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  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un microréseau d'amplification asymétrique combine l'amplification par PCR et l'hybridation microarray dans une seule chambre, qui simplifie considérablement microarray flux de travail pour l'utilisateur final. Simplifier microarray flux de travail est une première étape nécessaire pour la création de diagnostics des biopuces qui peuvent être utilisées en routine dans des environnements à faibles ressources.

Résumé

Simplifier microarray flux de travail est une première étape nécessaire pour la création de MDR-TB diagnostic des biopuces qui peuvent être utilisées en routine dans des environnements à faibles ressources. Un microréseau d'amplification combine amplification PCR asymétrique, la sélection de la taille de la cible, l'étiquetage cible, et microarray hybridation dans une solution unique et dans une seule chambre microfluidique. Une méthode de traitement par lots est démontrée avec un mélange maître asymétrique 9 complexes et à faible densité élément de gel pour le génotypage microréseau multi-drogue Mycobacterium tuberculosis résistantes (MDR-TB). Le protocole décrit ici peut être complété en 6 heures et fournir correct génotypage d'au moins 1 000 équivalents cellulaires d'ADN génomique. L'intégration sur puce des étapes de lavage est possible, qui se traduira par une méthode d'amplicon entièrement clos et système. L'étendue de multiplexage avec un microréseau d'amplification est finalement limitée par le nombre de paires d'amorces qui peuvent être combinés en un seul maître mix et encore obtenir une sensibilité désirée et des mesures de performance de spécificité, plutôt que le nombre de sondes qui sont immobilisées sur la matrice. De même, le temps total d'analyse peut être raccourcie ou allongée en fonction de l'utilisation spécifique prévue, question de recherche, et les limites souhaitées de détection. Néanmoins, l'approche générale simplifie considérablement microarray flux de travail pour l'utilisateur final en réduisant le nombre d'étapes manuellement intensives et longues traitement, et fournit une voie biochimique et microfluidique simplifiée pour traduire diagnostic des biopuces dans la pratique clinique de routine.

Introduction

La détection précoce des cas et un traitement rapide sont considérés comme des stratégies de lutte les plus efficaces pour réduire Mycobacterium tuberculosis (MTB) transmission 1, et il est maintenant un large consensus dans la communauté de la tuberculose que d'un point de service (PDS) ou près de test de POC pour diagnostiquer simultanément la tuberculose et la résistance aux médicaments (DR) est nécessaire. Les technologies telles que GeneXpert de Cepheid et autres tests d'amplification des acides nucléiques de réduire le temps de diagnostic pour de nombreux patients atteints de tuberculose, et fournissent une lecture rapide indique la résistance à la rifampicine ou mutations sélectionnées conférant une résistance à d'autres médicaments de première ou deuxième ligne 2. Bien que les tests d'amplification en temps réel et de l'acide nucléique isotherme sont conçus pour identifier les mutations de résistance aux médicaments qui mènent à la TB-MR, le spectre des mutations qu'ils détectent est souvent insuffisante pour concevoir un schéma thérapeutique individualisé correspondant au profil de résistance aux médicaments du patient, et les contraintes techniques liéesà la diaphonie optique ou de la complexité de l'amplification et de reporting chimiques 3 au 7 mai limiter le nombre de loci ou des mutations qui sont détectés. Ainsi, les technologies de détection avec une capacité de multiplexage élevé sont nécessaires pour combler les lacunes connues dans le diagnostic de TB-MR au PS.

Les puces à ADN et les Hain essais de sonde de la ligne approuvée par l'OMS peuvent répondre à la «gène multiple, multiples mutations" défi de diagnostiquer la TB-MR 8-29. Malheureusement, ces plates-formes, de détection multiplex à base d'hybridation utilisent plusieurs étapes, compliqué, et les protocoles ouverts amplicon qui exigent une formation importante et la maîtrise des techniques moléculaires. L'amplification microréseau 30 a été conçu pour répondre à certaines de ces puces à ADN flux de travail et des problèmes opérationnels. Les principes fluidiques sont simplificatrices pour amplifier, s'hybrident, et détecter des cibles d'acides nucléiques dans une seule chambre microfluidique. L'utilisateur introduit les acides nucléiques et d'amplification master mélanger dans une chambre fluidique avec une pipette et commence le protocole de cycle thermique. Pour la méthode de traitement par lots représenté ici, les microréseaux sont ensuite lavées dans une solution en vrac, séchées et imagés. Cette étude démontre la fonctionnalité d'un microréseau d'amplification à l'aide d'un test de TB-MR microarray pour rpoB (30 mutations), katG (2 mutations), inhA (4 mutations), rpsL (2 mutations), embB (1 mutation), IS1245, IS6110 , et une amplification interne et de contrôle de l'hybridation. Au moins une paire appariée de microréseau de sondes (type sauvage (WT) et mutantes de nucléotide unique (MU)) est inclus pour chaque mutation d'intérêt. Acides nucléiques purifiés à partir de multi-drogue M. résistant la tuberculose sont de la souche TDR tuberculose 31 Banque. puces d'éléments de gel sont fabriqués sur des substrats de verre par copolymérisation essentiellement comme décrit par ailleurs 32, sauf que nous utilisons 4% de monomère et 0,05 mM chaque sonde dans le polymérisablesmélange d'ation. Les tableaux sont entourés d'un joint de 50 ml avant l'utilisation. Après cyclage thermique, hybridation et lavage étapes, les puces d'amplification sont visualisés sur un analyseur portable Akonni. Fond corrigée, les intensités de signaux intégrés sont obtenus à partir de la première. Images tif en utilisant un algorithme de cercle fixe. Bruit pour chaque élément en gel est égale à trois fois l'écart type des milieux de tache locales. cibles de gènes sont généralement considérés comme détectable pour le rapport signal sur bruit (SNR) des valeurs ≥ 3. Afin de déterminer la présence ou l'absence d'une mutation spécifique dans chaque gène ou codon, un rapport discriminant est calculée à partir des valeurs de SNR que (WT-MU) / (WT + MU). Ratios discriminants <0 sont indicatifs d'une mutation de résistance aux médicaments au niveau du locus, tandis que les ratios> 0 sont indicatifs de la séquence de type sauvage.

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Protocole

Pour les laboratoires qui suivent les consignes de PCR universelle, il est opérationnel plus efficace d'inclure plusieurs puces d'amplification et joints par substrat et laver tous les puces d'amplification simultanément dans un conteneur, comme décrit ici. Formats consommables sont disponibles pour effectuer des post-amplification microarray étapes de lavage dans un test d'amplicon fermée entièrement scellé, comme rapporté ailleurs 30,33.

1. Configuration

  1. Extraire et de purifier des acides nucléiques à partir de l'échantillon dans des conditions de sécurité biologique appropriées avec une méthode de choix. L'exigence est que les acides nucléiques être d'une pureté suffisante pour asymétrique amplification, PCR multiplex.
  2. Préparer l'espace de travail en essuyant les surfaces et l'équipement avec des solutions de décontamination.
  3. Placer les réactifs d'amplification sur la glace ou bloc froid.
  4. Etiqueter un tube de 1,5 ml centrifuger stérile pour le mélange maître d'amplification, et étiqueter un stérile de 0,2 ml centrifuger tusoit pour chaque échantillon.
  5. Après réactifs sont décongelées, vortex brièvement et de recueillir le contenu au fond du tube avec une impulsion de spin dans une mini-centrifugeuse. Ne pas vortex la Taq polymérase. Tapotez doucement le tube pour mélanger et de suivre avec une impulsion de spin dans la mini-centrifugeuse.
  6. Préparer un mélange maître d'amplification en utilisant les volumes par-échantillon réactionnelles indiquées dans le tableau 1. Afin de tenir compte des imprécisions possibles de pipetage, préparer au moins un volume de réaction de plus que le nombre total d'échantillons en cours de traitement. Notez que le mélange maître contient plus Taq polymérase, au-delà de ce qui est prévu avec le tampon muliplex PCR. Seulement ajouter le contrôle d'amplification / d'inhibition au mélange maître après tous les autres réactifs sont combinés, et les tubes stock réactifs renvoyée au stockage.
Réactif Volume par-échantillon (pl) Finale []
PCR Buffer Mulitplex avec HotStar Taq plus 25 1x
albumine de sérum bovin (BSA) 0,55 0,6 mg / ml
Formamide 3.8 7,6%
Taq polymérase supplémentaires 0,8 unités / pl (4 unités au total)
MDR-TB mélange d'amorces 15.75 -
RNase-H 2 O 2.1 -
Amplification / Contrôle inhibition 1 5.0 fg / pl
Total 49

La composition du mélange tableau 1. MDR-TB amplification microarray maître.

  1. Vortex le mélange maître et de recueillir le contenu au fond du tube avec une impulsion de spin dans une mini-centrifugeuse.
  2. Mélanger 49 pi de mélange maître et 1 pl de M. ADN de la tuberculose à chacun des tubes échantillons issus de l'étape 1.4 ci-dessus. Pour une externe, pas de contrôle de modèle (NTC), utiliser une pi d'eau moléculaire de qualité de biologie à la place de la M. tuberculose échantillon d'ADN. Vortex et impulsion de spin tube (s) lorsque vous avez terminé.

2. Chargez amplification puces à ADN

  1. Ajouter 48 ul de chaque Master Mix / échantillon sur le centre de leurs puces respectives, en faisant attention de ne pas toucher la puce elle-même.
  2. Placez une lamelle sur le dessus de la garniture de puces à ADN et le joint, en faisant attention à ne pas coincer les bulles d'air dans la chambre de puces à ADN. Des bulles d'air peuvent affecter négativement l'efficacité d'amplificationet peut créer des artefacts ou de bruit dans l'image de puces à ADN ultérieure.

3. Cycle thermique

  1. Une fois toutes les puces sont chargés de l'échantillon, le lieu substrats sur le cycleur thermique de bloc plat. Assurez-vous que l'option chauffée de couvercle est en position "Off". Équipement obtenu de Akonni Biosystems sera déjà préqualifiés pour utilisation. Sinon, il est très important de vérifier que le cycleur thermique de bloc plat (s) donne (nt) uniforme, chauffage uniforme dans tous les supports de puces à ADN.
  2. Ouvrez le logiciel de cycleur thermique, sélectionnez le programme approprié, entrez "50 pl" pour le volume de réaction, et de lancer la course. Le protocole de cyclage thermique décrit ici se compose de:
    Thermiques étapes à vélo
    1 88 ° C 5 min
    2 88 ° C 30 sec
    3 55 ° C 1 min
    4 65 ° C 30 sec
    5 Répétez les étapes (2-4) pendant 50 cycles
    6 65 ° C 3 min
    7 55 ° C 3 heures
  3. Le nombre total de cycles thermiques et 55 ° C l'après-amplification temps d'attente sont des variables indépendantes que l'utilisateur peut modifier, si nécessaire ou approprié pour l'expérience spécifique. Parce que le mélange maître TB-MR crée asymétriques amplicons (principalement simple brin), il est généralement utile d'inclure des cycles thermiques plus que, autrement, pourraient être utilisés pour un protocole d'amplification exponentielle classique, PCR.
  4. Lorsque le programme de cyclisme et l'hybridation thermique est terminée, la fin du programme, retirez les puces d'amplification, fermez le logiciel, et éteignez le cycleur (s) thermique.

4. Laver et sécher

  1. Pour le lavage jusqu'à 24 substrats simultanément, préparer au moins 250 ml 1x SSPE - 0,1% de Triton X-100 du tampon de lavage, et deux conteneurs avec au moins 250 ml d'eau désionisée ou de qualité Milli-Q chacun. Le tampon de lavage peut être préparé à l'avance.
  2. Retirez délicatement la lamelle et le joint de chaque chambre de microréseau d'amplification en utilisant une pince plate-end. Cette étape est le moment où il est le plus grand risque de causer de blessures réseaux d'éléments de gel. Utiliser les contrôles de contamination PCR appropriées pour prévenir la propagation des acides nucléiques amplifiés à l'intérieur de l'environnement de travail.
  3. Placez substrats de puces à ADN dans un support histologie de diapositives, et placer toutes les diapositives dans le bac de lavage contenant le tampon de lavage. Couvrir le récipient avec un couvercle.
  4. Laver microarrays pendant 10 min à température ambiante avec agitation douce.
  5. Tremper les puces trois fois dans chacune des deux lavages successifs de déminéralisée ouEau de qualité Milli-Q, et l'air sec.

5. Imaging

Le mélange d'amorces asymétrique MDR-TB génère amplicons Cy3 marqués. puces d'éléments de gel peuvent être visualisés avec n'importe quel imageur microarray norme capable de l'imagerie Cy3. La procédure d'imagerie suivante est spécifique pour le mélange maître TB-MR, domaine Dx2100 imageur portable et un logiciel d'analyse automatisée fournie par Akonni.

  1. Assurez-vous que le câble Ethernet de l'imageur est connecté à l'ordinateur.
  2. Tournez sur l'imageur. L'interrupteur d'alimentation est situé sur le panneau arrière de l'instrument. La LED bleue sur le devant de la caméra s'allume lorsque imageur est sous tension.
  3. Allumez l'ordinateur.
  4. Sur le bureau de l'ordinateur, double-cliquez sur l'icône du logiciel pour lancer le logiciel d'analyse d'image automatisée.
  5. Attendez que le logiciel pour établir une connexion avec l'appareil photo de l'imageur. Une fois la connexion établie, le bouton Analyser devient disponible, et lamessage «Connexion réussie» apparaît dans le coin inférieur gauche de l'écran.
  6. Insérer la puce d'amplification séché avec le microréseau opposé à l'utilisateur, et en direction de la lentille d'objectif. Si la puce n'est pas correctement orientée par rapport à la lentille et de la caméra, le logiciel d'analyse automatisé échoue à placer une grille sur l'image de fluorescence.
  7. Fermez la porte d'accès. Un aperçu sera disponible sur l'écran d'ordinateur.
  8. Sélectionnez le script d'analyse de TB-MR dans le menu déroulant et entrez le temps de l'exposition souhaitée (en millisecondes). Un point de départ typique pour élément de gel puces d'amplification est 100-500 ms.
  9. Pixels saturés seront affichés sur l'image de prévisualisation en rouge. Ajuster le temps d'exposition afin de minimiser le nombre de pixels à l'intérieur de spots saturés individuels.
  10. Cliquer Analyser à acquérir et à analyser l'image de fluorescence. Le logiciel placera automatiquement uneMDR-TB réseau spécifique au test sur l'image, extraire intensité intégrée et des valeurs de fond, et de faire rapport résistance aux médicaments et de génotypage des résultats. L'analyse automatique prend généralement quelques secondes. Pour les images difficiles qui contiennent des rayures, de la poussière, des objets fluorescents ou des dommages physiques aux caractéristiques de puces à ADN, le logiciel peut nécessiter jusqu'à 1 min pour compléter l'analyse.
  11. Une fois l'analyse terminée, cliquez sur Enregistrer, sélectionnez le dossier de destination, tapez un nom de fichier, et cliquez sur OK. Données de biopuces sous-jacents sont enregistrées dans un fichier xls. Et peuvent être exportés pour des analyses hors ligne, si désiré.
  12. Une fois l'analyse terminée, retirez la puce d'amplification de l'imageur, et cliquez sur Nouveau pour lancer l'analyse suivante.
  13. Lorsque vous avez terminé la collecte de données, fermez le logiciel, éteignez l'ordinateur, et d'éteindre la caméra.

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Résultats

Analyse d'image qualitative peut donner un aperçu des sources de bruit ou de la variabilité expérimentale qui sont difficile à identifier dans les tableaux de données générés par un logiciel automatisé d'analyse d'image. Ainsi, il peut être utile de visuellement s'assurer que 1) tous les éléments de gel sont intacts et en bon état, 2) le contexte mondial est sans artefacts fluorescents qui pourraient affecter signal individuel de bruit SNR) de valeurs (3) il n'existe aucune preuve pour l...

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Discussion

L'étendue de multiplexage avec un microréseau d'amplification est finalement dictée par l'efficacité de la PCR multiplex asymétrique, et non le microréseau. Dans notre expérience, 10-12 paires d'amorces uniques peuvent être facilement multiplexés dans un format amplification de puces à ADN. Critères d'amorces et de conception de la sonde classiques s'appliquent donc à de nouveaux essais, à l'exception que l'on doit aussi tenir compte des interactions potentielles entre les ac...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) sous subvention RC3 AI089106.

Acides nucléiques de MDR-TB ont été fournis par le Fonds / développement des Nations Unies Programme / Banque mondiale / Organisation mondiale de la Santé Programme spécial des Nations Unies pour l'enfance pour la recherche et la formation concernant les maladies tropicales (TDR), Genève, Suisse.

Nous remercions le Dr Tom Shinnick des US Centers for Disease Control and Prevention des indications sur les gènes et les mutations spécifiques à inclure dans le test de prototype.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slipsAkonni BiosystemsInquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plusQiagen#206143
Taq polymeraseQiagen#201207
RNAse-free waterQiagen#206143 
FormamideThermo Fisher Scientific, Inc.#BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich#3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mixAkonni BiosystemsInquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition controlAkonni BiosystemsInquire
20X SSPEThermo Fisher Scientific, Inc.#BP1328-4
Triton X-100Thermo Fisher Scientific, Inc.#BP151-500
Disinfecting Spray Current Technologies, Inc.#BRSPRAY128
70% Isopropyl AlcoholDecon Labs, Inc.#8416
Microarray imager, with automated image and data analysis softwareAkonni Biosystems100-20011
Thermal cycler with flat block insertAkonni Biosystems100-10021
High-throughput wash station and slide holderArrayItHTW
Dissecting forcepsThermo Fisher Scientific, Inc.#10-300
Mini VortexerVWR#3365040
Mini-centrifugeVWR#93000-196
Airbrush Compressor KitCentral Pneumatic#95630

Références

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