ECM Белковые Нановолокон и наноструктуры Инженерная Использование Поверхность по инициативе Ассамблеи

Резюме

Метод получения нановолокон и сложных наноструктур из одной или нескольких белков внеклеточного матрикса описана. Этот метод использует белок-поверхностные взаимодействия для создания на основе белков материалы свободно стоящая с перестраиваемой состава и архитектуры для использования в различных тканевой инженерии и биотехнологии приложений.

Аннотация

Внеклеточного матрикса (ECM) в тканях синтезируется и собран клеток, чтобы сформировать 3D фибриллярных, сеть белка с жестко регулируется диаметра волокна, состава и организации. В дополнение к обеспечению структурной поддержки, физические и химические свойства ECM играют важную роль в нескольких клеточных процессов, включая адгезию, дифференцировки и апоптоза. В естественных условиях, ЕСМ собраны, подвергая загадочное самосборки (фибриллогенеза) сайтов в белках . Этот процесс варьируется для различных белков, но фибронектин (FN) фибриллогенез хорошо охарактеризованы и служит в качестве модельной системы для клеточного сборки ECM. В частности, клетки используют рецепторов интегрина на клеточной мембране, чтобы связать FN димеры и актомиозин генерируемые сократительные силы разворачиваться и подвергать сайты связывания для сборки в нерастворимые волокна. Этот процесс рецептор-опосредованного позволяет клетки собрать и организовать ECM от сотовой, чтобы ткани SCAле. Здесь мы представляем метод называется поверхность инициативе в сборе (SIA),, которая рассматривает сборку матрицу клеточный помощью белка-поверхностные взаимодействия разворачиваться ECM белков и собрать их в нерастворимые волокна. Во-первых, ECM белки адсорбируются на гидрофобной полидиметилсилоксана (PDMS) поверхности, где они частичной денатурации (раскройте) и выставить загадочные связывающие домены. В развернутые белки, которые затем передаются в четко определенных микро-и nanopatterns через микроконтактной печати на термочувствительной поли (N-изопропилакриламида) (PIPAAm) поверхности. Термически срабатывает роспуск PIPAAm приводит к окончательной сборки и выпуска нерастворимых ECM белка нановолокон и наноструктур с четко определенными геометрий. Сложные архитектуры возможны инженерными определяется узоры на марках PDMS, используемых для микроконтактной печати. В дополнение к FN, процесс SIA может быть использован с ламинин, фибриногена и коллагены типа I и IV, чтобы создать многокомпонентный ECM наноструктурвания. Таким образом, SIA может использоваться для проектирования на основе белков ЕСМ материалов с точным контролем над белковой композиции, геометрии волокна и лесов архитектуры для того, чтобы повторять структуру и состав внеклеточного матрикса в естественных условиях.

Введение

Внеклеточного матрикса (ECM) в тканях состоит из многофункциональных белков, участвующих в физической и химической регуляции нескольких процессов адгезии клеток, включая, пролиферации, дифференцировки и апоптоза ^1-3. ЕСМ синтезируется, собран и организован клеток и составляющие белковые фибриллы имеют уникальные композиции, размер волокна, геометрии и взаимосвязанные архитектуры, которые меняются в зависимости от типа ткани и стадии развития. Последние работы показал, что ECM может обеспечить поучительные сигналы для руководства клеток образовывать инженерии тканей ^4, предполагая, что Резюмируя ECM с точки зрения состава и структуры может способствовать развитию биомиметических материалов для тканевой инженерии и биотехнологии приложений.

Ряд способов изготовления были разработаны для проектирования полимерных каркасов, которые могут имитировать аспекты ЕСМ в тканях. Например, электропрядения и фаза СовместноеAtion оба продемонстрировали способность к образованию пористых матриц волокон с диаметром от десятков микрометров до десятков нанометров ^5-7. Оба метода показали также, что очень пористые матрицы нановолокон может поддерживать клеточную адгезию и проникновение в эшафот ^8. Однако эти подходы ограничены в возможных волокна геометрий, ориентаций и 3D архитектур, которые могут быть созданы. Электропрядения обычно производит строительные леса либо случайно ориентированных или сильно выровненных волокон, тогда как разделение фаз производит строительные леса со случайно ориентированными волокнами. Существуют также ограничения на материалах с использованием исследователи обычно синтетические полимеры, такие как поли (ε-капролактон) ⁸ и поли (молочной-со-гликолевой кислоты) ^9, который впоследствии покрывают белков ЕСМ в целях содействия адгезии клеток. Природные биополимеры, также используются, в том числе коллагена типа I ^10, желатин ^11, фибриноген ^12,хитозан ^13, и шелк ^14, но они представляют лишь небольшую часть белков, обнаруженных в нативной ткани. Большинство тканей содержат большее среду белков ЕСМ и полисахаридов, включая фибронектин (FN), ламинин (LN), коллагена типа IV и гиалуроновой кислоты, которые трудно или невозможно изготовить нановолокон с использованием существующих методов.

Для решения этой проблемы, мы сосредоточили наши усилия исследования на имитируя путь клетки синтезировать, собрать и организовать ECM белка фибрилл в их окружении. В то время как специфический процесс фибриллогенез варьируется для различных белков ECM, как правило, изменение конформации в молекуле ECM белка запускается с помощью ферментативных или рецептор-опосредованного взаимодействия, который предоставляет загадочные места самосборки. Здесь мы используем FN в качестве модельной системы, чтобы лучше понять процесс фибриллогенеза. Вкратце, FN гомодимеры связываются с интегрином рецепторы на поверхности клетки с помощью последовательности RGD аминокислоты в 10-м типа IIПовторяю блок. После связывания интегрины раздвигаются с помощью сокращения актомиозинового и разворачиваться димеры FN выставить загадочные места самосборки. Разоблачение этих сайтов связывания FN-НС позволяет димеры FN собрать в нерастворимый фибриллы прямо на поверхности клетки ^15. Работа в бесклеточных системах показал, что криптические сайты связывания FN-FN могут быть выявлены через развертывание с использованием денатурирующих ¹⁶ или поверхностное натяжение на воздух-жидкость-твердое тело ^17-19. Однако волокна FN, созданные этими методами ограничены конкретных размеров и геометрии волокна и, как правило, связаны с поверхностью.

Здесь мы опишем подход называется, поверхность инициативе в сборе (SIA) ^20, который преодолевает эти ограничения, используя белок-поверхностные взаимодействия для создания свободно стоящая нерастворимые нановолокон, nanofabrics (2D листов) и других наноструктур, состоящих из одного или нескольких белков ECM (рис. 1 ). В этом рrocess, ECM белки адсорбируются от компактного, шаровидной конформации в растворе и частично денатурированный (в сборе) на узорной, гидрофобный полидиметилсилоксана (PDMS) марки. Контроллер ЭСУД белки, которые затем передаются в этом состоянии на термочувствительного поли (N-изопропилакриламида) (PIPAAm) поверхности через микроконтактной печати ^22. Когда гидратируют 40 ° С воды PIPAAm остается твердым, но при охлаждении до 32 ° С он проходит через ниже критической температуры раствора (НКТР), где она становится гидрофильной, набухает водой, а затем растворяется, высвобождая собранные ECM наноструктур офф поверхность. Метод SIA обеспечивает контроль над размерами с нанометрового масштаба точностью. Контролируя ключевые параметры, такие как композиции, геометрии волокна, и архитектуры, можно резюмировать многие свойства ЕСМ, найденные в естественных условиях и для разработки современных лесов для тканевой инженерии и биотехнологии приложений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Изготовление мастер Mold Использование фотолитографии

1. В ECM белка нановолокна, nanofabrics и наноструктуры быть сфабрикованы сначала разработан с использованием системы автоматизированного проектирования (САПР). Этот CAD файл затем переносили в фотошаблона. Тип фотошаблонов будет зависеть от разрешения особенностей; с прозрачностью на основе фотошаблонов достаточно для функции размеры до ~ 10 мкм. Меньшие особенности <10 мкм потребует хром на стеклянной фотошаблонов. Все нановолокон и наноструктур, представленные здесь, были изготовлены с использованием прозрачности основе фотошаблона, и, таким образом были нанометровые толщиной, но не поперечные размеры.
   Примечание: Важно, чтобы отличить, какие области фотошаблона будет темно (предотвратить ультрафиолетовый свет, чтобы пройти через) и который будет прозрачным (позволяют УФ свету проходить через), поскольку это, вместе с типом фоторезиста (положительное или отрицательное) , будет диктовать конечный топографию мастер формы.
2. Для начала изготовление мастер-форму, обезвоживают 4 "кремниевую пластину, поместив его на плите, установленной до 150 ° С в течение 15 мин.
3. Сосредоточьте пластины на вакуумном патроне спин-машины для нанесения покрытий. Налейте SU8-2015 негативного фоторезиста на середину пластины и продолжить заливки концентрическими кругами, пока около двух третей пластины не покрыта.
   Примечание: Держите бутылку SU8 близко к пластине при заливке, чтобы минимизировать образование пузырьков.
4. Запрограммировать spincoater следующим образом:
   • Распространение цикл: 500 мин с ускорением 100 об / сек в течение 10 сек.
   • Отжим: 4000 оборотов в минуту с ускорением 100 об / сек в течение 30 сек.
   Примечание: Этот рецепт spincoating образуют слой фоторезиста, который ~ 10 мкм в толщину. Изменяя скорость отжима или SU8 композиции, толщина может быть отрегулирована.
5. Мягкий испечь вафли, поместив его на плите, установленной до 95 ° С в течение 3 мин.
6. Expose пластину с ультрафиолетовым светом черезфотошаблон для общей дозы 140 мДж / см ^2.
   Примечание: SU8 является негативный фоторезист поэтому регионы, где УФ-излучение может проходить через фотошаблон останется после разработки и стать поднятые особенности на мастер-формы.
7. Начать экспозицию испечь пластины, поместив его на плите, установленной до 95 ° С в течение 4 мин.
8. Разработка пластины, поместив его в SU8 разработчика в течение 3 мин. Через 3 минуты, промойте пластину с изопропилового спирта. Если белая пленка образуется в процессе промывки, пластина не полностью разработана и он должен быть помещен обратно в разработчика для еще 30 сек. Промыть снова изопропилового спирта. Повторите этот процесс, пока белая пленка не образует в изопропиловый спирт промывки.
9. Сушат пластины в потоке азота и место в 150 мм чашки Петри для защиты от пыли.

2. Выполнение PDMS Марки

1. Подготовьте форполимера PDMS путем объединения эластомера основы и отвердителя в10:01 / мас отношение. Обычно 80 г основания и 8 г отвердителя используются чтобы у пассажиров было достаточно PDMS, чтобы покрыть мастер плесень в толщиной 1 см слоя.
2. Смешайте и дегазации PDMS с помощью центростремительное мешалки на следующее:
   • Смешайте: 2000 оборотов в минуту в течение 2 мин
   • Дега: 2000 оборотов в минуту в течение 2 мин.
3. Если смеситель недоступен смешивать PDMS вручную в течение 10 мин с использованием 10 мл серологической пипеткой. Дегазируют смеси, поместив его в вакуумном эксикаторе в течение 30 мин для удаления пузырьков.
4. Налейте достаточно PDMS форполимера через мастер-форму (с рисунком кремниевой пластины) с образованием густой 1 см слой. Вылечить PDMS путем обжига при 65 ° С в течение 4 часов или при комнатной температуре в течение 48 часов.
5. После отверждения, Регионы, содержащие образцы можно вырезать, чтобы сформировать марки PDMS. Чтобы отличить особенность сторону от задней стороны штампа PDMS, вырезать на ступеньку из одного из углов на задней стороне марки.

3. Микроконтакта Printing из ECM Patterns

1. Чистые 25 мм покровные стекла диаметр ультразвуком в 95% этаноле в течение 1 часа и затем сушат в печи 65 ° C.
2. Приготовьте раствор путем растворения PIPAAm PIPAAm в 1-бутаноле при концентрации 10% (вес / объем, как правило, 1 г в 10 мл).
3. Центрирование покровным стеклом на вакуумном патрона из spincoater и пипетки 200 мкл раствора PIPAAm так, чтобы вся поверхность покрыта стеклом.
4. Spincoat покровное на 6000 оборотах в минуту в течение 1 мин.
5. Очистка марки PDMS путем обработки ультразвуком в 50% этаноле в течение 30 мин и затем сушат в токе азота.
   Примечание: Сушка и последующие шаги должны быть выполнены в шкафу биологической безопасности для сохранения стерильности для приложений, где ECM наноструктуры будут использованы с клетками.
6. Coat рисунком поверхность каждого PDMS печать с 200 мкл раствора белка, как правило, 50 мкг / мл в стерильной дистиллированной воде в течение FN. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
   Примечание: Чтэто покрытие объем, для PDMS штампа 1,5 см ² и должны быть отрегулированы в зависимости от размера PDMS штамп, ЕСМ белком, используемым и концентрации ECM белка в растворе.
7. Промыть марки PDMS в дистиллированной воде, чтобы удалить избыток протеина и высохнуть в потоке азота.
   Примечание: Любая вода, оставленная на марке вызовет преждевременное растворение покрытия PIPAAm на покровное и нарушить их нормальную передачу белка.
8. Для стерильной изготовления, разместить покровные на PIPAAm покрытием внутри закрытой чашке Петри и стерилизовать с помощью УФ экспозиции, 45 мин под УФ-светом в области биобезопасности кабинета достаточно. Если стерильность не требуется этот шаг может быть пропущен.
9. Выполнение микроконтактной печати, поместив функцию сторону штампа PDMS в контакте с покровным PIPAAm покрытием. При необходимости используйте щипцы нажмите слегка на задней марок для удаления пузырьков воздуха и обеспечить равномерный контакт.
10. Через 5 мильп, шелушиться PDMS штамп из покровного стекла.
11. На данном этапе, дополнительные белки ECM может быть с рисунком, чтобы создавать более сложные и многокомпонентных конструкций. До 3 печатные издания были проверены на работу с этим процессом, и более может быть осуществимо.

4. Выпуск ECM нановолокон и наноструктур

1. Поместите узорной покровное PIPAAm покрытием в 35 мм чашки Петри и осмотрите образец верности использованием фазового контраста микроскопии. В зависимости от модели, ПЗС-камера может быть необходимо решить особенности узора. Флуоресцентная микроскопия также может быть использован для проверки образец при условии, что ECM белки флуоресцентной метки.
2. Добавьте 3 мл 40 ° C дистиллированной водой до чашки Петри и дать воде постепенно прохладно.
3. Роспуск слоя PIPAAm и выпуск моделей ECM белка можно контролировать с помощью фазового контрастной микроскопии. Если приложение не позволяет использование оптического текhniques, релиз можно контролировать путем измерения температуры раствора. Как правило, вода охлаждается до комнатной температуры, что значительно ниже НКТР PIPAAm (32 ° C), чтобы гарантировать, что ECM белка наноструктуры были освобождены.
4. После освобождения, нановолокна, nanofabrics и другие наноструктуры, плавающие в воде. Чтобы использовать их в дальнейшем, они должны манипулировать. Точное подход будет зависеть от цели экспериментальной и может включать в себя такие шаги, как иммобилизации на другую поверхность, двигаясь с системой микроманипулятора или встраивания в гидрогеле.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

SIA способен инженерно ECM белка нановолокон с точным контролем над размерами волокна. Чтобы продемонстрировать это, массивы FN нановолокон с плоскими размерами 50 х 20 мкм были рисунком на покровное PIPAAm покрытием (рис. 2А). После освобождения, волокна контракт, потому что они находи?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Метод SIA представленные здесь имитирует клеточный узел матрицы и позволяет инжиниринг ECM белка нановолокон и наноструктур с размером перестраиваемый, организации и состава. В то время как не идентичны клеток генерируемые ECM, SIA создает ECM состоит из наноразмерных белковых волокон ^20,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm	Polysciences	21458-10	40,000 Mw
Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)	Dow Corning		Mix 10 parts base with 1 part curing agent.
Butanol
Fibronectin	BD biosciences	354008	Human, 1mg
Laminin	BD biosciences	354239	Ultrapure, mouse, 1mg
Negative Photoresist	Microchem	SU8-2015
SU8 Developer	Microchem
Sonicator Branson M3510	Branson Ultrasonic Corporation	CPN-952-318
Thinky ARE-250 Mixer	Thinky Corporation
Spincoater	Specialty Coating Systems	G3P-8
Glass cover 25mm diameter, No 1.5	Fisher Scientific	12-545-86