Imaging membrana plasmática Deformaciones Con pTIRFM

Resumen

Basado en polarización reflexión interna total microscopía de fluorescencia (pTIRFM) permite la detección en tiempo real de la dinámica de la membrana celular. En este artículo se describe la implementación del pTIRFM para el estudio de la remodelación de la membrana durante la exocitosis regulada. La técnica es generalizable a otros procesos en biología celular que directa o indirectamente implican cambios en la forma de la membrana.

Resumen

Para obtener nuevos conocimientos sobre la dinámica de la exocitosis, nuestro grupo se centra en los cambios en la forma de bicapa lipídica que deben ser reguladas con precisión durante la fusión de membranas de la vesícula y de plasma. Estos cambios rápidos y localizados se logran por las interacciones dinámicas entre los lípidos y las proteínas especializadas que controlan la curvatura de la membrana. La ausencia de tales interacciones no sólo tendría consecuencias devastadoras para la fusión de vesículas, pero una serie de otras funciones celulares que involucran el control de la forma de la membrana. En los últimos años, la identidad de un número de proteínas con propiedades de la membrana-conformación ha sido determinada. Lo que queda es que falta una hoja de ruta de cuándo, dónde y cómo ellos actúan como la fusión y el progreso de liberación contenido.

Nuestra comprensión de los eventos moleculares que permiten a la remodelación de la membrana históricamente ha estado limitada por la falta de métodos analíticos que son sensibles a la curvatura de la membrana o tienen la resolución temporal de track cambios rápidos. PTIRFM satisface ambos criterios. Se discute cómo se implementa pTIRFM para visualizar e interpretar cambios rápidos y submicrónicas en la orientación de las membranas de células cromafines durante vesículas de núcleo denso (DCV) de fusión. Las células cromafines que utilizamos están aisladas de las glándulas suprarrenales bovinas. La membrana se tiñe con un colorante carbocianina lipofílica, 1,1 '-dioctadecil-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-clorobencenosulfonato o hizo. DiD se intercala en el plano de la membrana con una orientación de "fija" y es por lo tanto sensible a la polarización del campo evanescente. La membrana celular teñido con DID es secuencialmente entusiasmados con polarizaciones ortogonales de un láser de 561 nm (p-pol, s-pol). Un láser de 488 nm se utiliza para visualizar constituyentes y el tiempo de vesículas el momento de la fusión. La exocitosis se desencadena por localmente perfundir células con una solución de KCl despolarizante. El análisis se realiza en línea usando software personalizado por escrito para entender cómo lo hizocambios en la intensidad de emisión se refieren a la fusión de poro dilatación.

Introducción

La correcta ejecución de la exocitosis requiere cambios extremos en forma de membrana bicapa que ser orquestado con precisión. Antes de la fusión, flexión local de la membrana de plasma bajo el gránulo se produce, en parte para reducir la barrera de energía para la interacción de bicapas. Más tarde, cuando las membranas se fusionan, las zonas de alta curvatura se generan y deben estabilizarse. Por último, las membranas fusionadas deben estar dobladas hacia fuera de su forma inicial para ampliar el poro de fusión y permitir la liberación de contenido ^1. Debido a que las membranas por sí solos son poco probable que someterse a cambios tan dramáticos y coordinadas, las proteínas son necesarias para mediar eventos. Pero su manera de actuar para influir en los cambios en la topología de la membrana durante el proceso de fusión sigue siendo en gran medida una cuestión abierta.

Excelente en modelos in vitro existen para visualizar la curvatura de la membrana. El uso de EM de tinción negativa, por ejemplo, ha sido importante para dar forma a los modelos moleculares actuales de las acciones de dos grandes tráfico proteins - sinaptotagmina y dynamin (para revisiones, ver Chapman ² y Henshaw ^3). La mayoría de los ensayos en tiempo real de exocitosis no detectan directamente curvatura. En cambio, la curvatura se infiere de ensayos que informan sobre la cinética de liberación de carga luminal ^4-8 o cambios en el área de membrana ^9-11. PTIRFM cierra la brecha entre in vivo e in vitro, permitiendo mediciones directas y en tiempo real de los cambios en la micromorfología membrana.

PTIRFM, en un modo no formador de imágenes, fue iniciado por Axelrod y sus colegas para medir la orientación de NPD-PE incorporado dentro de un modelo de membrana ^12. A continuación, la técnica se aplicó para visualizar los cambios dinámicos en las células vivas marcadas con Dil y FM1-43 ^13-18. En pTIRFM, dos polarizaciones campo evanescente se utilizan para excitar secuencialmente una sonda de membrana embebido: de polarización en p (en el plano de incidencia) y polarización s (perpendicular al plano de incidencia). Antes de la formación de imágenes, la sonda - en este caso, DID - se añade brevemente al medio extracelular y se le permite intercalar en las membranas plasmáticas de las células a ser estudiadas. En las regiones donde la membrana es no paralela a la cubreobjetos (como en un volante de membrana o indentación), el DID también será no paralela. Por lo tanto, dichas regiones serán excitables por el haz de p-Pol. El rayo p-pol excitará menos efectivamente hizo en regiones de membrana que son en su mayoría paralelas al cubreobjetos. Las imágenes de proporción píxel a píxel (P / S) la presentación de informes sobre la emisión de excitación secuencial p-y s-pol de por esta causa destacará específicamente a las regiones de la deformación de la membrana. En teoría, los P / S imágenes de proporción son sensibles incluso a pequeños ángulos de desviación de plasma membrana desde el cubreobjetos, con la amplitud de los cambios predichos por simulaciones de ordenador ^18. Imágenes P / S también son independientes de la distancia fluoróforo de la superficie cubreobjetos y fluoróforo localesconcentración. Concentración de fluoróforo local en su lugar se proporciona imágenes que informan sobre la suma píxel a píxel de la emisión de P y 2 veces la emisión de S (P 2 S). La medición 2 S P es sensible a la geometría precisa de la indentación, con algo, poco, o ningún cambio posible. Esto se puede demostrar mediante simulaciones por ordenador que las transiciones de modelo de un poro de fusión desde una temprana (es decir, con un cuello estrecho) a un estado posterior ^16,18. El P 2 S de una vesícula fusionado unido a la membrana plasmática a través de un cuello estrecho (y con más hizo cerca de la interfaz) se prevé que sea mayor, por ejemplo, que la de una vesícula fusionado con un poro mucho más amplio (donde el DID es dentro de la parte más remota del campo evanescente).

En este artículo se discute cómo se implementa y se utiliza para el estudio de los cambios rápidos y localizados en forma de la membrana que se producen durante la fusión de poro dilatación pTIRFM. Mientras que una sola aplicación es explícitamente discussed, los métodos son generalizables a una variedad de otros procesos biológicos celulares que directa o indirectamente implican la remodelación de la membrana.

Protocolo

1. Configuración del sistema PTIRF

La técnica pTIRFM está construido sobre una plataforma de microscopio invertido. Los rayos láser se dirigen a través de un puerto de iluminación lateral y un cubo de filtro orientados hacia los lados nonpolarizing, y luego enfocada sobre el plano focal posterior de un objetivo de 60X 1,49 NA TIRF. Dos lentes adicionales (1.6X y 2X) en la trayectoria de emisión entre el microscopio y cámara EMCCD dan un tamaño final de píxel de aproximadamente 80 nm. Los rayos láser son guiados mediante software controlado espejos de galvanómetro para la conmutación rápida entre la reflexión interna epi-y total (TIR) ​​de iluminación. El protocolo descrito a continuación supone que la óptica para TIRF ya están colocados en la mesa de aire en las posiciones óptimas para la excitación del fluoróforo y de formación de imágenes. Se describe cómo se añaden óptica de polarización a un microscopio TIRF configuración existente para permitir de formación de imágenes de las deformaciones de la membrana celular. Un esquema de óptica puesta a punto de nuestro laboratorio para generar tanto TIR y polarizatTIR a base de iones se muestra en la Figura 1A. El protocolo supone el uso de un láser de 488 nm para la excitación de proteínas de vesículas fluorescentes y un láser de 561 nm para la proyección de imagen del colorante de carbocianina, DID.

1. Encienda todos los componentes del microscopio, rayos láser y computadoras.
2. Dirigir un haz procedente del láser de 488 nm con el plano focal posterior (BFP) de la lente 1,49 NA como se ilustra en la Figura 1A. Si el haz de láser se enfoca en el BFP, surgirá colimado y aparecer como pequeño punto bien definido en el techo directamente por encima del objetivo.
3. Ajuste el espejo de galvanómetro X (el espejo situado en el plano de la muestra equivalente) de manera que el haz de láser se mueve fuera del eje y sale por el objetivo en ángulos progresivamente más inclinadas respecto a la normal objetivo.
4. A continuación, compruebe que TIR se logra. Añadir 10 l de microesferas fluorescentes para un volumen de 1 ml de PSS en un plato con fondo de cristal. Sólo fluorescencia de microesferas en la parte inferior of el plato, el más cercano a la interfaz de TIR, se debe detectar. La detección de microesferas flotantes indica que el ángulo entre la luz incidente y objetivo normal es insuficiente.
   
   La siguiente sección describe la configuración de los componentes ópticos necesarios para la proyección de imagen basada en la polarización.
5. El uso de la viga 488 nm alineado como una guía, ajustar la posición del haz de láser de 561 nm en bruto por lo que se desplaza a lo largo de una trayectoria óptica idéntica. El láser de 561 nm se utiliza para obtener imágenes del colorante carbocianina, lo hizo.
6. Inserte una lente divergente y espejos de aguas abajo del láser de 561 nm. El uso de los espejos, ajustar el haz de modo que se coalineado con el haz de 488 nm y el punto es enfocado en el techo cuando los espejos de galvanómetro están en la posición "0".
7. Centrar una placa de cuarto de onda (QW) en la trayectoria del haz inmediatamente aguas abajo de la abertura del láser. Utilice un QW, que es ya sea acromático o sintonizado a la longitud de onda de excitación.A QW se circularmente polarizar cualquier luz linealmente polarizada que entra en un ángulo de 45 ° con el eje óptico. Algunos de los componentes ópticos, tales como los cubos de polarización, tienen un sesgo de atenuación hacia un eje de polarización. El QW se puede girar para compensar este sesgo. Este ajuste se traducirá en un haz polarizada elípticamente. Un QW es necesario porque el propio rayo láser es altamente polarizada linealmente (verticalmente) a medida que emerge de la abertura.
8. Coloque un cubo de polarización (PC1) aguas abajo de la viga polarizada elípticamente. El cubo de polarización refleja la (a) componente vertical del campo eléctrico y pasa el (x) componente horizontal. El cubo de polarización se coloca en una pequeña etapa de traducción para facilitar la posterior alineación de trayectorias de rayos de polarización.
9. Utilice un segundo cubo de polarización (PC2) y los espejos (Figura 1A) para recombinar los haces.
10. Coloque un obturador entre el primer cubo de polarización (PC1) y el co verticalesespejo mponent. Coloque un segundo obturador entre el espejo componente horizontal y el segundo cubo de polarización (PC2). Estos obturadores están controlados por el software de imágenes que permite al usuario seleccionar rápidamente entre polarizaciones de haz.
11. Utilice un filtro de polarización para verificar la orientación del campo eléctrico en cada trayectoria del haz. Un filtro polarizador sólo permitirá la transmisión en línea con el eje del filtro.
12. Compruebe que los componentes vertical y horizontal del haz de láser están alineados entre sí y el haz de 488 nm. Haga los ajustes necesarios. Los tres haces todos deben ser enfocados en el BFP y emergen colimado desde el objetivo al mismo punto en el techo. Este lugar puede ser marcado con una X para facilitar la alineación futuro.
13. Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el objetivo. Coloque el plato que contiene microesferas fluorescentes (ver paso 4) en el objetivo.
14. Introduzca TIR moviendo el espejo X galvanómetro. En TIR, el Componen verticalesT de la viga es la s-pol y el componente horizontal del haz es ahora el p-Pol. Ajustar la intensidad relativa entre las vigas mediante la rotación de la placa de QW. Ver cada campo evanescente polarizado con una muestra de rodamina, que se prevé que ser orientadas al azar. Gire la placa de QW para que coincida con las intensidades medias de píxeles. Si es necesario, agregue un filtro de densidad neutra en una trayectoria del haz polarizado para atenuar su intensidad.

2. Aislamiento de células cromafines

A continuación se proporciona un procedimiento para aislar células cromafines sanos de la glándula suprarrenal de ternera. Está adaptado de protocolos publicados previamente por Wick, Senter, et al. ¹⁹ y O'Connor, Mahata et al. ²⁰ Después del aislamiento, las células se sometieron a electroporación con el plásmido (s) de interés usando un sistema de electroporación. Resultados de este sistema en el 20-30% de las células que expresan las proteínas fluorescentes deseadas. Por lo general, el 70% de las células sobreviven a los elegidosproceso roporation. Los detalles de los componentes de PSS y los medios de comunicación se proporcionan en las Tablas 2, 3 y 4.

1. Dos días antes de la preparación de células, el tratamiento de 35 mm de calidad óptica platos de vidrio inferior (0,17 mm de espesor) con 1 ml de poli-D-lisina (0,1 mg / ml) seguido de 1,25 ml de colágeno bovino. Deja los platos se sequen al aire en el tejido campana de cultivo.
2. Obtener las glándulas suprarrenales bovinas del matadero. Mantenga las glándulas en el hielo mientras son transportados de vuelta al laboratorio. Las glándulas suprarrenales bovinas pueden ser encerradas en una gruesa capa de grasa. Utilice tijeras quirúrgicas para eliminar el exceso de grasa y exponer la apertura de la vena adrenal. Perfundir la vena con prep-PSS repetidamente hasta que la glándula se purga de sangre.
3. A continuación, con la pipeta lentamente 2 ml de solución de TH-PSS en la abertura de la vena hasta que el oleaje de la glándula. Incubar las glándulas inflados a 37 ° C durante 15 min. Repetir el tratamiento TH-PSS y se incuba de nuevo.
4. Corte a través de la corteza suprarrenal exterior alrededor del borde de la glándula con stijeras rojo y piel de la glándula aparte para exponer la médula. Utilice un bisturí para raspar suavemente y separar la médula a partir del tejido cortical.
5. Picar la médula con un par de hojas de bisturí de 5-10 min.
6. Una etapa de digestión final es necesario aislar las células cromafines individuales. Se vierte la suspensión de células picada en un matraz de agitación. Llenar parcialmente el matraz con una proporción de 2:1 de TH-PSS (30 ml) a TL-PSS (15 ml) y se incuba durante 30 min a 37 ° C mientras se hace girar a aproximadamente 100 rpm.
7. Separar las células cromafines individuales a partir de tejido no digerido por filtración a través de una malla de 400 micras. Recoger el filtrado. Centrifugar a 200 xg para sedimentar las células, y resuspender en hielo PSS frío.
8. Filtrar las células a través de una malla de 250 micras, de pellets, y, finalmente, volver a suspender en tampón de electroporación (véase el paso 2.9).
9. Contar las células usando un hemocitómetro y prepararse para la transfección.
10. Transfectar células con el sistema de electroporación de acuerdo conrecomendaciones del fabricante. Las condiciones precisas de la electroporación deben determinarse empíricamente. Nota: Los ajustes que proporcionan el mejor equilibrio entre la eficiencia de la transfección y tasa de supervivencia de las células de esta preparación de células bovinas cromafines son 1100 V, 40 ms y 1 pulso. Estimamos que con estas condiciones, el 20-30% de las células son transfectadas. Alrededor del 30% de las células no sobreviven el proceso de electroporación.
11. Células de la placa suavemente sobre poli-D-lisina y colágeno tratados platos en 1 ml de medio de electroporación calentado.
12. Coloque los platos en una incubadora a 37 ° C (5% de CO _2). Añadir 1 ml de medio con antibióticos 2x para cada plato después de 6 horas. Cambie los medios de comunicación a los medios normales al día siguiente.
13. Las células cromafines son típicamente reflejados 2-5 días después de la electroporación.

3. pTIRF Image Acquisition

1. Encienda el sistema de imagen e inicie el software de adquisición.
2. Verifique que los láseres están alineados. Compruebe evanescentePerfil de campo utilizando microesferas.
3. Prepare el sistema de perfusión global y local. Depósitos de solución limpias con filtrada desionizada H ₂ O y se llenan de basal y estimular soluciones PSS.
4. Antes de imágenes de células cromafines, verificar que las excitaciones de p-pol y s-pol iluminan la misma región del campo de visión y que las intensidades de iluminación son aproximadamente equivalentes. Para ello, llenar un plato con fondo de vidrio con 2 ml de PSS contienen rodamina a una concentración final de 10 mM. Secuencialmente excitar la muestra rodamina con p-pol y la luz s-pol y capturar las imágenes. En la práctica, las emisiones de P y S de DID se normalizan a la media de la P y S emisiones de rodamina. Vea las secciones de análisis de imágenes y de discusión para más detalles.
5. Ahora proceda a la tinción de células cromafines bovinas con DID. Enjuague los medios de cultivo de la placa que contiene las células cromafines y reemplazar con 2 ml de basal-PSS. Añadir 10 l de 10 mM DID (diluido en etanol)directamente a la placa que contiene las células. Agitar suavemente el plato de 2-10 segundos y retirar la solución + PSS hicimos.
6. Lavar el plato 3-4x con basal-PSS para eliminar cualquier residuo hizo. Las células se tiñeron ahora y listo para usar.
7. Añadir una gota de aceite de inmersión con el objetivo. Coloque el plato que contiene células cromafines teñidos con DID en la parte superior del objetivo.
8. Visualización del plato, ya sea a través del objetivo o de la cámara, encontrar un celular que se transfectadas con la proteína de interés y se tiñó con DID. Una célula así manchado-exhibe una emisión P que pone de relieve claramente los bordes de la celda; la emisión de S debe ser aproximadamente uniforme en toda la huella de célula (es decir, la región de la célula que se adhiere al vidrio y la imagen en TIRF).
9. Coloque la aguja de perfusión local, de modo que es más o menos 100 m de distancia de la celda.
10. Centrarse en la membrana celular y activar el enfoque automático de hardware inmediatamente antes de la adquisición de la estimulación de células / imagen.
11. Comience la adquisición de imágenes. Perfundir células durante 10 s con una solución basal y a continuación durante 60 segundos con una solución 56 mM de KCl despolarizante. Adquirir imágenes mientras rápidamente encofrado entre 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (para monitorear cambios en P y S de emisión de DID) y 488 nm de excitación (a la imagen de la sonda vesícula transfectadas). Ejemplos de imágenes adquiridas durante los experimentos se muestran en la Figura 2 y la Figura 3.

4. Análisis de Imagen

Los cálculos para el procesamiento de imágenes se pueden realizar con ImageJ, pero los scripts que utilizan en un lenguaje de programación flexible, tal como IDL o Matlab pueden aumentar en gran medida el análisis de rendimiento mediante la automatización de la tarea. Hay dos tipos de imágenes se deben calcular para obtener información topológica a partir de imágenes de emisión de primas -. El P / S y P 2 S P / S, informa sobre las deformaciones de la membrana locales, mientras que el P 2 S suma informa sobre el tinte total de la membrana en una región determinadadel campo.

1. Todas las imágenes deben ser antecedentes resta. Elija un ROI-celular apagado, mida la intensidad media de píxeles en el retorno de la inversión, y luego restar ese valor de todos los píxeles de la imagen de pila.
2. Para el cálculo de P / S, dividir cada cuadro de emisiones "P" de la trama posterior "S" de emisiones (píxel a píxel). P / S varía con las intensidades relativas de los p-y s-pol excitaciones, sesgos en la sistema óptico, y franjas de interferencia. Para reducir estos efectos, normalizar las relaciones de P / S de DID obtenidos a partir de la emisión a la relación obtenida con una solución que contiene rodamina 10 mM ^18.
3. La exocitosis de DCVs individuales es evidente a partir de un cambio repentino en la intensidad de una proteína de la vesícula fluorescente, tal como sinaptotagmina-1 pHluorin (Figura 2B). Determinar los cambios en P / S y P 2 S promediando los píxeles en una ROI radio de 240 nm centrada sobre aumentos localizados en el P / Srelación en los sitios de exocitosis. Cuando se produce la fusión sin un aumento evidente en P / S, el retorno de la inversión se centra sobre la región de los DCV de fusión.
4. Las simulaciones por ordenador se pueden realizar para interpretar P / S y P 2 S membrana cambios de intensidad en términos de geometrías simples de un poro de fusión de dilatación. Para más detalles de las simulaciones, consulte Anantharam et al. ¹⁸

Resultados

Las técnicas de imagen convencionales TIRFM y polarizados se implementan en la misma mesa de aire. La configuración de los elementos ópticos es similar, con la diferencia de que la luz de excitación se polariza (Figura 1A). La luz polarizada excita preferentemente fluoróforos con dipolos de absorción en la dirección de polarización. Así, por pTIRFM sea eficaz en el seguimiento de la membrana cambios topológicos, la sonda que se utiliza debe intercalar en la membrana con una orientación fija. Los tintes fluorescentes carbocianina (DII, DID) se intercalan en las bicapas lipídicas de forma orientada con dipolos de transición en el plano de la membrana (Figura 1B). Iluminación polarizada P (Figura 1C) de las membranas marcadas hizo excita selectivamente fluoróforos cubreobjetos oblicua (rojo en las figuras 1B y 1D).

Etiquetado membrana exuberante de células cromafines se logra después de abde incubación Rief con DID. Figura 2A muestra un ejemplo de una membrana celular que está manchado así. Una célula sana, adherente exhibirá claras diferencias en las emisiones de P y S. La imagen P de emisión muestra un borde de la celda más brillante con respecto al resto de la célula. La imagen de la emisión de S muestra fluorescencia más o menos uniforme a través de la huella de la célula. Calculado P-píxel a píxel / S y P 2 imágenes S son sensibles a la curvatura de la membrana y la concentración de colorante, respectivamente. La célula de cromafina se muestra también ha sido transfectada con sinaptotagmina-1 pHluorin (SYT-1) para etiquetar vesículas de secreción (Figura 2B).

La célula de cromafina se estimula con 56 mM de KCl para despolarizar la membrana celular y provocar la exocitosis. Una serie de brillantes manchas fluorescentes Syt-1 pHluorin convertirse repentinamente evidente DCVs fusible (Figura 2B, panel derecho). Una caja blanca se dibuja en torno a un evento de fusión (Figura 2B, panel derecho). Este evento i fusións analizados en las figuras 2C y 2D. Figura 2C muestra fotograma por fotograma cambios en Syt-1-pHluorin, P / S, y P 2 intensidades de imagen S. La intensidad de fluorescencia de SYT-1 disminuye rápidamente como la proteína se difunde lejos del sitio de fusión (Figura 2D). La indentación que representa el complejo de la membrana de la vesícula / de plasma fundido disminuye a un ritmo relativamente más lento (Nota gráficos de la Figura 2D). La ilustración (Figura 2E) representa una interpretación de estas mediciones.

Las deformaciones de la membrana rápidos y localizados que se muestran en la Figura 2 son el resultado de estímulo-evocó Ca ^{2 +} afluencia. Esto se muestra en la Figura 3A. Una célula cromafines se transfectaron con la genética Ca ^{2 +} indicador GCaMP5G ^21,22 y se estimularon con 56 mM KCl. Despolarización de la membrana provoca un aumento significativo en GCaMP5G de fluorescencia ( ng> Figuras 3A y 3B) que significa un aumento en subplasmalemmal Ca ^{2 +} niveles. Se selecciona una región de 30 x 20 píxeles de la celda y el marco-por-marco de los cambios en GCaMP5G, P / S, y P 2 S intensidades de píxel se muestra en las imágenes (Figura 3B) y gráficos (Figura 3C). Hora "0" representa el marco antes de un cambio de un P / S es evidente (es decir, el marco antes de la exocitosis). Las puntas de flecha blancas indican que la deformación de la membrana (aumento en P / S) se acompaña de una disminución en la emisión de S P 2. La proteína citosólica GCaMP5G está excluido de la zona por el DCV fusionado. Tenga en cuenta también la repentina disminución de la intensidad GCaMP5G en el tiempo 0 en la Figura 3C, panel izquierdo. El aumento de vida larga en P / S y la disminución de P 2 S sugieren un poro de fusión que se dilata lentamente (Figura 3D).

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Figura 1. Ilustraciones para la técnica pTIRFM. A) Se muestra un esquema para la combinación convencional con imágenes TIRF basada en la polarización. Una placa de cuarto de onda (QW) se coloca delante de un láser de zafiro de 561-nm a polarizar elíptica del haz de láser. Un cubo de polarización (PC1) se utiliza para separar en componentes polarizaciones lineales verticales (V) y horizontal (H). Los componentes verticales y horizontales se convierten en el p-pol y vigas de excitación s-pol, respectivamente, en la superficie TIR. Los caminos de p-pol y s-pol están cerradas de forma independiente (S1 y S2). Ellos se recombinan con espejos y un segundo cubo de polarización (PC2). Ellos se unen a la viga 488 nm (también postigos de forma independiente, S3) a través de un elemento de orientación de haz que consiste en un espejo y nonpolarizing espejo dicroico (DC). Las lentes (L) se utilizan para ampliar y enfocar los haces. Vigas de 488 nm y 561 nm combinadas son dirigidos a un puerto iluminación lateral del microscopio a través de galvanoespejos metros (GM). Se centran en el plano focal posterior (BFP) del objetivo. Etiquetado fotones emitidos desde fluoróforos son capturadas en una cámara EMCCD conectado a un PC. B) ¿Se se realiza incubando brevemente las células con el colorante y el lavado varias veces para eliminar el exceso. DiD se intercala en la membrana con sus momentos dipolares de transición más o menos en el plano de la membrana. C) La luz incidente polarizada en el plano de incidencia (p-Pol) crea un campo evanescente que es predominantemente polarizado normal a la interfaz, como se muestra. D) Iluminación de una membrana marcada hizo con luz polarizada p excitará selectivamente los fluoróforos que son cubreobjetos-oblicua (RED). Si esto fuera un campo evanescente s-polarizada, los fluoróforos que son paralelas a la cubreobjetos se excitan lugar (NEGRO).

Figura 2. trong> deformaciones de la membrana celular de Seguimiento con pTIRFM. A) se muestran Raw P y S las imágenes de emisión junto con calculada P / S y P 2 imágenes de emisión S. La barra de escala, 3.2 micras. B) Una célula chromaffin expresar Syt-1 pHluorin se despolariza con KCl. Una serie de puntos fluorescentes brillantes (panel derecho) indican la fusión de DCVs individuales. La barra de escala, 3.2 micras. C) fotograma a fotograma imágenes de una fusión SYT-1 pHluorin DCV. Times (imágenes superiores) están en segundos. Tiempo 0 designa marco antes de la fusión de la DCV. Correspondiente P / S y P 2 S imágenes de emisión también se muestran. . Barra de escala es de 1 m D) Gráficos para imágenes en la línea C. punteada es en el tiempo 0 - se muestra el marco de fusión E) Una posible interpretación de los resultados en C y D.. blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Las deformaciones son el resultado del estímulo-evocó Ca ^{2 +} afluencia. A) Un cromafín transfectadas con GCaMP5G se despolariza con 56 mM KCl. El aumento resultante en GCaMP5G fluorescencia significa un aumento en subplasmalemmal Ca ^{2 +} niveles. B) fotograma a fotograma de imágenes de superficie 30 x 20 píxeles de celular en A. veces por encima de las imágenes están en segundos. Puntas de flechas blancas indican una región de aumento de P / S y P 2 S disminución. Proteína citosólica GCaMP5G se excluye de la región por el DCV fusión. Barra Escala, 1 m. C) Los gráficos para las imágenes mostradas en la B. D) se muestra Una posible interpretación de los resultados en B y C.3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

iXon3 EMMCD cámara	Andor	897
IX81 microscopio invertido	Olimpo		Asamblea Filtercube montado lateralmente
Laser 43 Serie Ar-Ion	CVI Milles Griot Láser Óptica	543-AP-A01	Ajustables para que 488 nm
Sapphire 561 LP diodo láser	Coherente		561 nm
Escaneo Galvo sistema del espejo	Thorlabs	GVS102
VC Canal 3 focal sistema de perfusión	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Cuarzo MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
Regulador de presión de 10 psi	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulador	Burleigh	TS 5000-150
Montado Plate Cuarto de Onda acromático	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680 nm Polarización Beamsplitter Cube	Thorlabs	PBS201
Seis estación Rueda de densidad neutra	Thorlabs	FW1AND
Stepper motor Driven SmartShutter	Instrumentos Sutter	IQ25-1219
HQ412lp Dichroic Filtro	Chroma	NC255583	Se une a 488 nm y 561 nm vigas
Coated lente plano-cóncava	Edmund Optics	100mm PCV VIS 0	Diverge 488 nm rayo
Coated lente plano-cóncava	Edmund Optics	250mm PCV VIS 0	Diverge 561 nm rayo
Coated lente plano-convexa	Edmund Optics	PCX 125 VIS 0	Se enfoca ambos haces
Coated lente plano-convexa	Edmund Optics	50mm PCX VIS 0	Cementado para filtrar el montaje del cubo
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	Filtercube dicroica
Filtro z488/561_TIRF Emisión	Chroma	z488/561m_TIRF	Emisión Filtercube
UIS2 60X Objetivo	Olimpo	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon sistema de transfección	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph Imaging Software	Molecular Devices
Dil membrana tinte	Invitrogen	V-22885	Para la alineación Propósitos
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
Tipo DNAsa I IV de bovino	Sigma	D5025
Hemocitómetro	Pescador	0267110
DiD membrana tinte	Invitrogen	D-7757
Rodamina	Invitrogen	R634
0.22 m Unidad de filtro de membrana Jeringa	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite policromáticos microesferas rojas	Polysciences	19507	0,5 micras
Aceite de inmersión	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Controles Galvo espejos
Spinner Flask	Bellco	1.965 hasta 00.250

Tabla 1. equipos pTIRF Microscopía.

Contenido	Prep-PSS	Basal-PSS	Stim-PSS
NaCl	145 mM	145 mM	95 mM
KCl	5,6 mM	5,6 mM	56 mM
MgCl 2	-	0,5 mM	0,5 mM
CaCl2	-	2,2 mM	5 mM
HEPES	15 mM	15 mM	15 mM
pH	7.4	7.4	7.4
Glucosa	2,8 mM	5,6 mM	5,6 mM
Pen-Strep	1x	-	-

Tabla 2. Perfusión y soluciones de preparación de células cromafines.

Contenido	Electroporación Medios	Normal Plating Medios	2x antibióticos Medios
1x DMEM/F-12	1 ml / placa	2 ml / placa	1 ml / placa
FBS	10%	10%	10%
Citosina arabinofuranósido (CAF)	-	1 l / ml de 10 mM Stock	-
Penicilina	-	100 unidades / ml	200 unidades / ml
Estreptomicina	-	100 g / ml	200 g / ml
Gentamicina	-	25 g / ml	50 g / ml

Tabla 3. Medios cromafín.

Contenido	TH-PSS	TL-PSS
Liberase TH	2 ml	-
Liberase TL	-	0,85 ml
Prep-PSS	98,0 ml	84,0 ml
DNasa	8,75 mg	7,4 mg

Tabla 4. TH-PSS y TL-PSS Soluciones.

Discusión

TIRFM a base de polarización detecta cambios rápidos, submicroscópicas en topología de la membrana. La aplicación de la técnica es relativamente sencillo, sobre todo si la óptica TIRF ya están en marcha. Todo lo que se necesita es una placa de cuarto de onda, dos cubos de polarización, y persianas para separar las trayectorias p-pol y de iluminación s-pol. La posición precisa de estos componentes sobre la mesa está generalmente dictado por el espacio disponible.

Con el fin de obtener la membrana información topológica, la sonda fluorescente usada debe intercalar con una orientación fija o conocida. La técnica, como se describe en este artículo, supone el uso de colorantes de carbocianina pero otros colorantes, tales como FM1-43 ^14, también se puede utilizar. El procedimiento de tinción de la membrana en sí es sencillo. Las células cultivadas sólo requieren una exposición muy breve (menos de 10 segundos) para una pequeña cantidad de Dil / DID para obtener etiquetado exuberante de la membrana. Añadiendo el exceso de tinte conduce a la luz AGGREG dispersiónates en el cristal que disminuyen la calidad de imagen. Más-incubación de las células con colorante conduce a teñir internalización que tiene efectos perjudiciales sobre la calidad de la imagen y, posiblemente, la viabilidad celular. Si una célula se tiñe así, habrá distinción clara en las imágenes de emisión P y S. Como se muestra en la Figura 2A, la emisión P será claramente de relieve las áreas de la membrana que son oblicua cubreobjetos (es decir, los bordes de la huella de célula), mientras que la intensidad de la emisión de S será más o menos uniforme sobre la huella de célula. Si una clara distinción entre P y S no es evidente, entonces es posible que la célula está mal adheridas al sustrato o la membrana celular no es saludable, y la célula no se utiliza para los experimentos.

Nuestros estudios previos que describen pTIRFM utilizan Dil como la sonda fluorescente membrana. Aquí, utilizamos lo hizo porque es apto para experimentos de imagen de dos colores que emplean GFP / pHluorin como el otro fluoróforo. Nos excitamos hizo with un láser de 561 nm en lugar de 640 nm láser (que está más cerca de su pico de excitación) debido a que los blanqueadores de fluoróforo más rápidamente a 640 nm. A pesar del hecho de que el láser 561 nm está en la cola de DID del espectro de excitación publicada, la fluorescencia se emite de manera eficiente. Otra de las ventajas del láser nm 561 es que se excita tanto Dil e hizo que nos permite utilizar la misma configuración de polarización para ambas sondas. Tenga en cuenta que la orientación del fluoróforo en la membrana afectará a la interpretación de la topología de la membrana. Por ejemplo, si un fluoróforo se orientaron con sus dipolos de transición perpendicular al plano de la membrana (en lugar de paralelo o casi paralelo, como es el caso de Dil o hizo), entonces las regiones de membrana no planas serán destacados por la S más fácilmente en lugar de la emisión p.

También hemos descrito técnicas para el aislamiento y la electroporación de células cromafines adrenales bovinas. El cromafín bovina es un excelente smodelo ecretory. Tiene las ventajas de ser fáciles de mantener en cultivo, en respuesta a una variedad de secretagogos, y que posee grandes vesículas secretoras que se visualiza fácilmente con el microscopio de luz convencional. Para expresar las proteínas fluorescentes, las células se sometieron a electroporación en suspensión antes de la siembra en placas de cultivo tratadas con colágeno. En nuestra experiencia, la eficacia de la expresión es mucho mayor con la electroporación que con cualquiera de Ca ^{2 +-fosfato} o reactivos Lipofectamine. El inconveniente de la electroporación es que requiere más células (ya que muchos no sobrevivir al proceso) y reactivos comerciales caros. Por razones que no están claras para nosotros, no todas las membranas incorpora hizo. Además, sólo una fracción de las células en el plato se transfectan. Encontrar a las células que están transfectadas y se tiñen bien con DID puede llevar mucho tiempo por lo que la optimización de las condiciones para la tinción y electroporación es bien vale la pena el esfuerzo.

En resumen, este unArtículo describe cómo pTIRFM se implementa para monitorizar las deformaciones de la membrana rápidos y localizados que se producen durante la fusión de vesículas de núcleo denso en las células cromafines de la especie bovina. Aunque se discute una sola aplicación, la técnica es ideal para el estudio de otros procesos biológicos que implican cambios en la forma de la membrana, incluyendo la endocitosis, la citocinesis, y la motilidad celular.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
iXon3 EMMCD Camera	Andor	897
IX81 Inverted Microscope	Olympus		Side-mounted Filtercube Assembly
43 Series Ar-Ion Laser	CVI Milles Griot Laser Optics	543-AP-A01	Tunable to 488nm
Sapphire 561 LP Diode Laser	Coherent		561nm
Scanning Galvo Mirror System	Thorlabs	GVS102
VC3 Channel Focal Perfusion System	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Quartz MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 PSI Pressure Regulator	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulator	Burleigh	TS 5000-150
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube	Thorlabs	PBS201
Six Station Neutral Density Wheel	Thorlabs	FW1AND
Stepper-motor Driven SmartShutter	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp Dichroic Filter	Chroma	NC255583	Joins 488nm and 561nm beams
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	Diverges 488nm beam
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	Diverges 561nm beam
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 125mm VIS 0	Focuses both beams
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	Cemented to filter cube assembly
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	Filtercube dichroic
z488/561_TIRF Emission Filter	Chroma	z488/561m_TIRF	Filtercube emission
UIS2 60x Objective	Olympus	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph Imaging Software	Molecular Devices
DiI Membrane Dye	Invitrogen	V-22885	For Alignment Purposes
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAse I Type IV from bovine	Sigma	D5025
Hemocytometer	Fisher	0267110
DiD Membrane Dye	Invitrogen	D-7757
Rhodamine	Invitrogen	R634
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres	Polysciences	19507	0.5 microns
Immersion Oil	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Controlls galvo mirrors
Spinner Flask	Bellco	1965-00250