova a placa da placa rotativa incubadora.
      4. Colocar imediatamente a placa sobre a placa de separação 96 bem esfera magnética sobre a placa de máquina de lavar.
      5. Execute o programa link "Mestre Wash". O primeiro passo do programa é um passo de incubação de 5 min em que a máquina de lavar estiver parado.
      6. Após a conclusão do programa, remover o prato da máquina de lavar, adiciona 1X tampão de reação de 50 jil de cada poço de amostra, e misturar a placa durante 30 segundos num misturador de microplacas para ressuspender completamente os grânulos. Se necessário, utilizar uma pipeta para ressuspender completamente os grânulos.

7. Ensaio Iniciação e Incubação

1. Adicionar 50 ul de 0,5 uM A / E repórter (ver ponto 1) a cada poço de amostra e mistura-se durante 30 segundos num misturador de microplacas para ressuspender completamente os grânulos.
2. Adicionar 100 mL de água em cada poço não utilizado na placa para evitar efeitos de borda.
3. Selar a placa com fita de selagem da placa e incubar a placa utilizando uma placa incubador rotativo a 750 rpm, 25 ° C ou TA. Proteja a placa da luz durante a incubação.

8. Coleta e Análise de Dados

Nota: Este ensaio é um ensaio em tempo real que pode ser medida várias vezes até que a sensibilidade desejada é obtida, não existem reagentes de paragem necessários. Tempos de leitura iniciais recomendados são 2, 4, e 24 horas de tempo de incubação, com a sensibilidade do ensaio com o aumento do tempo de incubação.

1. A coleta de dados
   1. Em cada tempo ler, retire a placa da placa rotativa incubadora, retire o seloção de fita, e colocar imediatamente a placa sobre a placa de separação 96 bem esfera magnética. Permitir que as esferas se separar durante 2 min.
   2. Coloque a placa no leitor de microplacas e medir as emissões em ~ 470 e ~ 526 nm sob excitação em ~ 434 nm.
   3. Se os tempos de leitura adicionais são desejados, ressuspender as contas por 30 segundos no mixer de microplacas, selar a placa, e retornar a placa para a placa rotativa incubadora.
2. A análise dos dados
   1. Calcula-se a razão de emissão para cada amostra dividindo a unidade de fluorescência relativa valor (RFU) a 526 nm, pelo valor RFU a 470 nm.
   2. Traçar a taxa de emissão versus o log [BoNT / A] para os pontos de dados padrão de curva. Dependendo do substrato de BoNT / A potência testado, uma curva dose-resposta sigmoidal serão obtidos (ver resultados representativos).
   3. Coloque os dados da curva padrão, com inclinação da curva dose-resposta variável Y = inferior + (superior-inferior) / (1 ​​+ 10 ^ ((LogEc _50-X) * hillslope)) onde X é alogaritmo da concentração, Y é a resposta, e Y começa na parte inferior e vai ao topo com uma forma sigmoidal.
   4. Determinar os limites de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), e concentração eficaz semi-máxima _(EC50). Os limites de detecção são definidos como uma amostra que tem uma relação de emissão inferior a 3 desvios-padrão (SDS) abaixo dos controlos em branco (n = 6). Limites de quantificação são definidos como uma amostra que tem uma relação de emissão inferior a 10 SDs abaixo dos controlos em branco (n = 6). CE ₅₀ é determinada a partir da sigmoidal de dose-resposta de ajuste de curva.
   5. Interpolar a potência de quaisquer amostras desconhecidas contra a curva padrão de dose-resposta sigmoidal.
      1. Para obter resultados quantitativos, na amostra desconhecida, devem, idealmente, cai dentro da porção linear da curva padrão. Aproximado a porção linear da curva padrão calcular a janela de resposta total de ensaio a 20-80% (por exemplo, se a taxa de emissão da curva padrão de ranges 0,5-2,5, o intervalo linear seria a porção linear da curva padrão que varia 0,9-2,1).
      2. Para obter resultados qualitativos, comparar a amostra desconhecida com o LOD e LOQ da curva padrão.
      3. Não extrapolar amostras desconhecidas para além dos limites da curva padrão.

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Resultados

Um diagrama que resume as etapas do protocolo descrito é mostrado na Figura 2. O ensaio requer entre 4-26 horas para ser concluído, dependendo do tipo de amostra e sensibilidade do ensaio desejado, mas apenas ~ 2 horas de hands-on do tempo. O ensaio é realizado em placas de 96 poços e, dependendo do tipo de teste a ser realizado, permite o teste em triplicado de uma amostra de 20, incluindo as normas por placa.

A Figura 3 mostra os resultados do ensaio u...

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Discussão

Este protocolo descreve procedimentos para a quantificação de BoNT / A complexa, holotoxina, Clostridium ou de sobrenadante de cultura em matrizes complexas. O protocolo é o mesmo, no entanto, ao testar outros serotipos BoNT (por exemplo, de BoNT / B, E e F), com os seus respectivos ensaios de matriz ^56,60, embora a sensibilidade do ensaio irá variar entre os serotipos e ensaios. Este protocolo não conta para cada tipo de amostra possível e algumas modificações que podem ser necessá...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo Fisher Scientific	5250040	Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge			Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker			Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A	Metabiologics		Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates	NUNC	237105	Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Fisher Scientific	15036