Un método mejorado para la rápida y precisa medición de rendimiento en vuelo<em&gt; Drosophila</em

Resumen

Aquí se describe un método para la medición rápida y exacta de funcionamiento de vuelo en Drosophila, lo que permite detección de alto rendimiento.

Resumen

Drosophila ha demostrado ser un sistema modelo útil para el análisis del comportamiento, incluyendo el vuelo. El probador de vuelo involucrado caída inicial vuela en un aceite recubierto probeta; altura aterrizaje proporciona una medida de la capacidad de vuelo mediante la evaluación de cómo las moscas lejos caerán antes de producir empuje suficiente para hacer contacto con la pared del cilindro. Aquí se describe una versión actualizada del probador de vuelo con cuatro mejoras importantes. En primer lugar, hemos añadido un "tubo de caída" para asegurarse de que todas las moscas entran en el cilindro de vuelo a una velocidad similar entre los ensayos, lo que elimina la variabilidad entre los usuarios. En segundo lugar, hemos sustituido el recubrimiento de aceite con láminas de plástico desmontables revestidos en Maraña-Trap, un adhesivo diseñado para capturar insectos vivos. En tercer lugar, se utiliza un cilindro más largo para permitir la discriminación más precisa de la capacidad de vuelo. En cuarto lugar se utiliza una cámara digital y software de imágenes para automatizar la puntuación de rendimiento de vuelo. Estas mejoras permiten el rapIdentificación, evaluación cuantitativa del comportamiento de vuelo, útil para grandes conjuntos de datos y pantallas de genética a gran escala.

Introducción

Drosophila ha sido utilizado para estudiar la base genética de comportamiento ^1, y los investigadores han ideado un número de maneras de analizar varios tipos de conducta ^2-6. Las moscas han sido particularmente útil para proporcionar modelos útiles de trastornos neuromusculares ^7. Un ensayo común utilizado para estudiar el comportamiento del aparato locomotor es el rendimiento de vuelo. El probador de vuelo original es útil para identificar los vuelos mutantes defectuosos y para la evaluación cuantitativa de la habilidad de vuelo ^1, pero tiene varios inconvenientes que limitan su aplicación para las pantallas de alto rendimiento: el uso de cilindros de petróleo recubierto es complicado y engorroso, ciertas características, tales como la longitud del cilindro y la introducción de las moscas en el tubo con fuerza variable a reducir la precisión cuantitativa, y es difícil de recuperar moscas en vivo desde el probador. Para superar estas limitaciones, se ha modificado el probador de vuelo para incluir una serie de mejoras. Hemos añadido una "gota maser "para introducir las moscas para eliminar la variabilidad entre los experimentos y los usuarios. Utilizamos láminas acrílicas removibles recubiertas con un adhesivo que permite la fácil limpieza y recuperación de las moscas individuales. Hemos aumentado la longitud del tubo de vuelo para mejorar la precisión y la fiabilidad cuantitativa. Finalmente , usamos una cámara digital y software de imágenes para calcular las alturas de aterrizaje de moscas. Creemos que estas mejoras sean de utilidad para todos los laboratorios interesados ​​en la realización de cribados genéticos a gran escala para los defectos de funcionamiento de vuelo.

Protocolo

1. Ensamble Vuelo Tester

1. Secure cilindro vuelo a Anillo de soporte 1 con abrazaderas de cadena. (Deje aproximadamente 3 cm por debajo del cilindro para pesar la cápsula.)
   (Nota: El cilindro de vuelo que utilizamos es de 90 cm de largo con un diámetro de 13,5 cm.)
2. Inserte pesan plato con una fina capa de aceite mineral por debajo del cilindro de vuelo.
3. Embudo seguro a Anillo soporte 2 con una abrazadera de anillo y abrazadera de la garra. Ajustar la altura del embudo de modo que el fondo del embudo esté a ras con la parte superior del cilindro de vuelo. (Nota: el diámetro de la punta del embudo debe ser menor que el diámetro exterior de los viales colocados en los tubos de caída de manera que los viales no se caigan a través de.)
4. Inserte el tubo de llenado en la parte superior del embudo y fijar con una abrazadera de la garra.
   (Nota: Nosotros usamos un tubo de caída que es de 25 cm de largo de Goteo volar-que contiene los viales desde esta altura permite la expulsión constante de todas las moscas con fuerza uniforme El diámetro interior del tubo de caída debe ser sligh..TLY más grande que el diámetro exterior del vial para permitir que el vial a gota libremente.)
5. Cortar hoja (s) de poliacrilamida al tamaño apropiado. (Nota: Para ayudar en la inserción y extracción de la hoja, la anchura debe ser ligeramente menor que la circunferencia interior del cilindro de vuelo).
6. Aplique una capa delgada de Maraña-Trap a la hoja. Deje reposar durante 1 hora antes de su uso. (Nota: Deje suficiente espacio en la parte superior e inferior de la hoja (aproximadamente 3 cm) sin recubrir para agarrar la hoja de inserción / extracción.)
7. Inserte la hoja de poliacrilamida en el cilindro de vuelo.
8. Montar la pista de cámara utilizando soportes de pino. (Nota: asegúrese de que la parte inferior de la pista se puede apoyar la cámara sin bloquear la lente Consulte la Figura 1B.).
9. Añadir tapones y el tornillo en su lugar. (Nota: colocar los tapones en lugares que permitan la cámara para ver la totalidad de la lámina de plástico en el modo panorámico.)

2. Ejecutar Experimento

1. Recoger viales de moscas para ensayar. Para obtener los mejores resultados, no use más de 20 moscas / vial.
2. Golpee suavemente moscas a fondo del vial, desconecte y luego insertar en el tubo de llenado y suelte vial.
   (Nota: El vial se cae el tubo de caída hasta que llega a la apertura estrecho embudo Cuando el vial golpea el embudo, las moscas son expulsados ​​en el cilindro de vuelo.).
3. Levante el tubo de caída para eliminar el vial vacío.
   (Nota: Varios frascos de moscas del mismo grupo de prueba se pueden ensayar en una hoja de poliacrilamida sola Encontramos que hasta 200 moscas (10 viales de 20 moscas cada uno) se pueden probar y tomar imágenes claras en una sola hoja..
4. Retire la hoja de plástico y colóquelo en una superficie plana y blanca.
   (Nota: cartulina blanca se puede utilizar si las mesas de trabajo son de color oscuro.)
5. Montar la pista de cámara sobre la lámina de plástico. La cámara debe ser lo suficientemente alta por encima de la hoja de tener la parte superior e inferior de la hoja en el campo de visión.
6. Deslice la cámara a lo largo de the pista mientras mantiene pulsado el botón de "captura" para adquirir una imagen panorámica.
7. El número de moscas que aterrizan en el aceite puede contarse manualmente para cada ensayo.
8. Repetir los pasos 2.2 a 2.7 para todas las condiciones en un experimento dado. Las moscas pueden ser retirados de la hoja entre cada ensayo. Por otra parte, varias hojas se pueden usar, con una hoja nueva para cada ensayo.

3. Recolección de Datos

1. Abrir archivos de imagen utilizando el software ImageJ.
2. Recorte de imágenes si es necesario para incluir sólo el área de la superficie de aterrizaje. (Esta es la zona recubierta de Maraña-Trap.)
3. Convertir imágenes a 8 bits en escala de grises.
4. Crear un "umbral" para filtrar el fondo blanco.
   (Imagen → Ajuste → Umbral).
5. Establezca los parámetros para identificar cada vuelo usando el menú de "analizar partículas".
   (Analizar → Analizar Partículas) Definir los parámetros utilizados para identificar una partícula. Con nuestra creó, nos encontramos con que el uso de unárea de 5 a 90 pixeles ² y una circularidad de 0.4-1.0 identificará con precisión todas las muestras.
6. Medir la ubicación de cada marcha utilizando la lista generada de coordenadas para cada partícula. Coordenada x en píxeles se puede convertir en centímetros para calcular la altura de aterrizaje.
7. Importar tabla en una hoja de cálculo (como Microsoft Excel).

Resultados

Figura 1A muestra un esquema del montaje probador de vuelo actualizado. Figura 1B ilustra el diseño de la pista permite la cámara para tomar una imagen panorámica sin bloquear el campo de visión. Los resultados representativos se muestran en la Figura 2, en el que el rendimiento de vuelo de moscas mutantes Slowpoke, que tienen un vuelo conocido defecto de ^8-10, se comparan con los de tipo salvaje Canton-S vuela. Control de moscas a...

Discusión

Utilizando los métodos descritos aquí, hemos sido capaces de evaluar rápidamente el rendimiento de vuelo de un gran número de mutantes de Drosophila, que proporciona una mayor eficiencia que antes. Para nuestros experimentos, separamos rutinariamente a hombres y mujeres y criarlos a baja densidad (menos de 20 moscas / vial) para limitar la agresión que pudiera dañar las alas. Otra consideración importante es controlar adecuadamente las diferencias en el rendimiento de vuelo debido a las diferencias en el...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Putty knife	Home Depot	630147	www.homedepot.com
Pine back band moulding (2x)	Home Depot	156469	www.homedepot.com
Furring Strip Board	Home Depot	164704	www.homedepot.com
Tangle-Trap Insect Trap Coating	BioControl Network	268941	www.biconet.com
Laptop Computer	Apple		www.apple.com/mac/
Mineral oil	Fisher Scientific	BP26291	www.fishersci.com
White poster board	Staples	247403	www.staples.com
Polystyrene weighing dish	Fisher Scientific	S67091A	www.fishersci.com
ImageJ Software	National Institutes of Health		http://rsb.info.nih.gov/ij/
Digital camera	Sony	DSC-TX7	www.store.sony.com
Fine forceps	Fine Science Tools		www.finescience.com
Polycarbonate cylinder (drop tube)	McMaster-Carr	8585K62	www.mcmaster.com
Flight cylinder (acrylic)	McMaster-Carr	8486K943	www.mcmaster.com
Polycarbonate sheets	McMaster-Carr	85585K25	www.mcmaster.com
ring stand (2x)	Fisher Scientific	S47808	www.fishersci.com
Ring support	Fisher Scientific	S47791	www.fishersci.com
Three-prong extension clamps (x2)	Fisher Scientific	05-769-7Q	www.fishersci.com
Funnel	Fisher Scientific	10-500-3	www.fishersci.com
chain clamps (2x)	VWR	21573-275	www.vwr.com
Glass vials	VWR	66020-198	www.vwr.com