Hacia Biomimicking Madera: Fabricada en monobloque películas de nanocellulose, lignina, y una Policatión sintético

Resumen

El objetivo de esta investigación fue formar tejido de la pared celular vegetal sintético usando asamblea capa por capa de fibrillas nanocellulose y aislada lignina montado a partir de suspensiones acuosas diluidas. Se han usado técnicas de medición de la superficie de la microbalanza de cristal de cuarzo y microscopía de fuerza atómica para monitorizar la formación del material nanocompuesto de polímero-polímero.

Resumen

Materiales de madera se componen de paredes celulares de las plantas que contienen una pared celular secundaria en capas compuesto por polímeros estructurales de los polisacáridos y la lignina. Se utilizó proceso de ensamblaje capa por capa (LBL) que se basa en el ensamblaje de moléculas de carga opuesta a partir de soluciones acuosas para construir una película de material compuesto autoportante de polímeros de madera aislados de la lignina y la celulosa oxidada nanofibrillas (NFC). Para facilitar el montaje de estos polímeros cargados negativamente, un polielectrolito cargado positivamente, poli (cloruro de diallyldimethylammomium) (PDDA), fue utilizado como una capa de enlace para crear esta pared celular modelo simplificado. El proceso de adsorción en capas se estudió cuantitativamente usando microbalanza de cristal de cuarzo con monitorización de disipación (QCM-D) y elipsometría. Los resultados mostraron que la masa capa / espesor por capa adsorbida aumenta como una función del número total de capas. La cobertura de la superficie de las capas adsorbidas se estudió con microscopía de fuerza atómica (AFM).La cobertura completa de la superficie con la lignina en todos los ciclos de deposición se encontró para el sistema, sin embargo, la cobertura de la superficie por la NFC aumentó con el número de capas. El proceso de adsorción se llevó a cabo durante 250 ciclos (500 bicapas) en un acetato de celulosa (CA) sustrato. Se obtuvieron LBL montado películas de nanocompuestos exentas transparentes cuando el sustrato CA se disolvió luego en acetona. Microscopía electrónica de barrido (SEM) de las secciones transversales fracturados mostró una estructura laminar, y el espesor por ciclo de adsorción (PDDA-lignina-PDDA-NC) se estimó en 17 nm para dos tipos diferentes de lignina utilizados en el estudio. Los datos indican una película con arquitectura altamente controlado donde nanocellulose y lignina se depositan espacialmente en la escala nanométrica (un nanocompuestos de polímero-polímero), similar a lo que se observa en la pared celular nativa.

Introducción

Hay un gran interés para obtener productos químicos y combustibles adicionales a partir de biomasa, como el carbono secuestrado por las plantas durante la fotosíntesis es parte del ciclo actual de CO _2. La mayoría de carbono secuestrado (42-44%) es en la forma de celulosa, un polímero compuesto de unidades de glucopiranosa β 1-4-vinculados; cuando se hidroliza, la glucosa se puede utilizar como reactivo primario para la fermentación en combustibles a base de alcohol. Sin embargo, la arquitectura de la pared celular de las plantas leñosas ha evolucionado durante miles de años, creando un material que es resistente a la degradación en el medio ambiente natural ^1. Esta estabilidad se traslada a la transformación industrial de los materiales leñosos, tales como los cultivos energéticos que hacen de celulosa de difícil acceso, aislar y desglose en glucosa. Una mirada más cercana a la ultraestructura de la pared celular secundaria revela que es un nanocompuesto de polímero compuesta de microfibrillas de celulosa paracristalina capas incrustadas en una matriz amorfa de la lignina y el dobladilloicelluloses ^2-4. Las microfibrillas de celulosa orientadas longitudinalmente tienen un diámetro de aproximadamente 2-5 nm, que se agregan junto con otros hetero-polisacáridos para formar unidades más grandes de los haces de fibrillas ^5. Los haces de fibrillas están incrustados en un complejo lignina-hemicelulosa compuesta de un polímero amorfo de unidades fenilpropanol con algunos vínculos con otros hetero-polisacáridos como glucoronoxylan ^4. Además, esta estructura se organiza además en capas, o laminillas, a lo largo de la pared celular secundaria lignificada ^6-8. Las enzimas, tales como celulasas, tienen un tiempo muy difícil acceder a celulosa dentro de la pared celular tal como se encuentra en su forma de fibrillas y incrustado en lignina. El quid de lo que verdaderamente combustibles de base biológica y plataformas químicas renovables una realidad es el desarrollo de procesos que permitan económicamente la sacarificación de la celulosa en su forma nativa.

Las nuevas tecnologías químicas y de imagen están ayudando en la víaudy de los mecanismos implicados en la sacarificación de la celulosa ^9,10. Gran parte del trabajo se ha centrado en la formación de imágenes confocal Raman ¹¹ y microscopía de fuerza atómica ¹² para estudiar la composición química de la pared celular y la morfología. Ser capaz de seguir de cerca los mecanismos de deslignificación y sacarificación es un paso adelante significativo, impactando la conversión de la celulosa en glucosa. Sacarificación de superficies de celulosa modelo se analizó por medición de las tasas de cinética enzimática con una microbalanza de cristal de cuarzo con monitorización de disipación (QCM-D) ^13. Sin embargo, las paredes celulares nativas son muy complejos como se indica anteriormente, y esto crea ambigüedad de cómo los diferentes procesos de conversión de cambiar la estructura de la pared celular vegetal (peso molecular del polímero, enlaces químicos, la porosidad). Modelos autoportantes de las sustancias de la pared celular de composición estructural conocido abordarían esta preocupación y permitir la integración de muestras en química y la imaginación del estado-de-arteequipos ng.

Hay una escasez de modelos de pared celular y los pocos disponibles se pueden clasificar como mezclas de materiales poliméricos y celulosa o celulosa bacteriana ^14, composites polimerizados enzimática de lignina polisacárido ^15-17, o las superficies del modelo ^18-21 regenerados. Algunos modelos que comienzan a parecerse a la pared celular son las muestras que contienen precursores o análogos polimerizados enzimáticamente en presencia de celulosa en su forma microfibrilar lignina. Sin embargo, estos materiales sufren de la falta de la arquitectura de capa organizada. Una ruta simple para la creación de materiales nanocompuestos con la arquitectura organizada es el (LBL) técnica de capa por capa de ensamblaje, basado en la adsorción secuencial de polímeros o nanopartículas con cargas complementarias o grupos funcionales para formar películas de material compuesto de varias capas organizadas ^22-25. Nanocompuestos híbridos autoportantes de alta resistencia, realizados por LbL deposición de polímero y nanoparticles, han sido reportados por Kotov et al. ^26-30. Entre muchas otras aplicaciones, películas LbL también han sido investigados para su uso potencial en el suministro terapéutico ^31, las membranas de células de combustible ^32,33, baterías ^34, y lignocelulósico ^35-37 modificación de la superficie de la fibra. Materiales compuestos El reciente interés en celulosa nanoescala basados ​​han conducido a la preparación y caracterización de multicapas LbL de nanocristales de celulosa (CNC) preparados por hidrólisis de ácido sulfúrico de fibras de celulosa, y polielectrolitos cargados positivamente ^38-43. Estudios similares también se han llevado a cabo con nanocristales de celulosa obtenidas de tunicina marina y polielectrolitos catiónicos ^44, CNC y xiloglucano ⁴⁵ y CNC y quitosano ^46. LbL formación de múltiples capas de celulosas carboxilados nanofibrillated (SNF), obtenidas por homogeneización a alta presión de fibras de pasta con polielectrolitos catiónicos también ha sidoestudiado ^47-49. La preparación, propiedades y aplicaciones de los CNC y celulosa nanofibrillated se han revisado en detalle ^50-53.

El presente estudio consiste en el examen de la técnica LbL como una forma potencial de montar polímeros lignocelulósicos aislados (como nanocellulose y lignina) de forma ordenada como el primer paso hacia un compuesto lignocelulósico biomimético con estructura laminar. La técnica LbL fue seleccionado para sus condiciones de procesamiento benignos tales como, la temperatura ambiente, la presión, y el agua como el disolvente, que son condiciones para la formación de material compuesto natural de ^54. En este estudio nos informe sobre la multicapa acumulación de componentes de madera constitutivos, a saber microfibrillas de celulosa a partir de la 1-tetrametilpiperidina oxilo (TEMPO) oxidación mediada de la pulpa y el aislado de lignina en películas laminares exentas. Dos ligninas diferentes se utilizan de diferentes técnicas de extracción, uno de una lignina técnica de la organosolv proceso de fabricación de pasta, y el otro un lignina aislada de un molino de bolas con menos modificaciones durante el aislamiento. Estos compuestos se combinan con un polielectrolito sintético en este estudio inicial para demostrar la viabilidad de la realización de películas exentas estables con arquitectura similar a la pared celular nativo.

Protocolo

1. Nanofibrillated Celulosa Preparación ⁵⁵

1. Configuración de un 3 L matraz de tres cuellos con 2 L de agua desionizada, un agitador superior, y sonda de pH.
2. Añadir la pulpa deslignificada Kraft, 88% de brillo (20 g, 1% (w / v, base de peso seco)), 2,2,6,6-tetrametilpiperidina 1-oxilo (TEMPO) (0,313 g, 0,1 mmoles / g de celulosa) , y bromuro de sodio (NaBr, 2,0 g, 1 mmol / g de celulosa) en el matraz.
   1. Mezclar la fibra de la pasta con el agitador de cabeza hasta que la fibra se dispersa y no hay agregados se puede ver en la reacción.
      Nota: La dispersión puede ser ayudado mediante la mezcla de la suspensión en agua antes de la adición de la pulpa en el matraz de 3 L.
3. Iniciar la oxidación por adición lenta de una solución 12% de hipoclorito de sodio (NaClO, 51,4 ml, 5 mmol por g de celulosa) a la mezcla de reacción.
   Nota: Para la consistencia a lo largo de la reacción, utilizar una bomba de jeringa para entregar el NaClO con una velocidad de inyección de 1,5 ml / min.
4. Llene una segunda wi jeringahidróxido º de sodio (NaOH, 0,5 M) y metro manualmente la solución de álcali en el matraz gota a gota para mantener el pH a 10 ± 0,2.
5. Monitorear el cambio en el pH con el tiempo y una vez que se oxidan todos los grupos hidroxilo accesibles sobre la celulosa el pH ya no disminuye y la reacción es completa.
6. Añadir el exceso de EtOH para consumir restante de NaClO. Aproximadamente 6 ml de prueba 200 EtOH consumirán todos 100 mmol del NaClO originales.
7. Filtrar y lavar la fibra oxidada a fondo con agua purificada para eliminar los reactivos hasta que el pH es neutro. Utilice una centrífuga de cesta o algún dispositivo de filtración como un embudo Büchner para recuperar la fibra. Almacenar la fibra a 4 ° C hasta su uso posterior.
   Nota: En la terminación del experimento, la fibra debe tener un contenido de ácido carboxílico, tal como se determina mediante valoración conductimétrica, entre 1,0 a 1,5 mmol por gramo de fibra. Debe haber poca diferencia en la apariencia de la fibra después de la oxidación TEMPO.
8. Crear un 3% (W / V, base de peso seco) de suspensión de la pulpa oxidada de TEMPO y se mezclan en un mezclador Warring hasta que la suspensión se vuelve viscosa y las cuchillas empiecen a girar en el aire debido a la gelificación de la suspensión.
   Nota: Las concentraciones más bajas no funcionan tan eficazmente para fibrilar la celulosa.
   1. Diluir la suspensión mezclada a 0,1% (w / v) y continuar mezclando hasta que la suspensión se vuelve transparente.

2. Deposición capa por capa de película para experimentos QCM-D

1. Preparar las siguientes soluciones acuosas y ajustar cada solución con 0,1 M de NaOH a un pH de 10,5: solución tampón acuosa (agua y NaOH); 0.5% (w / v) de solución acuosa de cloruro de polidialildimetilamonio (PDDA); y 0,01% (w / v) de lignina. Ajustar el pH de la suspensión de la NFC 0,1% a 8,0.
   Nota: El pH para estos experimentos fue elevado, ya que se había demostrado que la lignina se adsorbe en un estado menos agregado en pH alcalino ^56.
2. Limpioun cristal de cuarzo recubierto de oro tras la recomendación del fabricante de la utilización de una solución Piranha base de [PRECAUCIÓN] (03:01 _NH4OH concentrado: H ₂ O ₂ a 60 ° C) durante 10 min.
   1. Enjuague los cristales con agua purificada, secar en una corriente de N _2, e insertar inmediatamente en la célula de flujo de microbalanza de cristal de cuarzo para evitar la contaminación del aire.
3. Pasar el tampón a través de la celda de flujo para obtener una respuesta de línea de base del cristal resonante expuesta al líquido.
   1. Depositar una capa de PDDA sobre el cristal de cuarzo mediante la exposición del cristal de cuarzo a la solución PDDA durante 5 min.
   2. Después de 5 min cambiar de nuevo a la solución tampón.
      Nota: Este proceso en el paso 2.3 crea una respuesta única capa donde la cantidad de polímero depositado puede ser determinada sin el efecto de la viscosidad de la solución de polímero.
   3. Repita la adsorción de otros polímeros en la siguiente secuencia con un tampón de rinseguridad entre cada paso: PDDA (+) (paso 2.3.1); lignina (-); PDDA (+); y NFC (-). Repita los 4x de ciclo para depositar 16 capas totales de polímeros y nanopartículas.

3. Deposición capa por capa de película por AFM y Elipsometría Experimentos

1. Pegar un disco circular de la mica a un portaobjetos de microscopio de vidrio usando un adhesivo epoxi rápida. Después el adhesivo se cura, coloque un pedazo de cinta adhesiva en el disco de mica. Pele la cinta de distancia haciendo que la superficie de la mica para escindir.
   1. Limpie una oblea de silicio con pirañas ácido [ATENCIÓN] (03:01 H ₂ SO ₄ H ₂ O ₂₎ durante 20 minutos seguido de un enjuague significativo en agua antes de la capa de deposición.
2. Con las soluciones preparadas en 2.1, sumergir ya sea la mica recién cortado que se une a un portaobjetos de vidrio o una oblea de silicio recién limpiada en cada solución siguiendo la misma secuencia de protocolo descrito en 2.3.3.
   Nota: Esta técnica creará capas de POlymers sobre cada una de estas superficies que se pueden insertar en el AFM o elipsómetro, respectivamente.
3. Imagen de las capas depositadas con un microscopio de fuerza atómica. Utilice el modo de contacto intermitente y voladizos con 10 puntas de silicona radio nm (primavera constante 42 N / m) en la recogida de imágenes de la muestra. Establezca el tamaño de escaneo como 2,5 x 2,5 m, el punto de exploración como 512 y la ganancia integral de 10 para recoger imágenes de muestra específicos.
4. Para la medición del espesor de las capas con AFM de las películas LbL secos, use una punta de pipeta de plástico blando y la cicatriz de una línea a través de la superficie de las películas LbL preparado sobre la superficie de la mica.
5. Películas fuerte LBL para la medición de elipsometría en obleas de silicio. Mida el espesor de película seca con una fase elipsómetro modulada a una longitud de onda de 632,8 nm, utilizando el ángulo múltiplo de modo incidencia. Varíe los ángulos entre 85 º y 65 º en intervalos de 1 °.

4. Preparación de autoportante LBL Cine

1. Corte un25.4 x 7.6 mm rectángulo de acetato de celulosa (CA) película (DS 2,5), que es de 0,13 mm de espesor y se unen a balancín automatizado.
   Nota: El acetato de celulosa de 3,0 DS no es soluble en acetona de modo DS 2.5 se prefiere para recuperar las películas en capas.
2. Llene cada vaso de precipitados de 500 ml con soluciones de PDDA, lignina, y nanocellulose de acuerdo a la concentración y el pH en el paso 2.1.
   1. Llenar tres vasos de precipitados adicionales con tampón acuoso para utilizar como una solución de enjuague para cada ciclo de deposición.
   2. Programar el brazo de la cuchara de proceder en la misma secuencia como se indica en 2.3.3.
      Nota: Es importante utilizar una solución de aclarado diferente después de cada solución de polímero respectiva, porque en el proceso de capa por capa, algún polímero que no está fuertemente unido a la superficie se desorber. La contaminación cruzada de las soluciones de enjuague provoca rápidamente la precipitación de complejos de polielectrolitos, que pueden adsorber como "defectos" a la superficie de la película.
3. Cambie las soluciones en elvaso de precipitados durante 250 ciclos periódicamente a medida que comienzan a aparecer turbia debido a los complejos coloidales. Una opción es automatizar la renovación de la solución mediante el uso de la bomba peristáltica para entregar una solución fresca o tampón de cloruro de polivinilo (PVC) de contenedores a medida con entradas y salidas.
   Nota: soluciones agitados en los contenedores ayudan a mejorar la difusión de los polielectrolitos a la superficie.
4. Recorte con cuidado los bordes de la muestra seca con tijeras exponiendo el borde CA y coloque en un plato de Petri de vidrio cubierto lleno de acetona para disolver el CA.
   Nota: Las dos películas están aislados después de este experimento de la parte delantera y trasera de la CA.
5. Remoje las películas aisladas en acetona durante 24 horas y enjuague películas repetidamente con acetona para maximizar la eliminación de CA residual.

Resultados

QCM-D Análisis de Structured Fabrication Woody Película de polímero

La adsorción LbL de la lignina, NFC y PDDA se monitorizó en tiempo real con QCM-D en dos experimentos diferentes que implican dos tipos de ligninas. Este método de análisis es muy sensible para detectar cambios en la frecuencia cuando las moléculas se adsorben a la superficie del cristal de cuarzo La Figura 1 contiene una descripción detallada de la respuesta QCM-D en un ciclo de deposición, que impli...

Discusión

Fabricación de nanocellulose

Para la fabricación nanocellulose es necesaria la oxidación con éxito de la fibra de la pasta para la fibrilación fácil. La oxidación es controlada por hipoclorito de sodio disponible, que debe añadirse lentamente en cantidades conocidas sobre la base de la cantidad de celulosa. Una de las razones para la oxidación limitada surge desde el almacenamiento de la solución de hipoclorito de sodio durante períodos prolongados. Esta eficiencia de oxidación redu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sulfate pulp	Weyerhaeuser	donated	brightness level of 88%
Organosolv lignin	Sigma Aldrich	371017	discontinued
Hardwood milled wood lignin	see reference in paper
Polydiallyldimethylammonium chloride	Sigma Aldrich	409022	Mn = 7.2 x 104, Mw = 2.4 x 105
2,2,6,6-Tetramethylpiperidine 1-oxyl (TEMPO)	Sigma Aldrich	214000	catalytic oxidation of primary alcohols to aldehydes with a purity of 98%, molecular weight is 156.25 g/mol
Sodium bromide	Sigma Aldrich	S4547	purity ≥99.0%, molecular weight 102.89
Sodium hypochlorite	Sigma Aldrich	425044	reagent grade, available chlorine 10~15%, molecular weight 74.44 g/mol
Sodium hydroxide	VWR	BDH7221-4	0.5 N aqueous solution, density 1.02 g/ml, molecular weight 40 g/mol
Sodium hydroxide	Acros Organics	AC12419-0010	0.1 N aquesous solution, specific gravity 1.0 g/ml, molecular weight 40 g/mol
Ammonium hydroxide	Acros Organics	AC39003-0025	25% solution in water, pH 13.6, density 0.89, molecular weight 35.04 g/mol
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H325-100	30.0~32.0% certified ACS, pH 3.3, density 1.11
Mica sheets	TED Pella	NC9655733	Pelco, grade V5, 10 x 40 mm, 23 mm T, minimum air and bubbles, very clean
Sulfuric acid	Fisher Scientific	A300-212	95.0~98.0 w/w%, certified ACS plus, molecular weight 98.08 g/mol
Cellulose acetate	McMaster Carr	8564K44	degree of substitution 2.5
Ethanol	Decon Laboratories	04-355-223	200 proof (100%), USP
[header]
Acetone	Fisher Scientific	A18-4	purity ≥99.5%, certified ACS reagent grade, density 0.79 g/ml, molecular weight 58.08 g/mol
Syringe pump	Harvard Apparatus	552226	pump 22 infusion/withdraw with standard syringe holder, flow rate 0.002 μl/hr~55.1 ml/min
Mill-Q water purification system	EMD Millipore	D3-UV	Direct-Q, UV, water conductivity 18.5 MΩ·cm with 20 L reservoir
pH meter	Mettler Toledo		SeverMulti
Balance	Mettler Toledo	AB135-S	accuracy 0.1 mg
Atomic force microscope	Asylum Research		MFP-3D, Olympic fluorescent microscope stage
Ellipsometer	Beaglehole Instruments
Fiber centrifuge	unknown		basket style centrifuge
Waring blender	Waring		Commercial
Ultrasonic processor	Sonics		Sonics 750 W, sound enclosure
Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D)	Q-Sense Inc.	E4	measure fundamental frequency of 5 MHz, and monitor odd number overtones/harmonics from 3~13, use gold-coated piezoelectric quartz crystals
Automatted dipper arm	Lynxmotion