Nanofibras ECM proteínas e Nanoestruturas Engineered Usando Assembléia iniciou-Surface

Resumo

Um método para obtenção de nanofibras e nanoestruturas de complexos de proteínas de matriz extracelular simples ou múltiplos é descrito. Este método utiliza as interações proteína de superfície para criar materiais à base de proteínas free-standing com composição sintonizável e arquitetura para o uso em uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia.

Resumo

A matriz extracelular (ECM) dos tecidos é sintetizada e montada pelas células para formar um fibrilar 3D, rede com proteína fortemente regulada diâmetro da fibra, da composição e organização. Além de proporcionar um suporte estrutural, as propriedades físicas e químicas do ECM desempenham um papel importante em vários processos celulares, incluindo adesão, diferenciação e apoptose. In vivo, a ECM é montado expondo críptico automontagem locais (fibrilogênese) dentro de proteínas . Este processo varia para diferentes proteínas, mas a fibronectina (FN) fibrilogênese é bem caracterizado, e serve como um sistema modelo para a montagem de ECM mediada por células. Especificamente, as células utilizam receptores de integrina sobre a membrana celular para ligar dímeros de FN e forças contrácteis gerado-actomiosina para desdobrar e expor os locais de ligação para a montagem em fibras insolúveis. Este processo mediado por receptores de células permite montar e organizar o ECM do tecido celular para scales. Aqui, apresentamos um método denominado montagem iniciou-superfície (SIA), que recapitula a montagem da matriz mediada por células usando interações proteína-superfície a se desdobrar proteínas da MEC e montá-las em fibras insolúveis. Primeiro, proteínas da MEC são adsorvidos um polidimetilsiloxano hidrofóbico (PDMS) superfície onde eles parcialmente desnaturar (desdobrar) e expor domínios de ligação enigmáticas. As proteínas desdobradas em seguida, são transferidos em bem definidas micro e nanopatterns através de impressão em uma microcontacto poli resposta térmica (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superfície. Dissolução termicamente acionado do PIPAAm leva à montagem final e liberação de proteínas insolúveis nanofibras ECM e nanoestruturas com geometrias bem definidas. Arquiteturas complexas são possíveis por padrões de engenharia definidos nos selos PDMS utilizados para impressão microcontact. Além disso a FN, o processo de PEI poderá ser usado com laminina, fibrinogénio e colagénios do tipo I e IV para criar multi-componente nanostruc ECMturas. Assim, o SIA pode ser utilizado para manipular os materiais à base de proteínas de ECM com o controlo preciso sobre a composição de proteína, fibra de geometria e arquitectura de andaime, a fim de recapitular a estrutura e composição da MEC in vivo.

Introdução

A matriz extracelular (ECM) dos tecidos é composta de proteínas multifuncionais envolvidos na regulação física e química de vários processos celulares, incluindo adesão, proliferação, diferenciação e apoptose ^1-3. O ECM é sintetizada, montado e organizado pelas células e as fibras de proteína constituintes têm composições únicas, tamanho da fibra, geometrias e arquiteturas interligadas que variam com o tipo de tecido e estágio de desenvolvimento. Trabalhos recentes têm demonstrado que o ECM pode fornecer pistas instrutivas para orientar células para formar tecidos artificiais ^4, sugerindo que recapitulando a ECM em termos de composição e estrutura pode permitir o desenvolvimento de materiais biomiméticos para aplicações em engenharia de tecidos e biotecnologia.

Um número de métodos de fabrico têm sido desenvolvidos para manipular andaimes poliméricos que podem imitar aspectos da ECM em tecidos. Por exemplo, eletrofiação e separ faseção têm ambos demonstraram a capacidade para formar matrizes porosas de fibras com diâmetros que variam entre dezenas de micrómetros deslocamento de dezenas de nanómetros de ^5-7. Ambas as técnicas têm também mostrado que as matrizes altamente porosas de nanofibras pode suportar a adesão de células e infiltração no andaime ^8. No entanto, estas abordagens estão limitadas nas geometrias possíveis orientações de fibra, e 3D arquitecturas que podem ser criados. Electrospinning normalmente produz andaimes com fibras ou orientadas aleatoriamente ou altamente alinhadas ao passo que a separação de fase produz andaimes com fibras orientadas aleatoriamente. Também existem limitações sobre o material, com investigadores tipicamente utilizando polímeros sintéticos, tais como poli (ε-caprolactona) ⁸ e poli (ácido láctico-co-glicólico), ^9, que são posteriormente revestidos com proteínas de ECM para promover a adesão celular. Biopolímeros naturais também são utilizados, incluindo o colágeno tipo I ^{10, 11} gelatina, fibrinogênio ^12,quitosana ¹³ e ¹⁴ de seda, mas representam apenas um pequeno subconjunto das proteínas encontradas no tecido nativo. A maioria dos tecidos contêm um meio maior de proteínas da MEC e polissacarídeos incluindo a fibronectina (FN), laminina (LN), o colagénio tipo IV e ácido hialurónico que são difíceis ou impossíveis de fabricar utilizando nanofibras de métodos já existentes.

Para enfrentar esse desafio, temos focado nossos esforços de pesquisa sobre imitando a forma como as células sintetizar, montar e organizar fibrilas da proteína ECM em seus arredores. Enquanto o processo de fibrilogénese específica varia para diferentes proteínas da MEC, tipicamente uma alteração conformacional na molécula de proteína da MEC é desencadeada por um enzimática ou interacção mediada por receptor, o que expõe locais de auto-montagem crípticos. Aqui usamos FN como um sistema modelo para entender melhor o processo fibrilogênese. Resumidamente, FN homodímeros se ligam a receptores de integrina sobre a superfície celular através da sequência de aminoácidos RGD no 10 tipo IIRepito unidade. Uma vez ligado, as integrinas se afastam via contração actomiosina e desdobrar os dímeros FN para expor sites de auto-montagem enigmáticas. A exposição a estes locais de ligação de NF-FN permite que os dímeros de FN para montar em uma fibrila insolúvel direita na superfície da célula ^15. Trabalho em sistemas livres de células demonstrou que os sítios de ligação FN-FN enigmáticas pode ser revelado através de desdobramento usando desnaturantes ¹⁶ ou tensão superficial em um ponto sólido-líquido interface de ar ^17-19. No entanto, as fibras de FN criada por estas técnicas são restritas para os tamanhos e geometrias de fibras específicas e está tipicamente ligado a uma superfície.

Aqui nós descrevemos um conjunto iniciou-superfície denominado abordagem (SIA) ^20, que supera estas limitações, utilizando interações proteína de superfície para criar nanofibras sem pé insolúveis, nanofabrics (folhas 2D) e outras nanoestruturas compostas de proteínas individuais ou múltiplas de ECM (Figura 1 ). Neste process, proteínas da MEC são absorvidos a partir de uma conformação compacta, globular em solução e parcialmente desnaturado (desdobrado) em um, polidimetilsiloxano hidrofóbico (PDMS) selo padronizado. As proteínas são então transferidas ECM neste estado num poli resposta térmica (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superfície através microcontact impressão ^22. Quando hidratado com água de 40 ° C a PIPAAm continua a ser um sólido, mas, quando arrefecida a 32 ° C que passa através de uma temperatura crítica inferior de solução (TCIS), onde ela se torna hidrofílico, incha com água e, em seguida, dissolve-se, libertando as nanoestruturas ECM montados fora de a superfície. O método SIA fornece controle sobre as dimensões com precisão à escala nanométrica. Ao controlar os parâmetros-chave, tais como a composição, a geometria da fibra, e arquitetura, é possível recapitular muitas propriedades da ECM encontradas in vivo e desenvolver suportes avançados para aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia.

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Protocolo

1. Fabricação de Molde Mestre usando fotolitografia

1. As nanofibras de proteínas ECM, nanofabrics e nanoestruturas a ser fabricados são primeiramente projetados usando software Computer Aided Design (CAD). Este arquivo CAD é então transferido para um photomask. O tipo de fotomáscara dependerá da resolução das características; com um photomask baseada em transparência adequada para o recurso tamanhos até ~ 10 m. Características menores <10 m exigirá um cromo em photomask vidro. Todas as nanofibras e nanoestruturas aqui apresentados foram fabricados usando um photomask baseado em transparência e, portanto, foram à escala nanométrica de espessura, mas não dimensões laterais.
   Nota: É importante distinguir quais as regiões da fotomáscara será escuro (luz UV para evitar a passar) e que vai ser transparente (permitir que a luz UV para passar através) como este, juntamente com o tipo de material fotosensitivo (positivo ou negativo) , vai ditar a topografia final do molde mestre.
2. Para iniciar o fabrico do molde mestre, desidratar uma bolacha 4 "de silício, colocando-o numa placa de aquecimento configurado para 150 ° C durante 15 min.
3. Centralize o wafer sobre o chuck vácuo de um spin-coater. Despeje SU8-2015 fotorresistente negativo para o meio da bolacha e continuar vertendo em círculos concêntricos, até cerca de dois terços da bolacha é coberto.
   Nota: Manter a garrafa de SU8 perto da bolacha quando vazar para minimizar a formação de bolhas.
4. Programar a spincoater como se segue:
   • Ciclo Spread: 500 rpm com uma aceleração de 100 rpm / s por 10 s.
   • Ciclo de centrifugação: 4000 rpm com uma aceleração de 100 rpm / seg para 30 seg.
   Nota: Esta receita spincoating vai formar uma camada foto-resistente, que é de aproximadamente 10 um de espessura. Ao alterar a velocidade de rotação ou da formulação SU8, a espessura pode ser ajustada.
5. Mole cozer a bolacha, colocando-o numa placa de aquecimento configurado a 95 ° C durante 3 min.
6. Expor o wafer com luz UV através defotomáscara para uma dose total de 140 mJ / cm ^2.
   Nota: SU8 é uma fotorresistência negativo, por conseguinte, as regiões onde a luz ultravioleta é capaz de passar através da foto-mascara permanecerá após o desenvolvimento e tornou características levantadas sobre o molde mestre.
7. Após a exposição cozer a bolacha, colocando-o numa placa de aquecimento configurado a 95 ° C durante 4 min.
8. Desenvolver o wafer, colocando-o desenvolvedor SU8 por 3 min. Após 3 min, lavar o wafer com álcool isopropílico. Se uma película branca é produzido durante a lavagem, a pastilha não é totalmente desenvolvido e deve ser colocada de volta no revelador durante mais 30 seg. Enxágüe novamente com álcool isopropílico. Repita esse processo até que uma película branca não formar durante a lavagem álcool isopropílico.
9. Seca-se a bolacha em uma corrente de azoto e em lugar de uma placa de petri de 150 milímetros para proteger da poeira.

2. Fazendo as PDMS selos

1. Preparar o pré-polímero de PDMS, combinando a base de elastómero e de agente de cura numa10:1 w / w. Tipicamente, 80 g de base e 8 g de agente de cura são utilizados para garantir que há PDMS suficientes para cobrir o molde mestre de uma camada de 1 cm de espessura.
2. Misture e degas do PDMS utilizando um misturador centrípeta definido para o seguinte:
   • Misturar: 2000 rpm durante 2 min
   • Desgaseifica: 2000 rpm durante 2 min.
3. Se um misturador está indisponível misturar os PDMS com a mão por 10 min usando uma pipeta de 10 ml sorológica. Desgaseificar a mistura, colocando-o em um exsicador de vácuo durante 30 min para remover as bolhas.
4. Despeje suficiente pré-polímero de PDMS sobre o molde mestre (pastilha de silício modelado) para formar uma camada de 1 cm de espessura. Curar o PDMS por cozedura a 65 ° C durante 4 horas ou à temperatura ambiente durante 48 horas.
5. Uma vez curada, as regiões que contêm os padrões pode ser cortado para formar os selos PDMS. Para distinguir o lado do recurso na parte de trás do selo PDMS, cortar um entalhe de um dos cantos na parte de trás do selo.

3. Microcontact Printing de padrões de ECM

1. Limpo lamelas de vidro 25 mm de diâmetro por sonicação em etanol a 95% durante 1 hora e em seguida seco num forno de 65 ° C.
2. Preparar a solução PIPAAm dissolvendo PIPAAm em 1-butanol, a uma concentração de 10% (w / v, tipicamente 1 g em 10 ml).
3. Centrar uma lamela de vidro sobre o mandril de vácuo dos spincoater e pipeta 200 uL da solução PIPAAm modo que a superfície de vidro inteiro é coberto.
4. Spincoat a lamela a 6.000 rpm durante 1 min.
5. Limpar os selos PDMS por sonicação em etanol a 50% durante 30 min e, em seguida, seca sob uma corrente de azoto.
   Nota: A secagem e passos subsequentes devem ser realizados numa câmara de biossegurança para manter a esterilidade para aplicações em que as nanoestruturas ECM serão utilizados com células.
6. Revestir a superfície padronizada de cada selo de PDMS com 200 ul da solução de proteína, tipicamente 50 ug / ml em água destilada estéril para FN. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
   Nota: Thé o revestimento de volume é um PDMS selo 1,5 cm ² e terá de ser ajustada, dependendo do tamanho do selo PDMS, a proteína da MEC utilizado e a concentração da proteína na solução de ECM.
7. Lave os selos PDMS em água destilada para remover o excesso de proteína e seco cuidadosamente sob uma corrente de azoto.
   Nota: Qualquer água deixada sobre o selo irá desencadear a dissolução prematura do revestimento PIPAAm na lamela e evitar a transferência de proteína adequada.
8. Para a fabricação estéril, coloque as lamelas PIPAAm revestidos no interior de uma placa de Petri fechada e esterilizar utilizando a exposição UV, 45 min sob a luz UV em uma cabine de segurança biológica é suficiente. Se a esterilidade não é necessário este passo pode ser omitido.
9. Executar impressão microcontact colocando lado a característica do selo PDMS em contato com a lamela PIPAAm-revestido. Se necessário, utilize uma pinça para bater levemente na parte de trás dos selos para remover as bolhas de ar e garantir o contato uniforme.
10. Após 5 min, retire o selo PDMS da lamela.
11. Nesta fase, as proteínas de ECM adicionais, pode ser modelado para criar estruturas mais complexas e de componentes múltiplos. Até 3 impressões foram verificados para trabalhar com este processo, e muito mais pode ser viável.

4. Lançamento de ECM nanofibras e Nanoestruturas

1. Coloque o PIPAAm lamela revestida modelada em um 35 milímetros placa de Petri e fiscalizar a fidelidade padrão usando microscopia de contraste de fase. Dependendo do padrão, uma câmara CCD pode ser necessário, para resolver as características do padrão. A microscopia de fluorescência também pode ser utilizado para inspeccionar o padrão fornecidas as proteínas de ECM são marcadas por fluorescência.
2. Adicionar 3 ml de água destilada, 40 ° C para a placa de petri e permite que a água a arrefecer gradualmente.
3. A dissolução da camada PIPAAm e a libertação dos padrões de proteínas de ECM podem ser monitorizadas através de microscopia de contraste de fase. Se o aplicativo não permite o uso de tec ópticahniques, a libertação pode ser monitorizado através da medição da temperatura da solução. Tipicamente, a água é arrefecida até à temperatura ambiente, bem abaixo da TCIS de PIPAAm (32 ° C), para assegurar que as nanoestruturas de proteínas de ECM foram libertados.
4. Após a liberação, as nanofibras, nanofabrics e outras nanoestruturas estão flutuando na água. Para usá-los para outras aplicações que necessitam para ser manipulado. A abordagem exacta dependerá do objectivo experimental e pode incluir passos tais como a imobilização para outra superfície, movendo-se com um sistema micromanipulador ou incorporação num hidrogel.

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Resultados

SIA é capaz de ECM engenharia nanofibras de proteínas com um controle preciso sobre as dimensões das fibras. Para demonstrar isto, matrizes de nanofibras FN com dimensões planares de 50 x 20 um foram modelados para uma lamela PIPAAm revestido (Figura 2A). Após a liberação, as fibras contratados porque estavam sob uma pré-estresse inerente ao modeladas na superfície PIPAAm (Figura 2B). Análise das nanofibras FN revelou que foram pré-autorização monodisperso com um compriment...

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Discussão

O método aqui apresentado SIA imita montagem matriz mediada por células e permite que a engenharia de proteínas ECM nanofibras e nanoestruturas com tamanho ajustável, organização e composição. Apesar de não ser idêntico ao ECM gerado pelo celular, SIA cria ECM composta de fibrilas da proteína em nanoescala ²⁰ que sofrem de dobramento reversível / desdobramento durante tensão mecânica ²¹ e podem ligar células ^20. Isto proporciona uma capacidade única para construir materia...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm	Polysciences	21458-10	40,000 Mw
Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)	Dow Corning		Mix 10 parts base with 1 part curing agent.
Butanol
Fibronectin	BD biosciences	354008	Human, 1mg
Laminin	BD biosciences	354239	Ultrapure, mouse, 1mg
Negative Photoresist	Microchem	SU8-2015
SU8 Developer	Microchem
Sonicator Branson M3510	Branson Ultrasonic Corporation	CPN-952-318
Thinky ARE-250 Mixer	Thinky Corporation
Spincoater	Specialty Coating Systems	G3P-8
Glass cover 25mm diameter, No 1.5	Fisher Scientific	12-545-86