Las nanofibras ECM proteínas y Uso Asamblea Superficie iniciadas Nanoestructuras Engineered

Resumen

Un método para obtener nanofibras y nanoestructuras complejas de proteínas de la matriz extracelular individuales o múltiples se describe. Este método utiliza las interacciones proteína-superficie para la creación de materiales a base de proteínas exentas con la composición sintonizable y la arquitectura para el uso en una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.

Resumen

La matriz extracelular (ECM) en los tejidos se sintetiza y ensambla por las células para formar un fibrilar 3D, la red de proteínas con estrictamente regulados diámetro de la fibra, la composición y la organización. Además de proporcionar soporte estructural, las propiedades físicas y químicas de la ECM desempeñan un papel importante en varios procesos celulares que incluyen la adhesión, diferenciación y apoptosis. In vivo, el ECM se ensambla mediante la exposición de críptico de auto-ensamblaje (fibrilogénesis) sitios dentro de las proteínas . Este proceso varía para diferentes proteínas, pero la fibronectina (FN) fibrilogénesis es bien caracterizado y sirve como un sistema modelo para el montaje de ECM mediada por células. Específicamente, las células utilizan receptores de la integrina en la membrana celular para unirse dímeros FN y las fuerzas contráctiles de actomiosina-generada para desplegar y exponer sitios de unión para el montaje en fibras insolubles. Este proceso mediado por receptor permite que las células de montar y organizar el ECM desde el celular al tejido scales. A continuación, presentamos un conjunto iniciado por superficie método denominado (SIA), que recapitula el montaje matriz mediada por células mediante interacciones proteína-superficie para desplegar proteínas ECM y ensamblarlos en fibras insolubles. En primer lugar, las proteínas ECM se adsorben sobre un polidimetilsiloxano (PDMS) hidrófobo superficie donde se desnaturalizan parcialmente (desplegar) y exponen dominios de unión crípticos. Las proteínas no plegadas se transfieren luego en bien definidos micro y nanopatterns través de la impresión microcontacto sobre un poli térmicamente sensible (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superficie. Disolución térmicamente activado de la PIPAAm conduce hasta el montaje final y la liberación de nanofibras de proteínas ECM insolubles y nanoestructuras con geometrías bien definidas. Arquitecturas complejas son posibles por los patrones de ingeniería se define en los sellos PDMS utilizados para la impresión por microcontacto. Además de FN, el proceso de SIA se puede utilizar con la laminina, fibrinógeno y colágenos de tipo I y IV a crear nanoestructuras ECM de componentes múltiplesturas. Por lo tanto, SIA se puede utilizar para diseñar materiales a base de proteínas de ECM con un control preciso sobre la composición de proteínas, la geometría de la fibra y la arquitectura andamio con el fin de recapitular la estructura y la composición de la MEC in vivo.

Introducción

La matriz extracelular (ECM) en los tejidos se compone de proteínas multifuncionales implicadas en la regulación física y química de múltiples procesos celulares, incluyendo la adhesión, la proliferación, la diferenciación, la apoptosis y ^1-3. El ECM está sintetizado, ensamblado, y organizada por las células y las fibrillas de proteínas constituyentes tienen composiciones únicas, tamaño de la fibra, geometrías y arquitecturas interconectadas que varían con el tipo de tejido y la etapa de desarrollo. Trabajos recientes han demostrado que el ECM puede proporcionar señales instructivas para guiar a las células para formar tejidos de ingeniería ^4, lo que sugiere que la recapitulación de la ECM en términos de composición y estructura podría permitir el desarrollo de materiales biomiméticos para aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.

Un número de métodos de fabricación se han desarrollado para diseñar andamios poliméricos que pueden imitar aspectos de la ECM en los tejidos. Por ejemplo, electrospinning y separ faseción han demostrado tanto la capacidad para formar matrices porosas de fibras con diámetros que van desde decenas de micrómetros abajo hasta decenas de nanómetros ^5-7. Ambas técnicas han demostrado también que las matrices altamente porosas de nanofibras pueden apoyar la adhesión celular y la infiltración en el armazón ^8. Sin embargo, estos métodos son limitados en las geometrías de fibra, orientaciones y 3D posibles arquitecturas que se pueden crear. Electrospinning produce típicamente andamios con fibras orientadas al azar o ya sea altamente alineados mientras que la separación de fases produce andamios con fibras orientadas al azar. También hay limitaciones en los materiales, con los investigadores típicamente usando polímeros sintéticos, tales como poli (ε-caprolactona) ⁸ y poli (ácido láctico-co-glicólico) ^9, que posteriormente se recubre con proteínas de ECM para promover la adhesión celular. También se utilizan los biopolímeros naturales, incluyendo el colágeno de tipo I ^10, gelatina ^11, fibrinógeno ^12,quitosano ^{13, 14} y seda, pero representan sólo una pequeña parte de las proteínas que se encuentran en el tejido nativo. La mayoría de los tejidos contienen un medio más grande de proteínas ECM y polisacáridos incluyendo la fibronectina (FN), laminina (LN), colágeno tipo IV y ácido hialurónico que son difíciles o imposibles de fabricar nanofibras utilizando métodos existentes.

Para hacer frente a este desafío, hemos centrado nuestros esfuerzos de investigación en la imitación de la forma en las células de sintetizar, reunir y organizar las fibrillas de proteínas ECM en sus alrededores. Mientras que el proceso de fibrilogénesis específica varía para diferentes proteínas ECM, típicamente un cambio conformacional en la molécula de proteína de ECM se activa por un enzimática o la interacción mediada por receptor, que expone sitios de autoensamblaje crípticos. Aquí se utiliza FN como un sistema modelo para comprender mejor el proceso de fibrilogénesis. Brevemente, homodímeros FN se unen a los receptores de integrina en la superficie celular a través de la secuencia de aminoácidos RGD en el décimo tipo IIRepito unidad. Una vez unido, las integrinas se separan a través de la contracción actomiosina y despliegan los dímeros FN para exponer los sitios de autoensamblaje crípticos. La exposición de estos sitios de unión FN FN-permite a los dímeros de FN para montar en un fibrillas insolubles a la derecha en la superficie de la célula ^15. El trabajo en sistemas libres de células se ha demostrado que los sitios crípticos vinculantes FN-FN pueden ser revelados a través de desarrollo usando desnaturalizantes ¹⁶ o la tensión superficial en la interfase aire-líquido-sólido ^17-19. Sin embargo, las fibras FN creados por estas técnicas se limitan a los tamaños y geometrías de fibra específicas y típicamente se une a una superficie.

Aquí se describe un conjunto iniciado por superficie denominado enfoque (SIA) ²⁰ que supera estas limitaciones mediante la utilización de las interacciones proteína-superficie para crear exentas nanofibras insolubles, nanofabrics (planos 2D) y otras nanoestructuras compuestas de proteínas únicas o múltiples de ECM (Figura 1 ). En esta proceso, proteínas ECM se adsorben a partir de una conformación compacta, globular en solución y parcialmente desnaturalizado (desplegado) en una, polidimetilsiloxano (PDMS) hidrófobo el sello estampado. Las proteínas ECM se transfieren entonces en este estado en un poli térmicamente sensible (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superficie a través de la impresión por microcontacto ^22. Cuando se hidrata con 40 ° C el agua la PIPAAm sigue siendo un sólido, pero cuando se enfría a 32 ° C que pasa a través de una temperatura de solución crítica inferior (LCST) donde se convierte en hidrófila, se hincha con agua y luego se disuelve, la liberación de las nanoestructuras de ECM montados fuera de la superficie. El método SIA proporciona control sobre las dimensiones con precisión a escala nanométrica. Mediante el control de los parámetros clave tales como la composición, la geometría de la fibra, y la arquitectura, es posible recapitular muchas propiedades de la ECM se han encontrado in vivo y para desarrollar andamios avanzados para aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Fabricación de Molde Maestro Usando Fotolitografia

1. Las nanofibras de proteínas ECM, nanofabrics y nanoestructuras para ser fabricados primero se diseñaron utilizando diseño asistido por ordenador (CAD) software. Este archivo CAD se transfiere entonces a una fotomáscara. El tipo de fotomáscara dependerá de la resolución de las características; con una foto máscara basada en la transparencia adecuada para la función de los tamaños de hasta ~ 10 micras. Características más pequeñas <10 micras requerirá un cromo en photomask vidrio. Todas las nanofibras y nanoestructuras presentados aquí fueron fabricados utilizando una fotomáscara a base de la transparencia, y por lo tanto eran a escala nanométrica en espesor pero no dimensiones laterales.
   Nota: Es importante distinguir qué regiones del photomask serán oscuro (evitar que la luz UV para pasar a través) y que será transparente (permite que la luz pase a través de los rayos UV), ya que, junto con el tipo de fotoprotector (positivo o negativo) , dictará la topografía final del molde maestro.
2. Para empezar la fabricación del molde maestro, deshidratar una oblea de 4 "de silicio colocándolo en una placa caliente ajustado a 150 ° C durante 15 min.
3. Centre la oblea en el plato de vacío de un spin-revestidor. Vierta SU8-2015 fotorresistente negativa sobre el centro de la oblea y continuar vertiendo en círculos concéntricos hasta aproximadamente dos tercios de la oblea está cubierto.
   Nota: Mantenga la botella de SU8 cerca de la oblea cuando se vierte a minimizar la formación de burbujas.
4. Programar el spincoater de la siguiente manera:
   • Ciclo de propagación: 500 rpm con una aceleración de 100 rpm / s durante 10 s.
   • El ciclo de centrifugado: 4000 rpm con una aceleración de 100 rpm / s durante 30 seg.
   Nota: Esta receta spincoating formará una capa fotorresistente que es de ~ 10 m de espesor. Al cambiar la velocidad de hilatura o la formulación de SU8, el espesor se puede ajustar.
5. Soft hornear la oblea colocándolo en una placa caliente ajustado a 95 ° C durante 3 min.
6. Exponer la oblea con luz UV a travésla fotomáscara para una dosis total de 140 mJ / cm ^2.
   Nota: SU8 es un fotoprotector negativo, por tanto, las regiones donde la luz UV es capaz de pasar a través de la fotomáscara permanecerán después del revelado y convertido en características planteadas en el molde maestro.
7. Publique exposición hornear la oblea, colocándolo sobre una placa caliente ajustado a 95 ° C durante 4 min.
8. Desarrollar la oblea colocándolo en desarrollador SU8 durante 3 min. Después de 3 minutos, enjuague la oblea con alcohol isopropílico. Si se produce una película en blanco durante el enjuague, la oblea no está completamente desarrollado y debe ser colocado de nuevo en el revelador durante otros 30 seg. Enjuague de nuevo con alcohol isopropílico. Repita este proceso hasta que una película en blanco no se forma durante el enjuague de alcohol isopropílico.
9. Seque la oblea en una corriente de nitrógeno y colocar en una placa de Petri de 150 mm para proteger del polvo.

2. Realización de los Sellos de PDMS

1. Preparar el prepolímero de PDMS mediante la combinación de la base de elastómero y agente de curado en un10:01 relación w / w. Normalmente se utilizan 80 g de base y 8 g de agente de curado para asegurar que no PDMS suficientes para cubrir el molde maestro en una capa de 1 cm de espesor.
2. Mezclar y desgasificar el PDMS utilizando un mezclador centrípeta se establece en lo siguiente:
   • Mezclar: 2000 rpm durante 2 minutos
   • Degas: 2000 rpm durante 2 min.
3. Si no está disponible un mezclador mezclar los PDMS con la mano durante 10 min utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Desgasificar la mezcla mediante la colocación en un desecador de vacío durante 30 min para eliminar las burbujas.
4. Vierta suficiente prepolímero de PDMS sobre el molde maestro (modelado de la oblea de silicio) para formar una capa de 1 cm de espesor. Curar el PDMS por cocción a 65 ° C durante 4 horas o a temperatura ambiente durante 48 h.
5. Una vez curado, Las regiones que contienen los patrones se pueden cortar para formar los sellos PDMS. Para distinguir el lado característica de la parte trasera del sello PDMS, cortar una muesca de una de las esquinas en la parte trasera del sello.

3. Microcontacto PrInting de Patrones de ECM

1. Limpiar cubreobjetos de vidrio de diámetro 25 mm por sonicación en etanol al 95% durante 1 hora y luego se seca en un horno de 65 ° C.
2. Preparar la solución de PIPAAm disolviendo PIPAAm en 1-butanol a una concentración de 10% (w / v, típicamente de 1 g en 10 ml).
3. Centre un cubreobjetos de vidrio en el plato de vacío de los spincoater y de pipeta 200 l de la solución PIPAAm de modo que toda la superficie de vidrio está cubierta.
4. Spincoat el cubreobjetos a 6.000 rpm durante 1 min.
5. Limpiar los sellos PDMS por sonicación en etanol al 50% durante 30 min y luego seco bajo una corriente de nitrógeno.
   Nota: El secado y pasos posteriores deben realizarse en una cabina de bioseguridad para mantener la esterilidad para aplicaciones donde se utilizan las nanoestructuras de ECM con las células.
6. Cubra la superficie estampada de cada PDMS sello con 200 l de la solución de proteína, típicamente 50 mg / ml en agua destilada estéril para FN. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
   Nota: Thes el recubrimiento de volumen es para un sello de PDMS 1,5 cm ² y tendrá que ser ajustada en función del tamaño del sello de PDMS, la proteína de ECM utilizado y de la concentración de la proteína en solución de ECM.
7. Lave los sellos PDMS en agua destilada para eliminar el exceso de proteínas y seque bien bajo una corriente de nitrógeno.
   Nota: Cualquier agua que queda en el sello se activará la disolución prematura de la capa PIPAAm sobre el cubreobjetos y evitar la transferencia de la proteína adecuada.
8. Para la fabricación estéril, colocar el cubreobjetos recubiertos de PIPAAm dentro de una caja de petri cerrada y esterilizar mediante exposición a rayos UV, 45 minutos bajo la luz UV en un gabinete de bioseguridad es suficiente. Si no se requiere esterilidad este paso se puede omitir.
9. Realizar la impresión por microcontacto mediante la colocación de la parte característica de la marca de PDMS en contacto con el cubreobjetos recubiertos de PIPAAm. Si es necesario, el uso de fórceps para golpear ligeramente en la parte posterior de los sellos para eliminar las burbujas de aire y asegurar un contacto uniforme.
10. Después de 5 millasn, retire el sello PDMS del cubreobjetos.
11. En esta etapa, las proteínas ECM adicionales pueden ser modelados para crear estructuras más complejas y de múltiples componentes. Hasta 3 impresiones han sido verificados para trabajar con este proceso, y más pueden ser factibles.

4. Liberación de ECM nanofibras y nanoestructuras

1. Coloque el PIPAAm cubreobjetos recubiertos con dibujos en una placa de Petri de 35 mm e inspeccionar la fidelidad patrón usando microscopía de contraste de fase. Dependiendo del modelo, una cámara CCD puede ser necesario para resolver las características del patrón. La microscopía de fluorescencia también se puede utilizar para inspeccionar el patrón proporcionado las proteínas ECM están etiquetados con fluorescencia.
2. Añadir 3 ml de agua destilada a 40 ° C a la placa de Petri y dejar que el agua poco a poco fresco.
3. La disolución de la capa de PIPAAm y la liberación de los patrones de proteínas de ECM se pueden monitorizar mediante microscopía de contraste de fase. Si la aplicación no permite el uso de tec ópticahniques, la liberación se puede controlar mediante la medición de la temperatura de la solución. Típicamente, el agua se enfría a temperatura ambiente, muy por debajo de la LCST de PIPAAm (32 ° C), para garantizar las nanoestructuras de proteínas ECM han sido puestos en libertad.
4. Después de la liberación, las nanofibras, nanofabrics y otras nanoestructuras están flotando en el agua. Para utilizarlos para otras aplicaciones que necesitan para ser manipulados. El enfoque exacto dependerá del objetivo experimental y puede incluir etapas tales como la inmovilización sobre otra superficie, que se mueve con un sistema micromanipulador o incrustar en un hidrogel.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

SIA es capaz de ECM Ingeniería nanofibras de proteínas con un control preciso sobre dimensiones de la fibra. Para demostrar esto, las matrices de nanofibras FN con dimensiones planas de 50 x 20 m eran iguales en un cubreobjetos PIPAAm recubierto (Figura 2A). Tras la liberación, las fibras contratados porque estaban bajo una pre-tensión inherente al patrón en la superficie PIPAAm (Figura 2B). Análisis de las nanofibras FN reveló que eran monodispersas de pre-liberación con una lo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

El método SIA presenta aquí imita la matriz de montaje mediada por células y permite la ingeniería de nanofibras y nanoestructuras de proteínas ECM con el tamaño sintonizable, organización y composición. Aunque no es idéntica a la ECM de células generadas, SIA crea ECM compuesta de fibrillas de proteína nanoescala ²⁰ que se someten plegable reversible / desplegado durante la tensión mecánica ²¹ y se pueden unir las células ^20. Esto proporciona una capacidad única para cons...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm	Polysciences	21458-10	40,000 Mw
Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)	Dow Corning		Mix 10 parts base with 1 part curing agent.
Butanol
Fibronectin	BD biosciences	354008	Human, 1mg
Laminin	BD biosciences	354239	Ultrapure, mouse, 1mg
Negative Photoresist	Microchem	SU8-2015
SU8 Developer	Microchem
Sonicator Branson M3510	Branson Ultrasonic Corporation	CPN-952-318
Thinky ARE-250 Mixer	Thinky Corporation
Spincoater	Specialty Coating Systems	G3P-8
Glass cover 25mm diameter, No 1.5	Fisher Scientific	12-545-86