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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un microarray amplificazione combina asimmetrica amplificazione PCR e ibridazione microarray in una sola camera, che semplifica significativamente workflow microarray per l'utente finale. La semplificazione del flusso di lavoro microarray è un primo passo necessario per la creazione di sistemi diagnostici basati su microarray, che possono essere utilizzati di routine in ambienti inferiore di risorse.

Abstract

La semplificazione del flusso di lavoro microarray è un primo passo necessario per la creazione di sistemi diagnostici basati su microarray-MDR-TB che possono essere utilizzati di routine in ambienti inferiore di risorse. Un microarray di amplificazione combina asimmetrica PCR, selezione del formato di destinazione, l'etichettatura di destinazione e microarray ibridazione all'interno di un'unica soluzione e in una sola camera microfluidica. Un metodo di elaborazione batch è dimostrato con un 9-plex master mix asimmetrico e bassa densità elemento gel microarray per la genotipizzazione multi-droga Mycobacterium tuberculosis resistenti (MDR-TB). Il protocollo qui descritto può essere completato in 6 ore e fornire corretta genotipizzazione con almeno 1.000 equivalenti cellulari di DNA genomico. Incorporando on-chip fasi di lavaggio è fattibile, che si tradurrà in un metodo amplicone interamente chiuso e sistema. Il grado di multiplazione con un microarray amplificazione è in definitiva limitata dal numero di coppie di primer che possono essere combinati in un unico master mix e ancora ottenere una sensibilità desiderata e metriche di performance specificità, piuttosto che il numero di sonde che sono immobilizzati sulla matrice. Allo stesso modo, il tempo di analisi totale può essere accorciato o allungato in funzione dell'uso specifico previsto, domanda di ricerca, e limiti desiderati di rilevamento. Tuttavia, l'approccio generale semplifica notevolmente workflow microarray per l'utente finale, riducendo il numero di fasi di elaborazione manualmente intensivo e richiede tempo, e fornisce un percorso biochimico e microfluidica semplificata per tradurre diagnostici basati su microarray nella pratica clinica di routine.

Introduzione

Rilevamento caso precoce e un trattamento rapido sono considerate le strategie di controllo più efficaci per ridurre Mycobacterium tuberculosis (MTB) trasmissione 1, e ora c'è un ampio consenso nella comunità TB che un punto di assistenza (POC) o in prossimità POC test per diagnosticare contemporaneamente TB ed è necessaria resistenza ai farmaci (DR). Tecnologie come GeneXpert di Cefeidi e di altri test di amplificazione degli acidi nucleici riducono il tempo di diagnosi per molti pazienti affetti da tubercolosi, e di fornire una rapida read-out che indica la resistenza alla rifampicina o mutazioni selezionate che conferiscono resistenza agli altri prima o farmaci di seconda linea 2. Sebbene i test di amplificazione in tempo reale e di acido nucleico isotermica sono progettati per identificare le mutazioni di resistenza ai farmaci che portano a MDR-TB, lo spettro di mutazioni che scoprono è spesso insufficiente per progettare un regime individualizzato farmaco corrispondente al profilo farmacoresistenza del paziente, e vincoli tecnici connessidi ottica cross-talk o la complessità di amplificazione e di reporting chimiche 3-7 maggio limitare il numero di loci o mutazioni che vengono rilevati. Così, tecnologie di rilevazione con una maggiore capacità di multiplexing sono necessari per colmare le lacune note nella diagnostica POC MDR-TB.

Microarray e le Hain saggi sonda linea OMS-omologati possono affrontare il "gene multipla, mutazioni multiple" sfida di diagnosticare MDR-TB 8-29. Purtroppo, questi, piattaforme di rilevamento multiplex a base di ibridazione-usano più fasi, complicato, e protocolli open-ampliconi che richiedono una formazione significativa e competenza in tecniche molecolari. Il microarray di amplificazione 30 è stato progettato per affrontare alcuni di questi microarray flusso di lavoro e le preoccupazioni operative. I principi fluidici di semplificazione sono per amplificare, ibridare, e individuare gli obiettivi di acido nucleico all'interno di una singola camera di microfluidica. L'utente introduce i mas acidi e amplificazione dell'acido nucleicoter miscela in una camera fluidico con una pipetta e attiva il protocollo di cicli termici. Per il metodo di elaborazione batch mostrato qui, microarrays sono successivamente lavati in soluzione bulk, essiccati, e ripreso. Questo studio dimostra la funzionalità di un microarray di amplificazione mediante test di MDR-TB microarray per rpoB (30 mutazioni), katG (2 mutazioni), inhA (4 mutazioni), rpsL (2 mutazioni), embB (1 mutazione), IS1245, IS6110 , e un amplificazione interna e controllo ibridazione. Almeno una coppia di sonde microarray (di tipo selvatico (WT) e single-nucleotide mutanti (MU)) è incluso per ogni mutazione di interesse. Acidi nucleici purificati da multi-farmaco resistente M. tubercolosi sono dal ceppo TDR Tubercolosi Bank 31. Microarrays elemento Gel sono realizzati su substrati di vetro per copolimerizzazione essenzialmente come descritto altrove 32, tranne che usiamo 4% monomero e 0,05 mm ciascuna sonda nel polymerizmiscela zione. Array sono circondati da una guarnizione 50 ml prima dell'uso. Dopo cicli termici, di ibridazione e di lavaggio gradini, microarrays amplificazione vengono esposte su un analizzatore portatile Akonni. , Intensità di segnale integrati Sfondo correzione sono ottenuti dal greggio. Immagini tif utilizzando un algoritmo cerchio fisso. Rumore per ciascun elemento gel è calcolato come tre volte la deviazione standard degli sfondi posto locale. Obiettivi del gene sono in genere considerati rilevabile per il rapporto segnale-rumore (SNR) valori ≥ 3. Per determinare la presenza o l'assenza di una specifica mutazione in ogni gene o codone, un rapporto discriminante è calcolato dai valori SNR (WT-MU) / (WT + MU). Rapporti discriminanti <0 sono indicativi di un farmaco-resistenza mutazione al locus, mentre i rapporti> 0 sono indicativi della sequenza wild-type.

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Protocollo

Per i laboratori che seguono le precauzioni universali della PCR, è operativamente più efficace per includere diversi microarrays di amplificazione e guarnizioni per substrato e lavare tutti i microarrays amplificazione simultaneamente in un contenitore di massa, come descritto qui. Formati di consumo sono disponibili per l'esecuzione di post-amplificazione passi microarray di lavaggio in modo del tutto sigillato, prova amplicone chiuso, come riportato altrove 30,33.

1. Setup

  1. Estrarre e purificare acidi nucleici dal campione in appropriate condizioni di biosicurezza con un metodo di scelta. Il requisito è che gli acidi nucleici essere di purezza sufficiente per asimmetrica, multiplex PCR.
  2. Preparare lavoro pulendo le superfici e le attrezzature con soluzioni decontaminanti.
  3. Mettere reagenti di amplificazione in ghiaccio o piastra fredda.
  4. Etichettare una sterile provetta da microcentrifuga 1,5 ml per il master mix di amplificazione, e etichettare una sterile 0,2 ml microcentrifuga tuessere per ciascun campione.
  5. Dopo reagenti vengono scongelate, brevemente vortice e raccolgono contenuto al fondo della provetta con un impulso-spin in una mini-centrifuga. Non vortice Taq polimerasi. Flick delicatamente il tubo per mescolare e seguire con un impulso-spin in mini-centrifuga.
  6. Preparare una master mix di amplificazione utilizzando i volumi ogni campione di reazione mostrati in Tabella 1. Per tenere conto di eventuali imprecisioni pipettaggio, preparare almeno un altro volume di reazione rispetto al numero totale di campioni in lavorazione. Si noti che il master mix contenente ulteriori Taq polimerasi, al di là di quanto previsto con il tampone PCR muliplex. Aggiungere solo il controllo di amplificazione / inibizione per il mix master dopo tutti gli altri reagenti sono combinati, ei tubi stock reagenti restituiti allo stoccaggio.
Reagente Per-Sample Volume (ml) Finale []
Mulitplex PCR Buffer con HotStar Taq Plus. 25 1x
Albumina di siero bovino (BSA) 0.55 0,6 mg / ml
Formammide 3.8 7,6%
Taq polimerasi aggiuntive 0.8 unità / ml (4 unità totale)
MDR-TB miscela di primer 15.75 -
RNase-free H 2 O 2.1 -
Amplificazione / Inibizione controllo 1 5,0 fg / pl
Totale 49

Tabella 1. MDR-TB amplificazione microarray maestro di composizione della miscela.

  1. Vortex il master mix e raccogliere contenuti al fondo della provetta con un impulso-spin in una mini-centrifuga.
  2. Combina 49 ml di master mix e 1 ml di M. tubercolosi DNA per ciascuna delle provette per campioni dal punto 1.4, sopra. Per un esterno, nessun controllo template (NTC), usare 1 ml di acqua per biologia molecolare al posto del M. tubercolosi campione di DNA. Vortex e impulso-spin tubo (s) una volta terminato.

2. Caricare Amplificazione Microarray

  1. Aggiungere 48 ml di ogni master mix / campione sul centro dei rispettivi microarrays, facendo attenzione a non toccare il microarray stessa.
  2. Posizionare un vetrino sulla parte superiore della guarnizione di microarray e di tenuta, facendo attenzione a non intrappolare bolle d'aria nella camera di microarray. Le bolle d'aria possono influenzare negativamente l'efficienza di amplificazionee possono creare artefatti o rumore nell'immagine microarray successivo in.

3. Ciclismo termica

  1. Una volta che tutti i microarrays vengono caricati con campione, posto substrati sul termociclatore blocco piatto. Assicurarsi che l'opzione coperchio riscaldato è "Off". Attrezzature ottenute da Akonni Biosystems sarà già prequalified per l'uso. In caso contrario, è molto importante verificare che il termociclatore blocco piatto (s) fornire (s) uniforme, riscaldamento coerente in tutti i substrati di microarray.
  2. Aprire il software termociclatore, selezionare il programma appropriato, immettere "50 microlitri" per il volume di reazione e avviare la corsa. Il protocollo cicli termici qui descritto è costituito da:
    Cicli termici Steps
    1 88 ° C 5 min
    2 88 ° C 30 sec
    3 55 ° C 1 min
    4 65 ° C 30 sec
    5 Ripetere i passaggi (2-4) per 50 cicli
    6 65 ° C 3 min
    7 55 ° C 3 ore
  3. Il numero totale di cicli termici e 55 ° C dopo l'amplificazione tempo di mantenimento sono variabili indipendenti che l'utente può modificare, se necessario o opportuno per l'esperimento specifico. Poiché il master mix MDR-TB crea asimmetrici amplificati (prevalentemente a singolo filamento), di solito è utile includere più cicli termici che altrimenti potrebbero essere utilizzati per un esponenziale protocollo di amplificazione PCR convenzionale.
  4. Quando il programma ciclismo e ibridazione termico è completa, terminare il programma, rimuovere i microarrays amplificazione, chiudere il software, e spegnere il termociclatore (s).

4. Wash and Dry

  1. Per il lavaggio fino a 24 supporti contemporaneamente, preparare almeno 250 ml 1x PESS - 0,1% Triton X-100 tampone di lavaggio, e due contenitori con almeno 250 ml di acqua deionizzata o grado Milli-Q ciascuno. Il tampone di lavaggio può essere preparato in anticipo.
  2. Rimuovere con cautela la polizza di copertura e la guarnizione di ogni amplificazione camera di microarray usando pinze flat-end. Questo passo è il punto in cui c'è il maggior rischio di danneggiare fisicamente array di elementi gel. Utilizzare adeguati controlli di contaminazione PCR per prevenire la diffusione degli acidi nucleici amplificati all'interno dell'ambiente di lavoro.
  3. Mettere substrati microarray in un supporto istologia diapositive e inserire tutte le diapositive nel cestino di lavaggio contenente il tampone di lavaggio. Coprire il contenitore con un coperchio.
  4. Lavare microarray per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione.
  5. Immergere i microarrays tre volte in ciascuna delle due lavaggi successivi di deionizzata oAcqua di grado Milli-Q, e aria secca.

5. Imaging

Il asimmetrica miscela di innesco MDR-TB genera ampliconi Cy3-etichettati. Microarrays elementi Gel può essere ripreso con qualsiasi imager microarray livello in grado di immagini Cy3. La seguente procedura di imaging è specifica per il mix MDR-TB maestro, campo dx2100 imager portatile e software di analisi automatizzata fornito da Akonni.

  1. Assicurarsi che il cavo ethernet dalla termocamera è collegata al computer.
  2. Accendere la termocamera. L'interruttore di alimentazione si trova sul pannello posteriore dello strumento. LED blu sulla parte anteriore della termocamera si accendono quando imager è acceso.
  3. Accendere il computer.
  4. Sul desktop del computer, fare doppio clic sull'icona del software per lanciare il software automatizzato di analisi delle immagini.
  5. Attendere che il software per stabilire una connessione con la fotocamera imager. Una volta stabilita la connessione, il pulsante Analizza diventa disponibile, e ilmessaggio "Connection Successful" apparirà nell'angolo in basso a sinistra dello schermo.
  6. Inserire il microarray di amplificazione essiccato con il microarray rivolto verso l'utente, e verso la lente obiettivo. Se il microarray è correttamente orientato rispetto alla lente e telecamera, il software di analisi automatizzata mancherà di inserire una griglia l'immagine di fluorescenza su.
  7. Chiudere lo sportello di accesso. Una anteprima immagine sarà disponibile sullo schermo del computer.
  8. Selezionare lo script analisi MDR-TB dal menu a tendina e inserire il tempo di esposizione desiderato (in millisecondi). Un tipico punto di partenza per elementi gel microarrays amplificazione è 100-500 msec.
  9. Pixel saturi verranno visualizzati l'immagine di anteprima in rosso. Regolare il tempo di esposizione per ridurre al minimo il numero di pixel saturi all'interno dei singoli punti.
  10. Fare clic su Analizza per acquisire e analizzare l'immagine di fluorescenza. Il software metterà automaticamente unMDR-TB griglia specifica-test sull'immagine, estrarre intensità integrata e valori di fondo, e riferire i risultati resistenza ai farmaci e genotipizzazione. L'analisi automatizzata in genere richiedere alcuni secondi. Per le immagini stimolanti che contengono graffi, polvere, artefatti a fluorescenza o danni fisici alle caratteristiche microarray, il software può richiedere fino a 1 minuto per completare l'analisi.
  11. Una volta completata l'analisi, fare clic su Salva, selezionare la cartella di destinazione, digitare un nome di file e fare clic su OK. Dati di microarray sottostanti vengono salvati come file xls. E possono essere esportati per analisi off-line, se lo si desidera.
  12. Una volta completata l'analisi, rimuovere il microarray di amplificazione dal imager, e fare clic su Nuovo per avviare l'analisi successiva.
  13. Al termine la raccolta dei dati, chiudere il software, spegnere il computer e spegnere l'imager.

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Risultati

Analisi di immagine qualitativa può fornire indicazioni in fonti di rumore sperimentale o variabilità che sono difficili da individuare in tabelle di dati generati dal software automatizzato di analisi di immagine. Quindi, può essere utile verificare visivamente che: 1) tutti gli elementi gel sono integro e non danneggiato, 2) lo sfondo globale è esente da artefatti fluorescenti che possono influenzare il segnale individuo a valori di rumore (SNR), 3) non vi è alcuna prova di formazione di bolle o non uniforme di a...

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Discussione

Il grado di multiplazione con un microarray amplificazione è infine dettata dall'efficienza del multiplex PCR asimmetrica, non microarray. Nella nostra esperienza, 10-12 coppie di primer uniche possono essere facilmente multiplexing in un formato di amplificazione microarray. Criteri di progettazione di primer e sonde convenzionali applicano a nuovi saggi, salvo che uno deve anche considerare potenziali interazioni tra acidi nucleici soluzione monofase e sonde immobilizzate microarray, l'efficienza termica del ...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) in concessione RC3 AI089106.

Acidi nucleici MDR-TB sono stati forniti dal / Mondo del Programma delle Nazioni Unite Programma di sviluppo Fund / Nazioni Unite Banca / Organizzazione Mondiale della Sanità Speciale per la Ricerca e la Formazione in malattie tropicali (TDR), Ginevra, Svizzera.

Ringraziamo il Dr. Tom Shinnick dei Centri statunitensi per il Controllo e la Prevenzione delle malattie per indicazioni sui geni e mutazioni specifiche da includere nel test del prototipo.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slipsAkonni BiosystemsInquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plusQiagen#206143
Taq polymeraseQiagen#201207
RNAse-free waterQiagen#206143 
FormamideThermo Fisher Scientific, Inc.#BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich#3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mixAkonni BiosystemsInquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition controlAkonni BiosystemsInquire
20X SSPEThermo Fisher Scientific, Inc.#BP1328-4
Triton X-100Thermo Fisher Scientific, Inc.#BP151-500
Disinfecting Spray Current Technologies, Inc.#BRSPRAY128
70% Isopropyl AlcoholDecon Labs, Inc.#8416
Microarray imager, with automated image and data analysis softwareAkonni Biosystems100-20011
Thermal cycler with flat block insertAkonni Biosystems100-10021
High-throughput wash station and slide holderArrayItHTW
Dissecting forcepsThermo Fisher Scientific, Inc.#10-300
Mini VortexerVWR#3365040
Mini-centrifugeVWR#93000-196
Airbrush Compressor KitCentral Pneumatic#95630

Riferimenti

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