Demostración de un resistente a múltiples fármacos<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Microarray Amplificación

Resumen

Un microarray de la amplificación de PCR asimétrica combina la amplificación y la hibridación de microarrays en una sola cámara, lo que simplifica significativamente microarrays de flujo de trabajo para el usuario final. La simplificación de los microarrays de flujo de trabajo es un primer paso necesario para la creación de diagnósticos basados ​​en microarrays que se pueden utilizar de forma rutinaria en los entornos más bajos recursos.

Resumen

La simplificación de los microarrays de flujo de trabajo es un primer paso necesario para la creación de la MDR-TB diagnósticos basados ​​en microarrays que se pueden utilizar de forma rutinaria en los entornos de bajo recursos. Un microarray amplificación combina la amplificación asimétrica PCR, la selección de tamaño de destino, objetivo de etiquetado y la hibridación de microarrays en una única solución y en una sola cámara de microfluidos. Un método de procesamiento por lotes se demuestra con una mezcla maestra asimétrica 9 compleja y de baja densidad elemento gel microarray para el genotipado de múltiples fármacos de Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). El protocolo descrito aquí se puede completar en 6 horas y proporcionar genotipado correcto con al menos 1000 equivalentes celulares de ADN genómico. La incorporación en el chip pasos de lavado es viable, lo que resultará en un método de amplificación totalmente cerrado y el sistema. La medida de multiplexación con una micromatriz de amplificación se ve limitada en última instancia por el número de pares de cebadores que se pueden combinar en un único maestro mIX y aún así lograr la sensibilidad deseada y métricas de rendimiento especificidad, en lugar del número de sondas que están inmovilizados en la matriz. Del mismo modo, el tiempo total de análisis se puede acortar o alargar dependiendo del uso específico previsto, pregunta de investigación, y los límites de detección deseado. Sin embargo, el enfoque general simplifica significativamente microarrays de flujo de trabajo para el usuario final, reduciendo el número de pasos manualmente intensivos y que consumen mucho tiempo de procesamiento, y proporciona un camino bioquímico y de microfluidos simplificado para la traducción de diagnósticos basados ​​en microarrays en la práctica clínica de rutina.

Introducción

La detección temprana de los casos y el tratamiento rápido se consideran las estrategias de control más eficaces de reducir el Mycobacterium tuberculosis (MTB) de transmisión de ^1, y existe un amplio consenso en la comunidad TB que un punto de atención (PDA) o cerca de la prueba POC para diagnosticar simultáneamente TB y se necesita resistencia a los medicamentos (DR). Tecnologías tales como GeneXpert de Cepheid y otras pruebas de amplificación de ácidos nucleicos reducen el tiempo de diagnóstico para muchos pacientes de TB, y proporcionan una rápida lectura de salida que indica la resistencia a la rifampicina o mutaciones seleccionadas que confieren resistencia a otros fármacos de línea primero o segundo ^2. Aunque las pruebas de amplificación en tiempo real y de ácidos nucleicos isotérmica están diseñadas para identificar las mutaciones de resistencia a las drogas que llevan a la MDR-TB, el espectro de mutaciones se detectan es a menudo insuficiente para diseñar un régimen individualizado de drogas correspondiente al perfil de resistencia a los medicamentos del paciente, y las limitaciones técnicas relacionadasa la diafonía óptica o la complejidad de la amplificación y de información química ^{3 a 7 may} limitar el número de loci o mutaciones que se detectan. Por lo tanto, se requieren tecnologías de detección con mayor capacidad de multiplexación para subsanar las deficiencias conocidas en el diagnóstico POC MDR-TB.

Microarrays y los ensayos con sondas de línea Hain avaladas por la OMS pueden hacer frente a la "múltiples genes, mutaciones múltiples" reto de diagnosticar la TB-MR ^8-29. Por desgracia, estas plataformas de detección de multiplexado basado en la hibridación utilizan múltiples pasos, complicado y protocolos de amplificación de voces que exigen la formación y la competencia significativa en las técnicas moleculares. El microarray de amplificación ³⁰ fue diseñado para hacer frente a algunos de estos microarrays de flujo de trabajo y las preocupaciones operacionales. Los principios de fluidos simplificadoras son para amplificar, hibridar, y detectar dianas de ácido nucleico dentro de una cámara única de microfluidos. El usuario introduce los mas ácidos nucleicos y amplificaciónter la mezcla en una cámara de fluido con una pipeta y se inicia el protocolo de ciclado térmico. Para el método de procesamiento por lotes que se muestra aquí, los microarrays se lavan posteriormente en solución en masa, se secaron, y la imagen. Este estudio demuestra la funcionalidad de un microarray de amplificación utilizando una prueba de MDR-TB de microarrays para rpoB (30 mutaciones), katG (2 mutaciones), inh (4 mutaciones), rpsL (2 mutaciones), embB (1 mutación), IS1245, IS6110 , y una amplificación interna y el control de hibridación. Al menos un par emparejado de microarrays sondas (de tipo salvaje (WT) y mutantes de un solo nucleótido (MU)) se incluye para cada mutación de interés. Ácidos nucleicos purificados a partir de M. resistente a múltiples fármacos tuberculosis son de la cepa TDR Tuberculosis Banco ^31. Microarrays de elemento en gel se fabrican sobre substratos de vidrio por copolimerización esencialmente como se describe en otra parte ^32, excepto que se utiliza 4% de monómero y 0,05 mM de cada sonda en el polimerizablesmezcla ación. Las matrices están rodeados con una junta de 50 ml antes de su uso. Después de ciclos térmicos, de hibridación y de lavado de pasos, microarrays de amplificación se crean imágenes en un analizador portátil Akonni. , La intensidad de señal integrados antecedentes corregido se obtienen de la prima. Imágenes tif utilizando un algoritmo círculo fijo. De ruido para cada elemento de gel se calcula como tres veces la desviación estándar de los fondos contado locales. Objetivos de genes típicamente se consideran detectables durante la relación señal-ruido (SNR) valores ≥ 3. Con el fin de determinar la presencia o ausencia de una mutación específica en cada gen o codón, una relación discriminante se calcula a partir de los valores de SNR como (WT-MU) / (wt + MU). Ratios de discriminantes <0 son indicativos de una mutación de resistencia a fármacos en el locus, mientras que las relaciones> 0 son indicativos de la secuencia de tipo salvaje.

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Protocolo

Para los laboratorios que siguen las precauciones universales de PCR, es operacionalmente más eficiente para incluir varios microarrays de amplificación y juntas por sustrato y lavar todos los microarrays de amplificación simultánea en un recipiente a granel, tal como se describe aquí. Formatos consumibles están disponibles para la realización de post-amplificación pasos de microarrays se lavan en una, prueba amplicón cerrado completamente sellada, según ha informado en otras partes ^30,33.

1. Configuración

1. Extraer y purificar ácidos nucleicos a partir de la muestra bajo condiciones de bioseguridad apropiadas con un método de elección. El requisito es que los ácidos nucleicos sean de pureza suficiente para la amplificación asimétrica, PCR multiplex.
2. Preparar espacio de trabajo limpiando las superficies y equipos con las soluciones descontaminantes.
3. Coloca los reactivos de amplificación en hielo o bloque frío.
4. Etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril para la mezcla maestra de amplificación, y la etiqueta de un estéril de 0,2 ml de microcentrífuga maser para cada muestra.
5. Después de reactivos se descongelan, vórtice brevemente y recogen los contenidos de la parte inferior del tubo con un pulso de espín en un mini-centrífuga. No agite Taq polimerasa. Golpee suavemente el tubo para mezclar y siga con un pulso-spin en mini-centrífuga.
6. Preparar una mezcla maestra de amplificación utilizando los volúmenes de reacción por-ejemplo que se muestra en la Tabla 1. Para tener en cuenta posibles inexactitudes de pipeteado, preparar al menos un volumen de reacción más que el número total de muestras que se están procesando. Tenga en cuenta que la mezcla maestra contiene Taq polimerasa adicional, más allá de lo que se proporciona con el tampón de PCR muliplex. Sólo agregar el control de amplificación / inhibición de la mezcla maestra después se combinan todos los demás reactivos, y los tubos de reactivo stock devueltos al almacenamiento.

Reactivo	Volumen por muestra (l)	final []
Multicine PCR Buffer con HotStar Taq Plus	25	1x
Albúmina de suero bovino (BSA)	0.55	0,6 mg / ml
Formamida	3.8	7,6%
Taq polimerasa adicional	0.8	unidades / l (4 unidades en total)
Mezcla de cebadores MDR-TB	15.75	-
RNasa libre de H 2 O	2.1	-
La amplificación / control de inhibición	1	5,0 fg / l
Total	49

Tabla 1. MDR-TB de microarrays de amplificación composición mezcla maestra.

7. Vortex la mezcla maestra y recoger contenidos a la parte inferior del tubo con un pulso de espín en un mini-centrífuga.
8. Combine 49 l de mezcla maestra y 1 l de M. tuberculosis ADN a cada uno de los tubos de muestra de la etapa 1.4, más arriba. Para una externa, sin control de la plantilla (NTC), use 1 l de agua grado biología molecular en lugar de la M. muestra de ADN de la tuberculosis. Vortex y el pulso y gire el tubo (s) cuando haya terminado.

2. Carga de amplificación Microarrays

1. Añadir 48 l de cada master mix / muestra en el centro de sus respectivos microarrays, teniendo cuidado de no tocar el mismo microarray.
2. Coloque una hoja de la cubierta en la parte superior de la junta de microarrays y el sello, con cuidado de no atrapar burbujas de aire en la cámara de microarrays. Las burbujas de aire pueden afectar negativamente a la eficiencia de amplificacióny pueden crear artefactos o ruido en la imagen de microarrays posterior.

3. Ciclo térmico

1. Una vez que todos los microarrays se cargan con la muestra, lugar sustratos en el termociclador bloque plano. Asegúrese de que la opción de tapa térmica se encuentre en "Off". Equipo obtenida de Akonni Biosystems ya estará precalificada para su uso. De lo contrario, es muy importante verificar que el termociclador bloque plano (s) proporcionan (s) uniforme, calefacción consistente a través de todos los sustratos de microarrays.
2. Abra el software termociclador, seleccione el programa apropiado, escriba "50 l" para el volumen de reacción, e iniciar la carrera. El protocolo de ciclado térmico descrito aquí consiste en:

   Pasos del ciclo termal
   1	88 ° C	5 min
   2	88 ° C	30 seg
   3	55 ° C	1 min
   4	65 ° C	30 seg
   5	Repita los pasos (2-4) durante 50 ciclos
   6	65 ° C	3 min
   7	55 ° C	3 hr

3. El número total de ciclos térmicos y de 55 ° C después de la amplificación de tiempo de espera son variables independientes que el usuario puede modificar, según sea necesario o apropiado para el experimento específico. Debido a que la mezcla maestra de la MDR-TB crea amplicones asimétricos (predominantemente de cadena sencilla), por lo general es útil para incluir más ciclos térmicos que de otro modo podrían ser utilizados para un protocolo convencional, exponencial de PCR de amplificación.
4. Cuando el programa de ciclos y la hibridación térmica es completa, terminar el programa, retire los microarrays de amplificación, cierre el software y apague el termociclador (s).

4. Lavar y seco

1. Para el lavado de hasta 24 sustratos simultáneamente, preparar al menos 250 ml de SSPE 1x - 0,1% de Triton X-100 de tampón de lavado, y dos contenedores con al menos 250 ml de agua desionizada o agua Milli-Q grado cada uno. El tampón de lavado puede ser preparado de antemano.
2. Retire con cuidado la hoja de la cubierta y la junta de cada cámara de amplificación de microarrays utilizando pinzas de gama plana. Este paso es el punto en el que existe el mayor riesgo de dañar físicamente a conjuntos de elementos de gel. Utilice los controles adecuados de contaminación de PCR para evitar la propagación de los ácidos nucleicos amplificados dentro del entorno de trabajo.
3. Coloque sustratos de microarrays en un soporte de diapositivas histología, y coloque todas las diapositivas en el cubo de lavado que contiene el tampón de lavado. Cubrir el recipiente con una tapa.
4. Lavar microarrays durante 10 min a temperatura ambiente con agitación suave.
5. Sumerja los microarrays tres veces en cada una de dos lavados sucesivos del desionizada oAgua de calidad Milli-Q, y secar al aire.

5. Imaging

La mezcla de cebadores MDR-TB asimétrica genera amplicones etiquetados con Cy3. Microarrays elementos Gel se pueden obtener imágenes con cualquier reproductor de imágenes de microarrays estándar capaz de Cy3 imágenes. El siguiente procedimiento de imagen es específico para la mezcla de la MDR-TB maestro, campo Dx2100 generador de imágenes portátil, y el software de análisis automatizado proporcionado por Akonni.

1. Asegúrese de que el cable Ethernet de la cámara se conecta al ordenador.
2. Encienda el reproductor de imágenes. El interruptor de encendido se encuentra en el panel posterior del instrumento. LEDs azules en la parte frontal de la cámara termográfica se encienden cuando cámara se enciende.
3. Encienda el ordenador.
4. En el escritorio del ordenador, haga doble clic en el icono del software para iniciar el software automatizado de análisis de imágenes.
5. Esperar a que el software para establecer una conexión con la cámara de imágenes. Una vez se establece la conexión, el botón Analizar esté disponible, y elmensaje "Conexión correcta" aparecerá en la esquina inferior izquierda de la pantalla.
6. Insertar el microarray de amplificación se secó con el microarray frente lejos del usuario, y hacia la lente del objetivo. Si el microarray está orientada de forma incorrecta con respecto a la lente y la cámara, el software de análisis automatizado fallará para colocar una cuadrícula en la imagen de fluorescencia.
7. Cierre la puerta de acceso. Una imagen de vista previa estará disponible en la pantalla de ordenador.
8. Seleccione la MDR-TB script de análisis desde el menú desplegable e introduzca el tiempo de exposición deseado (en milisegundos). Un punto de partida típico para elementos gel microarrays de amplificación es 100-500 ms.
9. Píxeles saturados se mostrarán en la Vista preliminar, Imagen en color rojo. Ajustar el tiempo de exposición para reducir al mínimo el número de píxeles saturados dentro de manchas individuales.
10. Haga clic en Analizar para adquirir y analizar la imagen de fluorescencia. El software automáticamente colocará unMDR-TB grid-ensayo específico sobre la imagen, extraer intensidad integrada y valores de fondo, e informar los resultados de resistencia a los medicamentos y de genotipificación. El análisis automatizado normalmente tarda unos segundos. Para imágenes desafiantes que contienen rayaduras, polvo, artefactos fluorescentes, o daño físico a las características de microarrays, el software puede necesitar hasta 1 min para completar el análisis.
11. Una vez terminado el análisis, haga clic en Guardar, seleccione la carpeta de destino, escriba un nombre de archivo y haga clic en Aceptar. Microarrays de datos subyacentes se guardan como un archivo xls. Y pueden ser exportados para análisis fuera de línea, si lo desea.
12. Una vez que el análisis haya finalizado, retire los microarrays de amplificación de la cámara termográfica, y haga clic en Nuevo para iniciar el siguiente análisis.
13. Cuando haya terminado la recolección de datos, cierre el software, apague el ordenador y apague el reproductor de imágenes.

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Resultados

Análisis de imágenes cualitativa puede dar una idea de las fuentes de ruido experimental o variabilidad que son difíciles de identificar en las tablas de datos generados por el software automatizado de análisis de imágenes. Por lo tanto, puede ser útil para comprobar visualmente que 1) todos los elementos de gel están intactos y en buen estado, 2) el fondo mundial está libre de artefactos fluorescentes que pueden afectar señal individual a ruido (SNR) valores, 3) no hay evidencia para la formación de burbujas ...

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Discusión

La medida de multiplexación con una micromatriz de amplificación es dictado en última instancia por la eficiencia de la PCR asimétrica múltiplex, no el microarray. En nuestra experiencia, 10 a 12 pares de cebadores únicos pueden ser multiplexados fácilmente en un formato de microarrays de amplificación. Por lo tanto, criterios de cebador y sonda de diseño convencionales se aplican a los nuevos ensayos, excepto que también se debe tener en cuenta las posibles interacciones entre ácidos nucleicos en fase de sol...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips	Akonni Biosystems	Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus	Qiagen	#206143
Taq polymerase	Qiagen	#201207
RNAse-free water	Qiagen	#206143
Formamide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	#3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix	Akonni Biosystems	Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control	Akonni Biosystems	Inquire
20X SSPE	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#BP1328-4
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#BP151-500
Disinfecting Spray	Current Technologies, Inc.	#BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol	Decon Labs, Inc.	#8416
Microarray imager, with automated image and data analysis software	Akonni Biosystems	100-20011
Thermal cycler with flat block insert	Akonni Biosystems	100-10021
High-throughput wash station and slide holder	ArrayIt	HTW
Dissecting forceps	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#10-300
Mini Vortexer	VWR	#3365040
Mini-centrifuge	VWR	#93000-196
Airbrush Compressor Kit	Central Pneumatic	#95630