Ultrasonido Diagnóstico por la Imagen de la función del ratón del diafragma

Resumen

De imágenes de ultrasonido de diagnóstico ha demostrado ser eficaz en el diagnóstico de diversas enfermedades respiratorias en sujetos humanos y animales. Demostramos un protocolo integral de ultrasonido utilizado por el laboratorio del Dr. Zuo para analizar la cinética de diafragma específicamente en modelos de ratón. Esta es también una técnica de investigación no invasiva que puede proporcionar información cuantitativa sobre la función de los músculos respiratorios ratón.

Resumen

Análisis de funciones de los músculos esqueléticos respiratorios de roedores, en particular el diafragma, se realiza comúnmente mediante el aislamiento de tiras de músculo usando los procedimientos quirúrgicos invasivos. Aunque este es un método eficaz de evaluar la actividad in vitro de diafragma, que consiste en una cirugía no supervivencia. La aplicación de imágenes por ultrasonido no invasiva como un procedimiento in vivo es beneficioso, ya que no sólo reduce el número de animales sacrificados, pero también es adecuado para el seguimiento de la progresión de la enfermedad en ratones vivos. Por lo tanto, nuestro método de formación de imágenes de ultrasonido puede probablemente ayudará en el desarrollo de nuevas terapias que alivian lesión muscular inducida por diversas enfermedades respiratorias. En particular, en los diagnósticos clínicos de las enfermedades pulmonares obstructivas, imágenes de ultrasonido tiene el potencial de ser utilizado en conjunción con otras pruebas estándar para detectar la aparición temprana de la fatiga del músculo del diafragma. En el protocolo actual, se describe la forma de evaluar con precisión contracti diafragmadad en un modelo de ratón utilizando una técnica de imágenes de ultrasonido de diagnóstico.

Introducción

Recientemente, las técnicas de imagen de ultrasonido de diagnóstico se han aplicado a modelos de ratón de la hipertensión renovascular y ^1,2 del cáncer de páncreas. Sin embargo, estas técnicas no han sido ampliamente utilizados en el ensayo de la función de los músculos respiratorios de roedores. Por lo tanto, hemos desarrollado un método de imagen de ultrasonido de diagnóstico como una herramienta valiosa para las evaluaciones longitudinales en vivo de la movilidad del diafragma en ratones.

Hay varias ventajas de la ecografía diagnóstica. Por ejemplo, no es invasiva, segura, portátil y permite mediciones en tiempo real a un costo relativamente bajo ^3. En particular, algunos dispositivos de ultrasonido de baja frecuencia fueron capaces de detectar el atrapamiento de aire, una característica clínica de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) leve a severa limitación del flujo aéreo ^4. Por lo tanto, de formación de imágenes de ultrasonidos de diagnóstico puede servir como un método de cribado fácilmente accesible y reproducible para la monitorización en tiempo real de trastornos respiratorios.

Las técnicas de imagen de ultrasonido de diagnóstico se aplican con frecuencia a los animales más grandes o los sujetos humanos. Sin embargo, ha habido un número limitado de estudios de imágenes de ultrasonido en modelos de ratones, lo cual es probable que se deba a los desafíos de la realización de la ecografía en temas de pequeña escala. El protocolo actual describe un procedimiento novedoso para la medición de la función de diafragma en el ratón. Además, aunque se han realizado varios estudios con roedores sobre la función de diafragma, la mayor parte de los resultados se generaron mediante el aislamiento de tiras de músculo directamente desde el animal sacrificado ^5-7. En contraste, el uso de un método de formación de imágenes de ultrasonidos de diagnóstico in vivo para analizar la actividad de diafragma disminuiría el número de animales sacrificados para la experimentación. Por otra parte, los tratamientos a largo plazo centradas en ampliar la contractilidad diafragmática pueden evaluar con precisión a través de ultrasonido en modelos de roedores sin sacrificar animales.

ntent "> En nuestro laboratorio, hemos desarrollado un método eficaz para la visualización y análisis de la actividad del diafragma de ratón utilizando una máquina de ultrasonido, que ayuda a la comprensión de la función del diafragma in vivo, evita métodos invasivos a los animales, y ayuda en el desarrollo de la terapéutica tratamientos para la disfunción respiratoria.

Protocolo

Fueron aprobados y completados de conformidad y el cumplimiento del Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad Estatal de Ohio (IACUC) los reglamentos y directrices Todos los procedimientos que involucran sujetos animales.

1. Ratón Anestesia

1. Establecer una mesa procedimiento de limpieza con una almohadilla isotérmica climatizada envuelta en una toalla quirúrgica. La almohadilla de calefacción debe mantenerse entre 30 ° C y 34 ° C para estabilizar la temperatura del núcleo del animal al tiempo que reduce el estrés potencial para el animal.
2. Coloque el ratón en una cámara de inducción de anestesia con los siguientes parámetros: tasa de flujo de oxígeno ajustado a 1.5 L / min y vaporizador de isoflurano se establece en el 3,5%. Sedación completa debe tener lugar dentro de 1-2 min. Si una cámara de inducción no está disponible, una campana de vidrio puede ser utilizado con una malla de alambre situada en la parte inferior para evitar el contacto directo con el animal de isoflurano.
3. Quitarse de inmediato el ratón desde la cámara de inducción, una vez queestá completamente anestesiado (alcanza cuando el ratón pierde la función motora voluntaria). Aplique una ojiva al animal para el mantenimiento de la anestesia. La tasa de flujo de oxígeno se debe reducir a aproximadamente 0,5 l / min y el vaporizador de isoflurano se debe establecer dentro de la gama de 1,5 a 2,5%.
   1. Aplique una pequeña cantidad de pomada oftálmica directamente a las córneas para reducir la sequedad del ojo ^8. Además, durante la anestesia, el ratón debe mantener una ausencia del reflejo de retirada pedal, las membranas mucosas deben permanecer un color rosa, y la respiración deben aparecer constante.

2. Preparación para Ultrasonido Diagnóstico Procedimiento Imaging

1. Sujetar cada pata del ratón en la mesa de procedimientos climatizada con adhesivo removible, tal como cinta quirúrgica.
2. Usando una máquina de afeitar eléctrica, quitar el pelo en la superficie ventral del cuerpo entre el abdomen y la forma media hasta la cavidad torácica. Aplicar crema de depilación a una mayor remover el resto del cabello que no se corta por la maquinilla de afeitar. Limpie la crema con una gasa húmeda después de 2-3 min.
3. Retire el exceso de vello utilizando una gasa humedecida en agua y limpiar la región de afeitado con alcohol al 70% o equivalente antiséptico. La sonda de ultrasonido se aplicará a esta zona para visualizar la función del diafragma. Un analgésico tópico puede ser proporcionada a los animales que experimentan irritación menor de la piel debido a la eliminación del vello.

3. Diagnostic Ultrasound Imaging Protocol

1. Encienda el dispositivo de ultrasonido y ajustar la potencia de salida (si es necesario) en el aparato por el porcentaje para obtener una resolución óptima.
2. Ajuste la máquina de ultrasonido a las preguntas B (brillo) de modo, M (de movimiento)-modo, o tanto antes de formación de imágenes, que permite la visualización adecuada de la contracción del diafragma de ratón.
3. Aplique una pequeña cantidad de gel de ultrasonido en el abdomen superior del ratón y masajear el gel hacia la cavidad torácica.
4. Coloca los ultratransductor de sonido en esta área y el ángulo hacia arriba en dirección al corazón. Ajustar la sonda hasta que se consigue una resolución de optimizada de la imagen. Nota: para este protocolo, una matriz de micro-convexa o transductor lineal de fases es una sonda ideal para su uso debido al tamaño reducido y una excelente resolución axial ^9; la frecuencia necesita ser ajustado a través de la anchura de banda y para estos experimentos se puede utilizar una gama de 6,5 a 12 MHz.
5. Pulse el botón de congelación para guardar temporalmente las imágenes de diafragma y ver las contracciones seleccionados.
6. Guardar la grabación como un bucle de cine, que permite mediciones posteriores de excursión diafragmática, así como la tasa de respiración. Nota: Los cuadros de imágenes se pueden guardar en la memoria del ordenador o en un disco duro externo para el análisis futuro ^9.
   1. Precisamente medir la profundidad del movimiento del diafragma de la relajación a la contracción usando los calibradores electrónicos que son parte del software de ultrasonido.
   2. Convertir elarchivo de bucle de cine en un archivo MPEG y determinar la tasa de respiración contando el número de contracciones del diafragma durante el período de registro. Por otra parte, el número de contracciones por minuto (frecuencia respiratoria) puede contarse de la imagen en modo M.

4. Publicar Anestesia Recuperación de Animales

1. El ratón debe recuperarse completamente de la anestesia en 1 hora. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.

Resultados

Una imagen de ultrasonidos típico de un diafragma de ratón se muestra en la Figura 1A. El desplazamiento vertical máxima de diafragma de ratón fue grabado. Esta distancia se calcula con precisión la medición de la profundidad de movimiento del diafragma de la relajación a la contracción usando los calibradores electrónicos que son parte del software de ultrasonido. Tabla 1 muestra estas mediciones de distancia de las contracciones del diafragma de tres ratones diferentes. Despu...

Discusión

El protocolo experimental actual desarrolla técnicas de imagen de ultrasonido de diagnóstico específicos para la actividad del diafragma en un modelo de ratón a través de una, en el enfoque no invasivo vivo. Los ajustes del equipo de anestesia son valores aproximados, que podrán ajustarse ligeramente para cada animal ya que los ratones individuo puede responder de manera diferente a la anestesia. Para evitar que la administración de la anestesia inadecuada, es importante controlar regularmente l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system	Edan	DUS 3 VET	Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol
Micro-convex array transducer	Edan	C611	Or equivalent
GE Logiq i hand-carried unit (HCU)	GE Healthcare	GE Logiq i hand-carried unit (HCU)	Or equivalent
GE 12 MHz linear array probe	GE Healthcare	12L-RS	Or equivalent
Veterinary anesthetic vaporizer	Webster Veterinary	Serial #: W422021	Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone
Isothesia (Isoflurane, USP)	Butler Schein	29405 250ML PVL	Or equivalent
Enviro-pure anesthesia absorbing canister	Surgivet Smiths Medical PM, Inc.	Part #: 32373B10	Or equivalent
Ultrasound transmission gel	HM Sonic	N/A	Or equivalent
Puralube vet ointment	Puralube	NDC 17033-211-38	Or equivalent
Deltaphase isothermal pad	Braintree Scientific Inc.	39DP	Or equivalent
Hair remover	Nair	N/A	Or equivalent
Electric razor	Remington	HC-5015	Or equivalent
Surgical tape	3M Micropore	1530-1	Or equivalent
Gauze sponges	Dynarex	3262	Or equivalent