Uçuş Performans Doğru ve hızlı ölçüm için geliştirilmiş Yöntemi<em&gt; Drosophila</em

Özet

Burada yüksek verimli tarama sağlayan, Drosophila uçuş performans hızlı ve doğru bir ölçümü için bir yöntem tarif eder.

Özet

Drosophila uçuş dahil olmak üzere davranış analizi için yararlı bir model sistemi, olduğu kanıtlanmıştır. İlk uçuş test yer bırakarak içine uçar yağ kaplı silindir mezun, iniş yüksekliği silindirin duvarı ile temas kurmaya itme yeterince hazırlamadan önce çok sinekler düşecek ne değerlendirerek uçuş performansı ölçmek sağladı. Burada dört önemli iyileştirmeler ile uçuş test güncelleştirilmiş bir sürümünü açıklar. İlk olarak, bütün sinekler kullanıcılar arasındaki değişkenliği ortadan kaldırarak, çalışmalar arasındaki benzer bir hızda uçuş silindire girer olmasını sağlamak için bir "damla tüp" ekledi. İkincisi, biz Tangle-Trap, canlı böcekleri yakalamak için tasarlanmış bir yapıştırıcı kaplı çıkarılabilir plastik levhalar ile yağ kaplaması değiştirilir. Üçüncü olarak, uçuş yeteneği daha doğru ayrımcılık sağlamak için daha uzun bir silindir kullanın. Dördüncü biz uçuş performans puanlama otomatikleştirmek için bir dijital kamera ve görüntüleme yazılımını kullanabilirsiniz. Bu gelişmeler rap için izinid, uçuş davranış kantitatif değerlendirilmesi, büyük veri kümeleri ve büyük ölçekli genetik ekranlar için yararlıdır.

Giriş

Drosophila uzun davranış ¹ genetik temelini incelemek için kullanılır olmuştur, ve araştırmacılar davranış ^2-6 çeşitli analiz etmek için çeşitli yollar geliştirdiler. Sinekler nöromüsküler bozukluklar ⁷ açısından yararlı modeller sağlayan özellikle yararlı olmuştur. Lokomotor davranışını incelemek için kullanılan ortak bir tahlil uçuş performans. Orijinal uçuş test uçuşu kusurlu mutantlar tanımlamak için ve uçuş yetenek ¹ kantitatif değerlendirilmesi için yararlıdır, ancak yüksek verimli ekranlar için uygulanmasını kısıtlayan bazı eksiklikleri vardır: Yağ kaplı silindir kullanımı, dağınık ve hantal gibi bazı özellikleri Değişken güç ile tüp içine silindir ve sinekler sokulma uzunluğu kantitatif doğruluğunu azaltmak ve bu test canlı sinekler geri kazanılması zor olan. Bu sınırlamaları aşmak için, bir dizi iyileştirmeler içerecek şekilde uçuş test değiştirdiniz. Biz bir "damla tu eklendiBiz kolay temizlik ve bireysel sinekler kurtarma sağlayan bir yapıştırıcı ile kaplı çıkarılabilir akrilik yaprak kullanmak deneyler ve kullanıcılar arasındaki değişkenliği ortadan kaldırmak için sinekler tanıtmak için "olması.. Biz kantitatif doğruluğunu ve güvenilirliğini artırmak için uçuş tüpün uzunluğu artmıştır. Nihayet , bir dijital kamera ve sineklerin iniş yükseklikleri hesaplamak için görüntüleme yazılımı kullanın. Biz bu gelişmeler uçuş performansı kusurlar için büyük ölçekli genetik ekranlar yürütülmesi ilgilenen herhangi bir laboratuvara yararlı olacağına inanıyorum.

Protokol

1.. Uçuş Tester birleştirin

1. Yüzük Güvenli uçuş silindir zincir kelepçeler kullanarak 1 Standı. (Çanak tartmak için silindirin altında yaklaşık 3 cm bırakın.)
   (Not: Kullandığımız uçuş silindir 13.5 cm çapında 90 cm uzunluğundadır.)
2. Uçuş silindirin altında mineral yağ ince bir tabaka ile çanak tartmak yerleştirin.
3. Ring Güvenli huni bir halka kelepçe ve pençe kelepçe kullanarak 2 Standı. Huninin alt uçuş silindirin üst kısmı ile aynı hizada olacak şekilde huni yüksekliğini ayarlar. (Not: huninin uç çapı şişeler ile düşmez, böylece damla tüplerine yerleştirilen şişelerin dış çapından daha küçük olması gerekir.)
4. Huni üst içine açılan tüp takın ve bir pençe kelepçe kullanarak sabitleyin.
   (Not: Bu 25 cm uzunluğunda bir damla tüpü kullanmak Bırakma hedefi içeren homojen bir kuvvet ile tüm sineklerin tutarlı çıkarılmasını sağlayan bu yükseklikten şişeler düşürme tüpünün iç çapı, sligh olmalıdır..Flakon serbestçe düşmesine olanak sağlamak üzere şişenin dış çapından daha büyük tly).
5. Uygun boyutta poliakrilamid levha (lar) kesin. (Not: ekleme ve levha giderilmesinde yardımcı olmak için, genişliği uçuş silindirin iç çevresi biraz daha küçük olmalıdır).
6. Yaprağa Tangle-Trap ince bir tabaka uygulayın. Kullanmadan önce 1 saat boyunca bekletin. (Not: tabakanın üst ve alt ekleme / kaldırma için sayfasını kavramak kaplanmamış (yaklaşık 3 cm) yeterli boşluk bırakın.)
7. Uçuş silindir poliakrilamid sayfasını yerleştirin.
8. Çam destek dirseklerini kullanarak kamera parçayı birleştirin. (Not: parçanın alt lens bloke olmadan kamera destek sağlamak Şekil 1B'ye bakınız.).
9. Tıkaçs ekleyin ve yerine vida. (Not: Burası kamera panorama modunda tüm plastik sayfasını görüntülemek sağlayacak yerlerde tıpaları.)

2. Denemeyi çalıştırın

1. test edilecek sinekler şişeleri toplayın. En iyi sonuç için, en fazla 20 sinekler / şişesini kullanın.
2. Yavaşça flakonun dibine sinekler dokunun, prizden, ardından açılan tüp içine yerleştirin ve şişeyi bırakın.
   (Not: Bu, dar huni açıklığı edecek kadar şişe düşürme tüpü düşer şişe hunisi çarptığında, sinekler uçuş silindir içine atılır.).
3. Boş şişeyi kaldırmak için açılan tüp kaldırın.
   (Not: Aynı deney grubu sinekler Birden küçük şişeler tek bir poliakrilamid kağıda denenebilir Biz kadar 200 sinekler (20 sinekler her 10 şişe), tek bir kağıda test ve kolayca görüntülü bulabilirsiniz..
4. Plastik levha çıkarın ve düz beyaz bir yüzey üzerine yerleştirin.
   (Not: tezgah üstleri koyu renkli ise beyaz poster panosu kullanılabilir.)
5. Plastik levha üzerinde kamera parçayı birleştirin. Kamera görüş alanında yaprağın alt ve üst hem de sahip için tabaka üzerinde yeterli derecede yüksek olmalıdır.
6. Th boyunca kamerayı kaydırıne parça panoramik bir görüntü elde etmek için "yakalama" tuşuna basılı tutarak.
7. Petrol iniş sinek sayısı her deneme için elle sayılır.
8. Tekrar verilen bir deneyde tüm koşullar için 2,2-2,7 adımları. Sinekler her deneme arasındaki tabakasından çıkarılabilir. Alternatif olarak, çok sayıda yaprak her seferinde yeni bir tabaka ile, kullanılabilir.

3. Veri Toplama

1. ImageJ yazılımı kullanarak görüntü dosyaları açın.
2. Kırpma görüntüleri sadece iniş yüzey alanı dahil etmek gerekirse. (Bu Tangle-Trap kaplı alandır.)
3. 8-bit gri tonlama görüntüleri dönüştürün.
4. Beyaz arka plan filtrelemek için bir "Eşik" oluşturun.
   (Görüntü → → Eşik ayarlayın).
5. "Parçacıkları analiz" menüsünü kullanarak her sinek belirlemek için parametreleri ayarlayın.
   Bir parçacık tanımlamak için kullanılan parametrelerini tanımlayın (Parçacıklar Analiz → Analiz). Bizim kurmak ile bulduğumuz bir kullanıyor5-90 piksel ² ve 0,4-1,0 bir dairesellikte alanı doğru tüm örnekleri tespit edecektir.
6. Her parçacığın koordinat oluşturulan listesini kullanarak her sineğin yerini ölçün. Piksel x-koordinatı iniş yüksekliğini hesaplamak için santimetre dönüştürülebilir.
7. (Microsoft Excel gibi) bir tablo içine tablo ithal.

Sonuçlar

Şekil 1A güncellenen uçuş test düzeneğinin şemasını göstermektedir. Şekil 1B parça tasarımı kamera görüntüsü alanını engelleme olmadan panoramik bir görüntü almasına izin göstermektedir. Sonuçlar Örnek ^8-10, bilinen bir kusur bir uçuş uyuşuk mutant sinekler, uçuş performansı, vahşi tip Canton-S uçan ile karşılaştırıldığında, Şekil 2 de gösterilmiştir. Kontrolü sürekli bireyler arasında ?...

Tartışmalar

Burada açıklanan yöntemler kullanılarak, hızla daha önce mümkün olandan daha yüksek verimlilik sağlayan, Drosophila mutantlarının bir sayıda uçuş performansının değerlendirilmesi mümkün olmuştur. Deneyler için, rutin, erkek ve dişileri ayrı ve kanatları zarar verebilir saldırganlığı sınırlamak için düşük yoğunluklu (az 20 sinekler / flakon) onları yükseltmek. Diğer bir önemli husus genetik arka farklılıklardan ötürü uçuş performans farklılıkları için uygun kont...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Putty knife	Home Depot	630147	www.homedepot.com
Pine back band moulding (2x)	Home Depot	156469	www.homedepot.com
Furring Strip Board	Home Depot	164704	www.homedepot.com
Tangle-Trap Insect Trap Coating	BioControl Network	268941	www.biconet.com
Laptop Computer	Apple		www.apple.com/mac/
Mineral oil	Fisher Scientific	BP26291	www.fishersci.com
White poster board	Staples	247403	www.staples.com
Polystyrene weighing dish	Fisher Scientific	S67091A	www.fishersci.com
ImageJ Software	National Institutes of Health		http://rsb.info.nih.gov/ij/
Digital camera	Sony	DSC-TX7	www.store.sony.com
Fine forceps	Fine Science Tools		www.finescience.com
Polycarbonate cylinder (drop tube)	McMaster-Carr	8585K62	www.mcmaster.com
Flight cylinder (acrylic)	McMaster-Carr	8486K943	www.mcmaster.com
Polycarbonate sheets	McMaster-Carr	85585K25	www.mcmaster.com
ring stand (2x)	Fisher Scientific	S47808	www.fishersci.com
Ring support	Fisher Scientific	S47791	www.fishersci.com
Three-prong extension clamps (x2)	Fisher Scientific	05-769-7Q	www.fishersci.com
Funnel	Fisher Scientific	10-500-3	www.fishersci.com
chain clamps (2x)	VWR	21573-275	www.vwr.com
Glass vials	VWR	66020-198	www.vwr.com