Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo<em&gt; Drosophila</em

Riepilogo

Qui si descrive un metodo per la misurazione rapida e accurata delle prestazioni di volo in Drosophila, consentendo di screening high-throughput.

Abstract

Drosophila ha dimostrato di essere un sistema modello utile per l'analisi del comportamento, comprensivo di volo. Il tester volo caduta coinvolta iniziale vola in un rivestimento d'olio cilindro graduato, altezza atterraggio fornito una misura della performance di volo da valutare come mosche lontane cadranno prima di produrre abbastanza spinta a mettersi in contatto con la parete del cilindro. Qui si descrive una versione aggiornata del tester volo con quattro importanti miglioramenti. In primo luogo, abbiamo aggiunto un "tubo pescante" per garantire che tutte le mosche entrano nel cilindro volo ad una velocità simile tra la prova, eliminando la variabilità tra gli utenti. In secondo luogo, abbiamo sostituito il rivestimento dell'olio con teli di plastica estraibili rivestiti in Tangle-Trap, un adesivo progettato per catturare insetti vivi. In terzo luogo, usiamo un cilindro più lungo per consentire la discriminazione più accurata capacità di volo. Quarto si usa una fotocamera digitale e software di imaging per automatizzare il punteggio delle prestazioni di volo. Questi miglioramenti consentono il rapid, la valutazione quantitativa del comportamento in volo, utile per grandi dataset e schermi genetici su larga scala.

Introduzione

Drosophila è stato a lungo utilizzato per studiare le basi genetiche del comportamento ^1, ed i ricercatori hanno messo a punto una serie di modi per analizzare i vari tipi di comportamento ^2-6. Le mosche sono stati particolarmente utili per fornire utili modelli di malattie neuromuscolari ^7. Un test comunemente usato per studiare il comportamento locomotore è la prestazione di volo. Il tester volo originale è utile per identificare ponti mutanti difettosi e per la valutazione quantitativa della capacità di volo ^1, ma ha diversi difetti che ne limitano l'applicazione per schermi ad alto rendimento: l'uso di bombole rivestite petrolio è disordinato e ingombrante, alcune funzionalità come la lunghezza del cilindro e l'introduzione di mosche nel tubo con forza variabile ridurre la precisione quantitativa, ed è difficile da recuperare in linea diretta dal tester. Per superare queste limitazioni, abbiamo modificato il tester volo per includere una serie di miglioramenti. Abbiamo aggiunto una "goccia tuessere "introdurre linea per eliminare variabilità tra esperimenti e utenti. Usiamo lastre acriliche rimovibili rivestiti con un adesivo che consente una più facile pulizia e recupero di singoli mosche. Abbiamo aumentato la lunghezza del tubo di volo per migliorare la precisione e l'affidabilità quantitativa. Infine , si usa una fotocamera digitale e software di imaging per calcolare le altezze sbarco di mosche. Crediamo che questi miglioramenti saranno utili a qualsiasi laboratorio interessato a condurre schermi genetici su larga scala per i difetti di prestazioni di volo.

Protocollo

1. Montare Tester Volo

1. Cilindro volo sicuro a Ring stand 1 con fascette catena. (Lasciare circa 3 cm sotto il cilindro per pesare piatto.)
   (Nota: Il cilindro volo che usiamo è lungo 90 centimetri con un diametro di 13,5 centimetri.)
2. Inserire pesare piatto con un sottile strato di olio minerale sotto il cilindro volo.
3. Imbuto sicuro a Ring stand 2 utilizzando una pinza anello e morsetto artiglio. Regolare l'altezza dell'imbuto modo che il fondo dell'imbuto è a filo con la parte superiore del cilindro volo. (Nota: il diametro della punta dell'imbuto deve essere inferiore al diametro esterno di flaconi posizionati nei tubi goccia in modo che le fiale non cadere.)
4. Inserire il tubo discesa nella parte superiore dell'imbuto e fissarlo con un morsetto artiglio.
   (Nota: Usiamo un tubo goccia che è lungo 25 centimetri Dropping vola contenenti flaconi da questa altezza permette di espulsione coerente di tutte le mosche con forza uniforme Il diametro interno del tubo di caduta deve essere sligh..temente maggiore del diametro esterno del flaconcino per consentire il flaconcino di cadere liberamente.)
5. Tagliare foglio di poliacrilammide (s) per la dimensione corretta. (Nota: Per facilitare l'inserimento e la rimozione del foglio, la larghezza deve essere leggermente inferiore alla circonferenza interna del cilindro volo).
6. Applicare uno strato sottile di Tangle-Trap al foglio. Lasciare riposare per 1 ora prima dell'uso. (Nota: Lasciare spazio sufficiente nella parte superiore e inferiore del foglio (circa 3 cm) rivestito di cogliere il foglio per l'inserimento / rimozione.)
7. Inserire il foglio poliacrilammide nel cilindro volo.
8. Montare la pista fotocamera utilizzando staffe di supporto di pino. (Nota: assicurarsi che il fondo della pista può supportare la fotocamera senza bloccare la lente Fare riferimento alla Figura 1B..)
9. Aggiungi tappi e avvitare. (Nota: posto i tappi nelle posizioni che permetteranno la telecamera per visualizzare l'intero foglio di plastica in modalità panoramica.)

2. Eseguire Experiment

1. Raccogliere le fiale di mosche da testare. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare non più di 20 mosche / flacone.
2. Toccare delicatamente le mosche al fondo della fiala, scollegare, quindi inserire nel tubo goccia e rilasciare fiala.
   (Nota: Il flaconcino cade il tubo calo fino a raggiungere l'apertura stretto imbuto Quando il flaconcino colpisce l'imbuto, le mosche vengono espulsi nel cilindro di volo.).
3. Sollevare il tubo di caduta per rimuovere la fiala vuota.
   (Nota: più fiale di mosche dello stesso gruppo di prova possono essere analizzati su un singolo foglio di poliacrilammide Troviamo che fino a 200 mosche (10 flaconcini da 20 mosche ciascuno) possono essere testati e ripreso prontamente su un unico foglio..
4. Togliere il foglio di plastica e posizionarlo su una superficie piatta e bianca.
   (Nota: cartoncino bianco può essere utilizzato se top panchina sono di colore scuro.)
5. Montare la pista fotocamera sul foglio di plastica. La telecamera deve essere sufficientemente alto sopra il foglio di avere sia la parte superiore e inferiore del foglio nel campo visivo.
6. Far scorrere la fotocamera lungo °e traccia tenendo premuto il pulsante "cattura" per acquisire un'immagine panoramica.
7. Il numero di mosche atterraggio nell'olio può essere conteggiato manualmente per ogni prova.
8. Ripetere i passaggi 2,2-2,7 per tutte le condizioni di un dato esperimento. Le mosche possono essere rimossi dal foglio tra ogni prova. In alternativa, possono essere utilizzati diversi fogli, con un nuovo foglio per ogni prova.

3. Raccolta dati

1. Apri file di immagine utilizzando il software ImageJ.
2. Ritagliare le immagini se necessario, per includere solo la superficie di atterraggio. (Questa è l'area rivestita in Tangle-Trap.)
3. Converti immagini a 8-bit in scala di grigi.
4. Creare una "soglia" per filtrare il fondo bianco.
   (Immagine → Regola → Threshold).
5. Impostare i parametri per identificare ogni volo usando il menu "analizzare le particelle".
   (Analizza → Analizza Particles) Definire i parametri utilizzati per identificare una particella. Con il nostro set up, troviamo che l'utilizzo di unarea di 5-90 pixel ² e una circolarità di 0,4-1,0 identifichi accuratamente tutti i campioni.
6. Misurare la posizione di ogni volo usando l'elenco generato delle coordinate per ogni particella. La coordinata x in pixel possono essere convertiti in centimetri per calcolare l'altezza di atterraggio.
7. Importare tabella in un foglio di calcolo (come Microsoft Excel).

Risultati

La figura 1A mostra uno schema del gruppo di tester volo aggiornato. Figura 1B illustra il disegno tracciato permette alla fotocamera di scattare un'immagine panoramica senza bloccare il campo visivo. Risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2, in cui le prestazioni di volo di mosche mutanti slowpoke, che hanno un volo noto difetto ^8-10, vengono confrontati con wild-type Canton-S mosche. Controllo vola costantemente att...

Discussione

Usando i metodi qui descritti, siamo stati in grado di valutare rapidamente le prestazioni di volo di un gran numero di mutanti di Drosophila, fornendo una maggiore efficienza rispetto al passato. Per i nostri esperimenti, abbiamo abitualmente separati maschi e femmine e li alleviamo a bassa densità (meno di 20 mosche / fiala) per limitare l'aggressività che potrebbero danneggiare le ali. Un'altra considerazione importante è quello di controllare adeguatamente le differenze nelle prestazioni di volo ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Putty knife	Home Depot	630147	www.homedepot.com
Pine back band moulding (2x)	Home Depot	156469	www.homedepot.com
Furring Strip Board	Home Depot	164704	www.homedepot.com
Tangle-Trap Insect Trap Coating	BioControl Network	268941	www.biconet.com
Laptop Computer	Apple		www.apple.com/mac/
Mineral oil	Fisher Scientific	BP26291	www.fishersci.com
White poster board	Staples	247403	www.staples.com
Polystyrene weighing dish	Fisher Scientific	S67091A	www.fishersci.com
ImageJ Software	National Institutes of Health		http://rsb.info.nih.gov/ij/
Digital camera	Sony	DSC-TX7	www.store.sony.com
Fine forceps	Fine Science Tools		www.finescience.com
Polycarbonate cylinder (drop tube)	McMaster-Carr	8585K62	www.mcmaster.com
Flight cylinder (acrylic)	McMaster-Carr	8486K943	www.mcmaster.com
Polycarbonate sheets	McMaster-Carr	85585K25	www.mcmaster.com
ring stand (2x)	Fisher Scientific	S47808	www.fishersci.com
Ring support	Fisher Scientific	S47791	www.fishersci.com
Three-prong extension clamps (x2)	Fisher Scientific	05-769-7Q	www.fishersci.com
Funnel	Fisher Scientific	10-500-3	www.fishersci.com
chain clamps (2x)	VWR	21573-275	www.vwr.com
Glass vials	VWR	66020-198	www.vwr.com