Diagnóstico Ecografia de função de mouse Diafragma

Resumo

Imagiologia de ultra-sons de diagnóstico tem provado ser eficaz para o diagnóstico de várias doenças respiratórias, em seres humanos e animais. Nós demonstramos um protocolo ultra-som abrangente utilizado pelo laboratório do Dr. Zuo para analisar a cinética de diafragma especificamente em modelos do rato. Esta é também uma técnica de pesquisa não-invasivo, que pode fornecer informações quantitativas sobre a função de mouse da musculatura respiratória.

Resumo

A análise funcional dos músculos esqueléticos respiratórias de roedores, em particular o diafragma, é geralmente realizada através do isolamento de tiras de músculo usando procedimentos cirúrgicos invasivos. Embora este seja um método eficaz de avaliação da atividade do diafragma vitro, envolve cirurgia não-sobrevivência. A aplicação de ultra-som não-invasivo, como um processo in vivo, é benéfico, uma vez que não só reduz o número de animais sacrificados, mas é também adequado para a monitorização da progressão da doença em ratinhos vivos. Assim, o nosso método de imagem de ultra-som pode provavelmente auxiliar no desenvolvimento de novas terapias que aliviam a lesão muscular induzida por várias doenças respiratórias. Particularmente, em diagnósticos clínicos de doenças pulmonares obstrutivas, imagiologia de ultra-som tem o potencial para ser usado em conjunto com outros testes padrão para detectar o aparecimento precoce de fadiga muscular diafragma. No protocolo atual, nós descrevemos como avaliar com precisão diafragma contratilidadelidade em um modelo de camundongo usando uma técnica de imagem de ultra-som diagnóstico.

Introdução

Recentemente, técnicas de imagem de ultra-som de diagnóstico foram aplicados a modelos de ratos com hipertensão renovascular e ^1,2 câncer no pâncreas. No entanto, estas técnicas não têm sido amplamente utilizados no ensaio de função da musculatura respiratória roedor. Por isso, desenvolvemos um método de imagem de ultra-som diagnóstico como uma ferramenta valiosa para a avaliação in vivo longitudinais da mobilidade diafragmática em camundongos.

Existem várias vantagens para ultra-sonografia diagnóstica. Por exemplo, é não-invasivo, seguro, portátil, e permite medições em tempo real a um custo relativamente baixo ^3. Particularmente, certos dispositivos de ultra-som de baixa freqüência foram capazes de detectar o aprisionamento de ar, uma característica clínica da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) com leve a grave limitação do fluxo aéreo ^4. Assim, a ultra-sonografia de diagnóstico pode servir como um método de triagem de fácil acesso e reprodutível para monitoramento em tempo real de doenças respiratórias.

Técnicas de imagem de ultra-som diagnóstico são freqüentemente aplicada aos animais maiores ou seres humanos. No entanto, tem havido um número limitado de estudos de imagem de ultra-som em modelos de ratos, o que é provável, devido aos desafios da realização de ultra-som sobre assuntos de pequena escala. O protocolo atual delineia um novo procedimento para medir a função do diafragma no mouse. Além disso, embora tenha havido vários estudos com roedores para a função de diafragma, a maior parte dos resultados foram obtidos por isolamento a partir de tiras de músculo directamente o animal sacrificado ^5-7. Em contraste, utilizando um método in vivo de imagens de ultra-sons de diagnóstico para analisar a actividade do diafragma iria reduzir o número de animais sacrificados para a experimentação. Além disso, os tratamentos de longo prazo com foco em melhorar a contratilidade do diafragma pode ser avaliada com precisão através de ultra-som em modelos de roedores sem sacrificar animais.

ntent "> No nosso laboratório, foi desenvolvido um método eficaz para a visualização, bem como analisando a actividade diafragma rato utilizando uma máquina de ultra-sons, o que ajuda a compreender o funcionamento do diafragma in vivo, evita métodos invasivos para animais, e auxilia no desenvolvimento de terapêuticas tratamentos para a disfunção respiratória.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem seres animais foram aprovados e concluídos de acordo eo cumprimento do Institutional Animal Care e Use Committee Ohio State University (IACUC) regulamentos e diretrizes.

1. Rato Anestesia

1. Alterar uma tabela de procedimento de limpeza com um bloco isotérmico aquecido envolto em uma toalha cirúrgica. A almofada de aquecimento deve ser mantida entre 30 ° C e 34 ° C, para estabilizar a temperatura do núcleo do animal ao mesmo tempo reduzir o estresse potencial para o animal.
2. Posicione o mouse em uma câmara de indução anestésica com os seguintes parâmetros: taxa de fluxo de oxigênio definido para 1,5 L / min e vaporizador isoflurano definido para 3,5%. Sedação completa deve ocorrer dentro de 1-2 min. Se uma câmara de indução não está disponível, uma campânula de vidro pode ser usado com uma rede de arame posicionado na parte inferior para evitar o contacto directo com os animais do isoflurano.
3. Remover imediatamente o rato da câmara de indução, uma vez queestá completamente anestesiado (conseguido quando o mouse perde a função motora voluntária). Aplicar um nariz-cone para o animal para a manutenção da anestesia. A taxa de fluxo de oxigénio deve ser reduzida para aproximadamente 0,5 L / min e o vaporizador isoflurano deve ser mantida no intervalo de 1,5 a 2,5%.
   1. Aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica diretamente para as córneas para reduzir a secura dos olhos ^8. Além disso, durante a anestesia, o mouse deve manter uma ausência do reflexo interdigital, as mucosas deve permanecer uma cor-de-rosa, ea respiração deve aparecer constante.

2. Preparação para o diagnóstico Ecografia Procedimento

1. Contenha cada perna do mouse sobre a tabela de procedimento aquecida com um adesivo removível, como esparadrapo.
2. Usando um barbeador elétrico, retire o cabelo na superfície ventral do corpo entre o modo como abdômen e meia até a cavidade torácica. Aplicar creme de depilação para mais remover o restante do cabelo, que não é cortada pela navalha. Limpe o creme com uma gaze úmida após 2-3 min.
3. Retire o excesso de pêlos com uma gaze umedecida almofada de água e limpe a região depilada com álcool 70% ou equivalente anti-séptico. A sonda de ultra-sons irá ser aplicada a esta área para visualizar a função de diafragma. Um analgésico tópico pode ser fornecido aos animais experimentam irritação de pele menor, devido à remoção de pêlos.

3. Diagnóstico Ecografia Protocolo

1. Ligue o aparelho de ultra-som e ajustar a potência de saída (se necessário) sobre o aparelho por porcentagem para obter uma melhor resolução.
2. Configure o aparelho de ultra-som, quer B (brilho)-mode, M (movimento)-mode, ou ambos antes de imagem, que permite a visualização adequada da contração do diafragma do rato.
3. Aplique uma pequena quantidade de gel de ultra-som na parte superior do abdómen do rato e massagear o gel para a cavidade torácica.
4. Colocar os ultrasoar transdutor nesta área e ângulo-a para cima em direção ao coração. Ajustar a sonda até uma resolução optimizada da imagem é obtida. Nota: para este protocolo, uma matriz de micro-convexa ou transdutor linear em fases é uma sonda ideal para usar devido ao tamanho reduzido e excelente resolução axial ^9; a frequência precisa de ser ajustada através da largura de banda e para estas experiências pode ser utilizada uma gama de 6,5-12 MHz.
5. Pressione o botão de congelação para guardar temporariamente as imagens do diafragma e visualizar as contrações selecionados.
6. Salve a gravação como um cine loop, o que permite medições posteriores de excursão diafragmática, bem como a taxa de respiração. Nota: quadros de imagens podem ser salvas na memória do computador ou em um disco rígido externo para análise futura ^9.
   1. Precisamente medir a profundidade do movimento do diafragma de relaxamento para contração usando as pinças de eletrônicos que fazem parte do software de ultra-som.
   2. Converter aarquivo cine loop para um ficheiro MPEG e determinar a taxa de respiração através da contagem do número de contracções do diafragma durante o período de gravação. Alternativamente, o número de contracções por minuto (taxa de respiração) podem ser contadas a partir da imagem do modo-M.

4. Pós-anestésica de recuperação de animais

1. O mouse deve se recuperar completamente da anestesia dentro de 1 hora. Não deixe o animal sozinho até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.

Resultados

Uma imagem típica de uma membrana de ultra-sons do rato é mostrada na Figura 1A. O diafragma do rato deslocamento vertical máxima foi registrada. Esta distância foi calculada medindo com precisão a profundidade do movimento do diafragma de relaxamento para contração usando as pinças de eletrônicos que fazem parte do software de ultra-som. Tabela 1 apresenta essas medidas de distância de contrações do diafragma de três ratos diferentes. Depois de converter o ficheiro de cine...

Discussão

O protocolo experimental atual desenvolve técnicas de imagem de ultra-som de diagnóstico específicos para a atividade do diafragma em um modelo do rato através de uma abordagem in vivo não-invasivo,. As configurações de aparelhos de anestesia são valores aproximados, que podem ser ajustadas ligeiramente para cada animal, desde ratos indivíduo pode responder de forma diferente a anestesia. Para evitar a administração de anestesia inadequada, é importante monitorar regularmente os sinais vitais do rat...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system	Edan	DUS 3 VET	Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol
Micro-convex array transducer	Edan	C611	Or equivalent
GE Logiq i hand-carried unit (HCU)	GE Healthcare	GE Logiq i hand-carried unit (HCU)	Or equivalent
GE 12 MHz linear array probe	GE Healthcare	12L-RS	Or equivalent
Veterinary anesthetic vaporizer	Webster Veterinary	Serial #: W422021	Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone
Isothesia (Isoflurane, USP)	Butler Schein	29405 250ML PVL	Or equivalent
Enviro-pure anesthesia absorbing canister	Surgivet Smiths Medical PM, Inc.	Part #: 32373B10	Or equivalent
Ultrasound transmission gel	HM Sonic	N/A	Or equivalent
Puralube vet ointment	Puralube	NDC 17033-211-38	Or equivalent
Deltaphase isothermal pad	Braintree Scientific Inc.	39DP	Or equivalent
Hair remover	Nair	N/A	Or equivalent
Electric razor	Remington	HC-5015	Or equivalent
Surgical tape	3M Micropore	1530-1	Or equivalent
Gauze sponges	Dynarex	3262	Or equivalent