Imaging Plasma Membrane déformations Avec pTIRFM

Résumé

À polarisation selon une réflexion interne totale microscopie de fluorescence (pTIRFM) permet la détection en temps réel de la dynamique de la membrane cellulaire. Cet article décrit la mise en œuvre de pTIRFM pour l'étude du remodelage de la membrane lors de l'exocytose régulée. La technique est généralisable à d'autres processus en biologie cellulaire qui impliquent directement ou indirectement changements dans la forme de la membrane.

Résumé

Pour obtenir des informations nouvelles sur la dynamique de l'exocytose, notre groupe met l'accent sur les changements dans la forme de bicouche lipidique qui doivent être précisément réglementées lors de la fusion de vésicules et de plasma membranes. Ces changements rapides et localisées sont atteints par des interactions dynamiques entre les lipides et les protéines spécialisées qui contrôlent la courbure de la membrane. L'absence de ces interactions pourrait non seulement avoir des conséquences dévastatrices pour la fusion des vésicules, mais une foule d'autres fonctions cellulaires qui impliquent le contrôle de la forme de la membrane. Au cours des dernières années, l'identité d'un certain nombre de protéines ayant des propriétés de mise en forme de membrane a été déterminée. Ce qui reste manquant est une feuille de route de quand, où, et comment ils agissent comme la fusion et le contenu libération progrès.

Notre compréhension des événements moléculaires qui permettent le remodelage de la membrane a toujours été limitée par un manque de méthodes d'analyse qui sont sensibles à la courbure de la membrane ou avoir la résolution temporelle à track changements rapides. PTIRFM satisfait à ces deux critères. Nous discutons de la façon pTIRFM est mis en œuvre pour visualiser et interpréter changements rapides et submicroniques dans l'orientation des membranes cellulaires chromaffines pendant dense noyau vésicule (DCV) fusion. Les cellules chromaffines que nous utilisons sont isolées de glandes surrénales bovines. La membrane est colorée avec un colorant carbocyanine lipophile, 1,1 '-dioctadécyl-3, 3,3', 3 'tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzène, ou a fait. DiD intercale dans le plan de la membrane avec une orientation "fixe" et est donc sensible à la polarisation du champ évanescent. La membrane cellulaire n'a taché est successivement excités avec des polarisations orthogonales d'un laser 561 nm (p-pol, s-pol). Un laser 488 nm est utilisé pour visualiser les mandants et les temps vésicules moment de la fusion. Exocytose est déclenchée par perfusion locale cellules avec une solution de KCl dépolarisant. L'analyse est effectuée hors ligne en utilisant un logiciel écrit sur mesure de comprendre comment at-changements d'intensité des émissions liées à la fusion dilatation des pores.

Introduction

La bonne exécution de l'exocytose nécessite des changements extrêmes de forme bicouche de membrane à être orchestrée précisément. Avant la fusion, la flexion locale de la membrane plasmique dans le cadre du granule se produit, en partie pour réduire la barrière d'énergie d'interaction de bicouches. Plus tard, en tant que membranes fusionnent, les zones de forte courbure sont générés et doivent être stabilisées. Enfin, les membranes fusionnées doivent être pliés de leur forme initiale d'étendre le pore de fusion et permettre la libération de contenu ^1. Parce que seuls les membranes ne sont pas susceptibles de subir ces changements spectaculaires et coordonnés, les protéines sont nécessaires à la médiation des événements. Mais comment ils agissent pour influencer les changements de topologie de la membrane au cours du processus de fusion reste très ouverte.

Bon modèles in vitro existent pour visualiser courbure de la membrane. L'utilisation de coloration négative EM, par exemple, a joué un rôle important pour façonner des modèles moléculaires actuelles pour les actions de deux grands trafics proteins - synaptotagmine et dynamine (pour revue, voir Chapman et ² Henshaw ^3). La plupart des tests en temps réel de l'exocytose ne détectent pas directement courbure. Au lieu de cela, la courbure est déduit à partir d'essais qui rendent compte de la cinétique de libération de la cargaison luminal ^4-8 ou des changements de surface de membrane ^9-11. PTIRFM comble le fossé entre in vivo et des études in vitro, en permettant des mesures directes en temps réel de l'évolution de la micromorphologie de membrane.

PTIRFM, dans un mode non imageur, a été lancée par Axelrod et ses collègues pour mesurer l'orientation du NPD-PE incorporé dans une membrane modèle ^12. La technique a ensuite été appliquée à visualiser les changements dynamiques dans les cellules vivantes marquées par Dii et FM1-43 ^13-18. Dans pTIRFM, deux polarisations des champs évanescents sont utilisés pour exciter séquentiellement une sonde de membrane-embedded: p-polarisation (dans le plan d'incidence) et de polarisation S (perpendiculaire au plan d'incidence). Avant l'imagerie, la sonde - dans ce cas, n'a - est brièvement ajouté dans le milieu extracellulaire et est autorisé à s'intercaler dans les membranes plasmiques des cellules à étudier. Dans les régions où la membrane est non parallèle à la lamelle (comme dans une ruche de membrane ou indentation), DID aura également non parallèles. Par conséquent, ces régions seront excitable par le faisceau p-pol. Le faisceau p-pol sera moins efficace exciter n'a dans les régions de la membrane qui sont principalement parallèles à la lamelle. Images ratio pixel à pixel (P / S) des rapports sur l'émission du séquentiel p et s-pol excitation de DID donc souligner spécifiquement les régions de déformation de la membrane. En théorie, le rapport des images P / S sont sensibles à même de petits angles de déviation de la membrane plasmique de la lamelle, à l'amplitude des changements prédits par des simulations sur ordinateur ^18. Images P / S sont également indépendants de la distance de fluorophore à partir de la surface de la lamelle et fluorophore localeconcentration. Concentration en fluorophore local est fourni à la place des images par rapport à la somme de rapports pixel à pixel P de l'émission et de deux fois l'émission de S (P 2 S). La mesure de la 2 P S est sensible à la géométrie précise de l'indentation, avec certains, peu ou pas de changement possible. Cela peut être démontré par des simulations informatiques que les transitions de modèle d'un pore de fusion d'un début (c'est à dire avec un col étroit) à un état ​​plus tard ^16,18. Le P 2 S d'une vésicule condensé attaché à la membrane plasmique par l'intermédiaire d'un col étroit (et à plus forte raison à proximité de l'interface) est prévu pour être plus grand, par exemple, que celui d'une vésicule fusionné avec un pore beaucoup plus large (où l' DID est dans la partie le plus sombre du champ évanescent).

Dans cet article, nous discutons de la façon pTIRFM est mis en œuvre et utilisé pour étudier les changements rapides et localisées en forme de membrane qui se produisent lors de la fusion dilatation des pores. Bien qu'une seule application est explicitement discussed, les méthodes peuvent être généralisés à une variété d'autres processus biologiques cellulaires impliquant directement ou indirectement le remodelage de la membrane.

Protocole

Une. Configuration du système PTIRF

La technique pTIRFM est construit sur une plate-forme de microscope inversé. Les faisceaux laser sont dirigés à travers un port de l'éclairage latéral et un non polarisant filtre cube de côté face, et ont ensuite porté sur le plan focal arrière d'un objectif 60X 1,49 NA FRBR. Deux lentilles supplémentaires (1,6 x et 2x) dans le trajet d'émission entre le microscope et d'une caméra EMCCD donnent une taille de pixel finale d'environ 80 nm. Les faisceaux laser sont guidés par des miroirs de galvanomètre commandés par logiciel pour la commutation rapide entre la réflexion interne épi-et totale (TIR) ​​illumination. Le protocole décrit ci-dessous suppose que l'optique pour la FRBR sont déjà positionnés sur la table de l'air dans les positions optimales pour fluorophore excitation et de l'imagerie. Il décrit comment l'optique de polarisation sont ajoutés à un microscope TIRF dispositif existant pour permettre l'imagerie des déformations de la membrane cellulaire. Un schéma de montage optique de notre laboratoire pour produire les deux carnets et polarizatTIR à base d'ions est représenté sur la figure 1A. Le protocole suppose l'utilisation d'un laser 488 nm pour l'excitation de protéines des vésicules fluorescentes et un laser 561 nm pour l'imagerie du colorant carbocyanine, DID.

1. Alimentation de tous les composants de microscope, les lasers et les ordinateurs.
2. Diriger un faisceau provenant du laser 488 nm par rapport au plan focal arrière (BFP) de la lentille 1,49 NA comme illustré sur la Figure 1A. Si le faisceau laser est focalisé sur le BFP, elle sortira collimaté et apparaître comme petite tache bien définie sur le plafond au dessus de l'objectif.
3. Ajuster le miroir de galvanomètre X (le miroir situé dans le plan d'échantillon équivalent), de sorte que le faisceau laser est déplacé hors de l'axe et se dégage de l'objectif à des angles progressivement plus raide de l'objectif normale.
4. Ensuite, vérifiez que TIR est atteint. Ajouter 10 pi de microsphères fluorescentes à un ml de volume de 1 PSS dans un plat à fond de verre. Seule la fluorescence à partir de microsphères sur la partie inférieure of le plat, plus proche de l'interface de TIR, devraient être détectés. Détection de microsphères flottants indique que l'angle entre la lumière incidente et la normale objectif est insuffisante.
   
   La section ci-dessous décrit la mise en place des composants optiques nécessaires pour l'imagerie en fonction de la polarisation.
5. Utilisation du faisceau de 488 nm aligné comme guide, ajuster la position du faisceau laser 561 nm brut de sorte qu'il se déplace le long d'un chemin optique identique. Le laser 561 nm sera utilisé pour l'imagerie du colorant carbocyanine, DID.
6. Insérez une lentille divergente et miroirs en aval du laser 561 nm. En utilisant les miroirs, régler le faisceau de sorte qu'il est coaligned avec le faisceau de 488 nm et la tache est au point sur le plafond lorsque les miroirs de galvanomètre sont dans la position "0".
7. Centrer une lame quart d'onde (QW) dans le trajet du faisceau, immédiatement en aval de l'ouverture du laser. Utilisez une QW qui est soit achromatique ou l'écoute de la longueur d'onde d'excitation.Un QW sera circulaire polariser toute lumière polarisée linéairement qui entre dans un angle de 45 ° avec l'axe optique. Certains composants optiques, tels que des cubes de polarisation, ont un biais d'atténuation vers un axe de polarisation. Le QW peut être mis en rotation pour compenser ce biais. Cet ajustement se traduira par un faisceau polarisé elliptiquement. Un QW est nécessaire parce que le faisceau laser lui-même est fortement polarisée linéairement (verticalement) à sa sortie de l'ouverture.
8. Placer un cube de polarisation (PC1) en aval du faisceau polarisé elliptiquement. Le cube de polarisation reflète l'(y) composante verticale du champ électrique et transmet le (x) composant horizontal. Le cube de polarisation est placé sur une petite scène de traduction pour faciliter l'alignement ultérieur des trajets de faisceau de polarisation.
9. Utiliser un second cube polarisant (PC2) et les miroirs (figure 1A) pour recombiner les faisceaux.
10. Placer un obturateur entre le premier cube de polarisation (PC1) et le co verticalmiroir mponent. Placer un second obturateur entre le miroir et la seconde composante horizontale cube de polarisation (PC2). Ces volets sont commandés par le logiciel d'imagerie qui permet à l'utilisateur de sélectionner rapidement entre les polarisations des faisceaux.
11. Utiliser un filtre de polarisation afin de vérifier l'orientation du champ électrique dans chaque trajet de faisceau. Un filtre polarisant ne permettre la transmission en ligne avec l'axe du filtre.
12. Vérifiez que les composantes verticale et horizontale du faisceau laser sont alignés les uns avec les autres et que le faisceau de 488 nm. Faire les ajustements nécessaires. Les trois faisceaux devraient tous être concentrés sur le BFP et émergent collimaté de l'objectif à la même place sur le plafond. Cet endroit peut être marqué par un X pour faciliter l'alignement futur.
13. Déposer une goutte d'huile d'immersion sur l'objectif. Placer le plat contenant des microsphères fluorescentes (voir l'étape 4 ci-dessus) sur l'objectif.
14. Entrez TIR en déplaçant le miroir de galvanomètre X. En TIR, le componen verticalt du faisceau est le s-pol et la composante horizontale de la poutre est maintenant le p-pol. Ajuster l'intensité relative entre les faisceaux en faisant tourner la plaque de QW. Afficher chaque champ évanescent polarisée avec un échantillon de la rhodamine, qui est prédite pour être orientée de façon aléatoire. Faites pivoter la plaque QW faire correspondre les intensités moyennes de pixels. Si nécessaire, ajouter un filtre de densité neutre dans une trajectoire de faisceau polarisé pour atténuer son intensité.

2. Chromaffin cellule d'isolement

Un mode opératoire pour isoler des cellules chromaffines saines de la glande surrénale veau est fourni ci-dessous. Il est adapté à partir de protocoles précédemment publiés par Wick, Senter et al. O'Connor et ^19, Mahata et al. ²⁰ Après isolement, les cellules sont électroporées avec le plasmide (s) d'intérêt en utilisant un système d'électroporation. Ce résultats de système dans 20 à 30% de cellules exprimant les protéines fluorescentes souhaités. En règle générale, 70% des cellules survivent les élusprocessus de roporation. Les détails des composants de PSS et des médias sont fournies dans les tableaux 2, 3 et 4.

1. Deux jours avant la préparation de la cellule, le traitement de 35 mm qualité optique à fond de verre (0,17 mm d'épaisseur) plats avec 1 ml de poly-D-lysine (0,1 mg / ml), suivi par 1,25 ml de collagène bovin. Laissez sécher à l'air plats dans les tissus culture capot.
2. Obtenir glandes surrénales bovines de l'abattoir. Gardez les glandes sur la glace alors qu'ils sont transportés au laboratoire. Les glandes surrénales bovines peuvent être enfermés dans une épaisse couche de graisse. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour enlever l'excès de graisse et d'exposer l'ouverture de la veine surrénale. Perfuser la veine avec prép-PSS jusqu'à ce que la glande est purgé de sang.
3. Ensuite, la pipette lentement 2 ml de solution TH-PSS dans l'ouverture de la veine jusqu'à la houle de la glande. Incuber les glandes gonflé à 37 ° C pendant 15 min. Répéter le traitement TH-PSS et incuber à nouveau.
4. Couper à travers le cortex surrénal autour du bord extérieur de la glande de sciseaux et peler la glande à part pour exposer la moelle. Utiliser un scalpel pour gratter délicatement et séparer la moelle du tissu cortical.
5. Émincer le bulbe avec une paire de lames de bistouri pour 5-10 min.
6. Une étape finale de la digestion est nécessaire pour isoler les cellules chromaffines individuels. Verser la suspension de cellules hachée dans un ballon rotatif. Remplissez partiellement le ballon avec un ratio de 2:1 de TH-PSS (30 ml) de TL-PSS (15 ml) et incuber pendant 30 min à 37 ° C tout en faisant tourner à environ 100 tours par minute.
7. Séparez les cellules chromaffines individuels à partir de tissu non digérés par filtration à travers un maillage de 400 um. Recueillir le filtrat. Centrifugeuse à 200 xg pour sédimenter les cellules, et remettre en suspension dans de la glace PSS froid.
8. Filtrer les cellules à travers un maillage de 250 um, culot, et enfin remettre en suspension dans un tampon d'électroporation (voir l'étape 2.9).
9. Compter les cellules en utilisant un hématimètre et préparer pour la transfection.
10. Transfecter des cellules avec le système d'électroporation selon l'les recommandations du fabricant. Les conditions précises d'électroporation doivent être déterminées de manière empirique. Remarque: Les réglages qui offrent le meilleur équilibre entre l'efficacité de la transfection et le taux de survie des cellules pour cette préparation de cellules bovines chromaffines sont 1100 V, 40 ms, et une impulsion. Nous estimons que ces conditions, 20-30% des cellules sont transfectées. Environ 30% des cellules ne survivent pas au processus d'électroporation.
11. Cellules de la plaque doucement sur la poly-D-lysine et de collagène traités plats dans 1 ml de milieu par électroporation chaudes.
12. Placer la vaisselle dans un incubateur à 37 ° C (5% CO _2). Ajouter 1 ml de milieu antibiotiques 2x à chaque plat après 6 h. Changer les médias aux médias normales le lendemain.
13. Cellules chromaffines sont généralement imagés 2-5 jours après l'électroporation.

3. pTIRF Image Acquisition

1. Puissance sur le système d'imagerie et lancer le logiciel d'acquisition.
2. Vérifiez que les lasers sont alignés. Vérifiez évanescenteprofil de champ utilisant des microsphères.
3. Préparez le système global et local perfusion. Réservoirs de solution de nettoyage avec filtrée désionisée H ₂ O et remplissent de base et stimuler des solutions de PSS.
4. Avant l'imagerie de cellules chromaffines, vérifier que les p-pol et s-pol excitations éclairent la même zone du champ d'observation, et que les intensités d'éclairage sont à peu près équivalentes. Pour ce faire, remplissez un plat à fond de verre avec 2 ml de PSS contenant rhodamine à une concentration finale de 10 mM. Séquentiellement exciter l'échantillon de la rhodamine avec p-pol et lumière s-pol et capturer les images. Dans la pratique, les émissions P et S de DID sont normalisés à la moyenne de la P et les émissions de rhodamine S. Voir les sections d'analyse et de discussion l'image pour plus de détails.
5. Maintenant procéder à la coloration des cellules chromaffines bovines avec DID. Rincer les milieux de culture de la boîte contenant les cellules chromaffines et les remplacer par 2 ml de base-PSS. Ajouter 10 ul de 10 mM n'a (dilué dans de l'éthanol)directement à la boîte contenant les cellules. Agiter doucement plat pour 2-10 secondes et retirer la solution n'a + PSS.
6. Laver la capsule 3-4x avec basal-PSS pour enlever tout résidu a fait. Les cellules sont maintenant colorées et prêt à utiliser.
7. Ajouter une goutte d'huile d'immersion à l'objectif. Placez plat contenant des cellules chromaffines at-tachés au-dessus de l'objectif.
8. Regarde le plat soit à travers l'objectif ou l'appareil photo, trouver une cellule qui est transfectées avec la protéine d'intérêt et tachée de DID. Une cellule ainsi teinté présente une émission de P qui met en évidence de façon frappante les bords de la cellule; la S émission devrait être à peu près uniforme à travers l'empreinte de cellules (c'est à dire la zone de la cellule qui est collée à la vitre et imagée dans TIRF).
9. Positionner l'aiguille de perfusion locale de sorte qu'il est à peu près à une distance de 100 um de la cellule.
10. Focus sur la membrane cellulaire et activer le matériel de mise au point automatique, immédiatement avant l'acquisition stimulation cellulaire / image.
11. Commencer l'acquisition d'image. Perfuser les cellules pendant 10 secondes avec une solution de base et ensuite pendant 60 secondes avec une solution de dépolarisation 56 mM de KCl. Acquérir des images en coffrage rapidement entre 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (pour suivre l'évolution de P et S émission de fait) et 488 nm excitation (à l'image de la sonde de la vésicule transfectées). Des exemples d'images acquises lors des expériences sont présentés sur la figure 2 et la figure 3.

4. Analyse de l'image

Calculs pour le traitement d'image peuvent être réalisés avec ImageJ, mais son exécution en utilisant dans un langage de programmation souple comme IDL ou Matlab peuvent augmenter considérablement l'analyse débit en automatisant la tâche. Deux types d'images doit être calculée afin d'obtenir des informations topologiques à partir d'images d'émissions brutes -. P / S et P 2 de S P / S rapports sur les déformations de la membrane locales tandis que le P 2 S somme des rapports sur la teinture totale de la membrane dans une région donnéedu champ.

1. Toutes les images doivent être soustraits fond. Choisir un retour sur investissement hors cellule, mesurer l'intensité de pixel moyenne dans la région d'intérêt, et puis en soustrayant cette valeur de tous les pixels dans la pile d'images.
2. Pour calculer P / S, diviser chaque trame d'émission "P" par la trame suivante "S" d'émission (pixel par pixel). P / S varie avec les intensités relatives des p-et s-pol excitations, les biais dans la système optique, et des franges d'interférence. Pour réduire ces effets, normaliser les rapports P / S obtenues à partir de l'émission a fait pour le ratio obtenu avec une solution contenant mM rhodamine ¹⁸ 10.
3. L'exocytose de VJC individuels est évident d'après une variation brusque de l'intensité d'une protéine fluorescente de vésicules, telles que Synaptotagmin pHluorin-1 (figure 2B). Déterminer les changements dans P / S et P 2 S par la moyenne des pixels dans un rayon de 240 nm ROI centrée sur des augmentations localisées de la P / Srapport aux sites d'exocytose. Lorsque la fusion se produit sans une augmentation évidente dans P / S, le retour sur investissement est centré sur la région de la DCV de fusion.
4. Des simulations sur ordinateur peuvent être effectuées pour interpréter P / S et P 2 S les changements d'intensité de la membrane en termes de géométries simples d'un pore dilatation de fusion. Pour les détails des simulations, s'il vous plaît voir Anantharam et al. ¹⁸

Résultats

Techniques d'imagerie classiques et TIRFM polarisées sont mises en œuvre sur la même table de l'air. La configuration des éléments optiques est similaire, avec la différence importante que la lumière d'excitation est polarisée (figure 1A). Lumière polarisée excite préférentiellement fluorophores avec dipôles d'absorption dans la direction de polarisation. Ainsi, pour pTIRFM pour être efficace au suivi membrane modifications topologiques, la sonde qui est utilisé doit s'intercaler dans la membrane avec une orientation fixe. Les colorants fluorescents carbocyanine (DII, at) s'intercalent dans des bicouches lipidiques d'une manière orientée avec dipôles de transition dans le plan de la membrane (figure 1B). P-polarisée éclairage (figure 1C) de membranes at-étiquetés excite sélectivement lamelle oblique fluorophores (RED dans les figures 1B et 1D).

Exubérant marquage membranaire des cellules chromaffines est obtenue après abincubation rief avec DID. Figure 2A montre un exemple d'une membrane cellulaire qui est bien coloré. A, cellules adhérentes sain présenter des différences distinctes dans les émissions P et S. L'image P d'émission indique une frontière de cellule plus lumineux par rapport au reste de la cellule. L'image S d'émission présente une fluorescence plus ou moins uniforme dans toute la zone de la cellule. Calculé pixel à pixel P / S et P 2 S images sont sensibles à la courbure de la membrane et la concentration de colorant, respectivement. La cellule chromaffine a également été montré transfectée avec Synaptotagmin-1 pHluorin (SYT-1) pour étiqueter vésicules de sécrétion (Figure 2B).

La cellule chromaffine est stimulée avec 56 mM de KCl pour dépolariser la membrane cellulaire et de déclencher l'exocytose. Un certain nombre de taches vives fluorescentes Syt-1 pHluorin soudainement devenu évident qu'un fusible VJCs (figure 2B, panneau de droite). Une boîte blanche est établi autour d'un événement de fusion (figure 2B, panneau de droite). Cette fusion événement is analysé les figures 2C et 2D. figure 2C montre les changements trame par trame dans Syt-1-pHluorin, P / S, et P 2 image S intensités. L'intensité de fluorescence de SYT-1 diminue rapidement que la protéine se diffuse à partir du site de fusion (figure 2D). L'indentation qui représente le complexe de la membrane des vésicules / plasma fondu diminue à une vitesse relativement lente (note graphiques de la figure 2D). L'illustration (figure 2E) représente une interprétation de ces mesures.

Les déformations de la membrane rapides et localisés à la figure 2 sont le résultat de stimulation évoquée influx de ^{Ca2 +.} Ceci est montré sur la figure 3A. Une cellule chromaffin est transfectée avec la génétique Ca ^{2 +} indicateur GCaMP5G ^21,22 et stimulées avec 56 mM de KCl. Dépolarisation de la membrane provoque une augmentation significative de la fluorescence GCaMP5G ( ng> Les figures 3A et 3B) signifiant une augmentation de subplasmalemmal Ca ^{2 +} niveaux. Une région de la cellule 30 x 20 pixels est sélectionné et changements trame par trame dans GCaMP5G, P / S, et P 2 intensités S de pixels sont présentées dans les images (figure 3B) et graphiques (figure 3C). Temps "0" désigne le cadre avant un changement de P / S est évident (c'est à dire la trame avant l'exocytose). Les têtes de flèches blanches indiquent que la déformation de la membrane (augmentation de la P / S) est accompagnée d'une diminution de P 2 S émission. La protéine GCaMP5G cytosolique est exclue de la zone par le DCV fusionné. A noter également la baisse soudaine de l'intensité GCaMP5G au temps 0 à la figure 3C, panneau de gauche. L'augmentation à long terme dans P / S et la diminution de P 2 S suggèrent un pore de fusion qui se dilate lentement (figure 3D).

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Figure 1. Illustrations pour la technique pTIRFM. A) Un schéma classique pour combiner avec la FRBR imagerie basée sur la polarisation est représentée. Une lame quart d'onde (QW) est placé en face d'un laser saphir-561 nm à polariser elliptique du faisceau laser. Un cube polarisant (PC1) est utilisé pour séparer les polarisations verticales en composantes linéaires (v) et horizontales (h). Les composantes verticales et horizontales deviennent le p-pol et s-pol faisceaux d'excitation, respectivement, à la surface RIT. Les chemins p-pol et s-pol sont à volets indépendamment (S1 et S2). Ils sont recombinés avec des miroirs et une deuxième cube polarisant (PC2). Ils se joignent à la poutre 488 nm (également volets indépendamment, S3) par l'intermédiaire d'un élément d'orientation de faisceau comprenant un miroir non polarisant et un miroir dichroïque (DC). Lentilles (L) sont utilisés pour étendre et focaliser les faisceaux. Combiné 488 nm et 561 nm faisceaux sont dirigés vers un orifice d'illumination latérale du microscope via galvanomiroirs de mètre (GM). Ils se concentrent sur le plan focal arrière (BFP) de l'objectif. Étiquetage photons émis par les fluorophores sont capturées sur une caméra EMCCD connecté à un PC. B) a fait est réalisée en incubant brièvement cellules avec le colorant et laver plusieurs fois pour enlever l'excès. DiD intercale dans la membrane avec ses moments dipolaires de transition à peu près dans le plan de la membrane. C) La lumière incidente polarisée dans le plan d'incidence (p-pol) crée un champ évanescent qui est essentiellement polarisée normale à l'interface, comme indiqué. D) Illumination d'une membrane n'a marqué avec de la lumière polarisée p va exciter sélectivement les fluorophores qui sont lamelle oblique (RED). S'il s'agissait d'un champ évanescent s-polarisé, les fluorophores qui sont parallèles à la lamelle seraient excités à la place (BLACK).

Figure 2. trong> cellule de surveillance des déformations de la membrane avec pTIRFM. A) Raw P et S images d'émission ainsi calculé P / S et P 2 images des émissions de soufre sont présentés. La barre d'échelle, de 3,2 um. B) Une cellule chromaffin exprimer Syt-1 pHluorin est dépolarisée avec KCl. Un certain nombre de taches fluorescentes vives (panneau de droite) indiquent la fusion de VJC individuels. La barre d'échelle, de 3,2 um. C) images Image par image d'une fusion Syt-1 pHluorin DCV. Temps (au-dessus des images) sont en secondes. Temps 0 désigne cadre avant la fusion de la DCV. Correspondant P / S et P 2 images d'émissions de S sont également présentés. . Barre d'échelle est de 1 um D) Graphiques pour les images en ligne C. pointillé est au temps 0 -. le cadre de la fusion E) Une interprétation possible des résultats dans C et D sont affichés. blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Déformations sont le résultat des mesures de relance évoqués influx de ^{Ca2 +.} A) Une cellule chromaffin transfectées avec GCaMP5G est dépolarisée mM KCl 56. L'augmentation de la fluorescence GCaMP5G signifie une augmentation de subplasmalemmal Ca ^{2 +} niveaux. B) images Image par image de 30 x 20 zone de pixels de la cellule dans A. fois au-dessus des images sont en secondes. Flèches blanches indiquent une région d'augmentation P / S et P 2 S diminution. GCaMP5G protéine cytosolique est exclue de la région par le DCV de fusion. La barre d'échelle, 1 pm. C) Graphiques pour les illustrations de B. D) Une interprétation possible des résultats dans B et C s'affiche.3highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Caméra iXon3 EMMCD	Andor	897
IX81 microscope inversé	Olympe		Latéral Assemblée FILTERCUBE
43 Série Ar-Ion Laser	CVI Milles Griot optique laser	543-AP-A01	Accordable à 488 nm
Sapphire 561 LP Diode Laser	Cohérent		561 nm
Système de balayage Miroir Galvo	Thorlabs	GVS102
Focal canal VC 3 Perfusion System	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Quartz MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 psi régulateur de pression	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulateur	Burleigh	TS 5000-150
Monté Achromatic lame quart d'onde	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680 nm polarisant Beamsplitter Cube	Thorlabs	PBS201
Six station Neutre Roue de la densité	Thorlabs	FW1AND
Moteur pas à pas Driven SmartShutter	Instruments de Sutter	IQ25-1219
HQ412lp dichroïque Filtre	Chroma	NC255583	Joint 488 nm et 561 nm poutres
Couché Plano-Concave objectif	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	Diverge 488 nm faisceau d'
Couché Plano-Concave objectif	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	Diverge 561 nm faisceau d'
Couché lentille plan-convexe	Edmund Optics	PCX 125 mm VIS 0	Concentre deux faisceaux
Couché lentille plan-convexe	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	Cimenté pour filtrer assemblage de cube
z488/561rpc dichroïque	Chroma	z488/561rpc	FILTERCUBE dichroïque
Filtre z488/561_TIRF émission	Chroma	z488/561m_TIRF	FILTERCUBE émission
UIS2 60X Objectif	Olympe	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon système de transfection	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph logiciel d'imagerie	Molecular Devices
Dil membrane Dye	Invitrogen	V-22885	Pour fins d'alignement
TH Libérase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAse I de type IV de bovins	Sigma	D5025
Hémocytomètre	Pêcheur	0267110
DiD membrane Dye	Invitrogen	D-7757
Rhodamine	Invitrogen	R634
0,22 um seringue membrane Filtre Unité	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite polychromes rouges microsphères	Polysciences	19507	0,5 um
Immersion dans l'huile	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Contrôles Galvo miroirs
Spinner Flask	Bellco	1965-00250

Tableau 1. équipements pTIRF microscopie.

Contenu	Prep-PSS	Basal-PSS	Stim-PSS
NaCl	145 mM	145 mM	95 mM
KCl	5,6 mM	5,6 mM	56 mM
MgCl2	-	0,5 mM	0,5 mM
CaCl2	-	2,2 mM	5 mM
HEPES	15 mM	15 mM	15 mM
pH	7.4	7.4	7.4
Glucose	2,8 mM	5,6 mM	5,6 mM
Pen-Strep	1x	-	-

Tableau 2. Perfusion et solutions de préparation de cellules chromaffines.

Contenu	Électroporation médias	Normal Dépôt médias	2x antibiotiques médias
1x DMEM/F-12	1 ml / plaque	2 ml / plaque	1 ml / plaque
FBS	10%	10%	10%
Cytosine arabinofuranoside (CAF)	-	1 pl / ml de 10 mM Stock	-
Pénicilline	-	100 unités / ml	200 unités / ml
Streptomycine	-	100 pg / ml	200 pg / ml
Gentamycin	-	25 pg / ml	50 pg / ml

Tableau 3. Chromaffin portable Media.

Contenu	TH-PSS	TL-PSS
Libérase TH	2 ml	-
Libérase TL	-	0,85 ml
Prep-PSS	98,0 ml	84,0 ml
DNase	8,75 mg	7,4 mg

Tableau 4. TH-PSS et TL-PSS Solutions.

Discussion

TIRFM à polarisation détecte, les changements microscopiques rapide de la topologie de la membrane. Mise en œuvre de la technique est relativement simple, surtout si l'optique FRBR sont déjà en place. Tout ce qui est nécessaire est une lame quart d'onde, deux cubes de polarisation, et les volets pour séparer les chemins p-pol et éclairage s-pol. La position précise de ces composants sur la table est généralement dicté par l'espace disponible.

Afin d'obtenir des informations topologiques membrane, la sonde fluorescente utilisé ne doit s'intercaler avec une orientation fixe ou connue. La technique, telle que décrite dans cet article, suppose l'utilisation de colorants de carbocyanine, mais d'autres colorants, tels que FM1-43 ^14, peuvent également être utilisés. La procédure de coloration de la membrane elle-même est simple. Les cellules cultivées n'ont besoin que d'une très courte exposition (moins de 10 secondes) à une petite quantité de DII / SDA pour obtenir l'étiquetage exubérante de la membrane. Ajout excès de colorant conduit à la diffusion de la lumière AGGREGAtes sur la vitre qui diminuent la qualité d'image. Plus-incubant les cellules avec un colorant pour teindre internalisation conduit qui a des effets néfastes sur la qualité de l'image et, éventuellement, la viabilité des cellules. Si une cellule est bien colorée, il y aura distinction claire dans les images d'émission P et S. Comme le montre la Figure 2A, le P émission sera vivement mettre en évidence les zones de la membrane qui sont lamelle oblique (c'est à dire les bords de l'empreinte de la cellule), tandis que l'intensité d'émission S sera à peu près uniforme sur l'empreinte de la cellule. Si une distinction claire entre P et S n'est pas apparent, alors il est possible que la cellule est faiblement collée sur le substrat ou la membrane cellulaire n'est pas en bonne santé, et la cellule n'est pas utilisée pour les expériences.

Nos études antérieures décrivant pTIRFM utilisés DII que la sonde de membrane fluorescent. Ici, nous utilisons at car il est adapté pour la double-couleur des expériences d'imagerie qui emploient GFP / pHluorin que l'autre fluorophore. On excite n'a wie Un laser 561 nm plutôt qu'à 640 nm de laser (qui est plus proche de son pic d'excitation), parce que les agents de blanchiment plus rapidement fluorophores à 640 nm. Malgré le fait que le laser 561 nm est présent dans la queue de DID spectre d'excitation publiée, la fluorescence est émise de manière efficace. Un autre avantage du laser nm 561 est qu'il excite les deux DII et ne nous permet d'utiliser la même configuration de polarisation pour les deux sondes. A noter que l'orientation du fluorophore dans la membrane aura une incidence sur l'interprétation de la topologie de membrane. Par exemple, si un fluorophore ont été orientés avec ses dipôles de transition perpendiculaire au plan de la membrane (plutôt que parallèle, ou presque parallèles, comme c'est le cas avec DII ou a fait), alors les régions de la membrane non planes seront mis en évidence par le S plus facilement plutôt que l'émission de P.

Nous avons également décrit des techniques pour l'isolement et l'électroporation des cellules chromaffines surrénales bovines. La cellule chromaffin bovine est un excellent smodèle ecretory. Il a les avantages d'être facile à maintenir en culture, en réponse à une variété de sécrétagogues, et possédant de grandes vésicules sécrétoires qui sont facilement visualisées par microscopie optique conventionnelle. Pour exprimer des protéines fluorescentes, les cellules sont électroporation en suspension avant étalement sur des boîtes de culture de collagène traitée. Dans notre expérience, l'efficacité d'expression est beaucoup plus élevé avec électroporation que soit avec Ca ^{2 +-phosphate} ou réactifs Lipofectamine. L'inconvénient de l'électroporation est qu'il nécessite plus de cellules (comme beaucoup ne survivent pas au processus) et réactifs commerciaux coûteux. Pour des raisons qui ne sont pas claires pour nous, pas chaque membrane intègre DID. En outre, seule une fraction des cellules sur la capsule sont transfectées. Trouver des cellules qui sont transfectées et sont bien colorées avec n'ai peut être consommatrice de temps et c'est pourquoi l'optimisation des conditions pour la coloration et l'électroporation vaut bien l'effort.

En résumé, cette uneArticle décrit comment pTIRFM est mis en œuvre pour surveiller les déformations de la membrane rapides et localisées qui se produisent lors de la fusion des vésicules à cœur dense dans les cellules chromaffines bovines. Bien qu'une seule demande ne soit examinée, la technique est idéale pour l'étude d'autres processus biologiques qui impliquent des changements dans la forme de la membrane, dont l'endocytose, la cytocinèse, et la motilité cellulaire.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
iXon3 EMMCD Camera	Andor	897
IX81 Inverted Microscope	Olympus		Side-mounted Filtercube Assembly
43 Series Ar-Ion Laser	CVI Milles Griot Laser Optics	543-AP-A01	Tunable to 488nm
Sapphire 561 LP Diode Laser	Coherent		561nm
Scanning Galvo Mirror System	Thorlabs	GVS102
VC3 Channel Focal Perfusion System	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Quartz MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 PSI Pressure Regulator	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulator	Burleigh	TS 5000-150
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube	Thorlabs	PBS201
Six Station Neutral Density Wheel	Thorlabs	FW1AND
Stepper-motor Driven SmartShutter	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp Dichroic Filter	Chroma	NC255583	Joins 488nm and 561nm beams
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	Diverges 488nm beam
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	Diverges 561nm beam
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 125mm VIS 0	Focuses both beams
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	Cemented to filter cube assembly
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	Filtercube dichroic
z488/561_TIRF Emission Filter	Chroma	z488/561m_TIRF	Filtercube emission
UIS2 60x Objective	Olympus	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph Imaging Software	Molecular Devices
DiI Membrane Dye	Invitrogen	V-22885	For Alignment Purposes
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAse I Type IV from bovine	Sigma	D5025
Hemocytometer	Fisher	0267110
DiD Membrane Dye	Invitrogen	D-7757
Rhodamine	Invitrogen	R634
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres	Polysciences	19507	0.5 microns
Immersion Oil	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Controlls galvo mirrors
Spinner Flask	Bellco	1965-00250