PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

Özet

Polarizasyon tabanlı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (pTIRFM) hücre zarı dinamiklerinin gerçek zamanlı algılama sağlar. Bu makalede, düzenlenmiş Ekzositoz sırasında zar yeniden çalışma için pTIRFM uygulanmasını tarif etmektedir. Teknik doğrudan veya dolaylı membran şekil değişiklikleri içeren hücre biyolojisi diğer işlemler için genellenebilir.

Özet

Ekzositoz dinamikleri yeni bakış açıları kazanmak için, bizim grup tam vezikül ve plazma zarlarının füzyonu sırasında düzenlenmiş olması gerekir lipit katman şeklinde değişiklikler üzerinde duruluyor. Bu hızlı bölgesel değişiklikler, lipidler ve membran eğriliği kontrol özel bir protein arasındaki dinamik etkileşimleri ile elde edilir. Bu tür etkileşimlerin olmaması sadece vesikül füzyon için yıkıcı sonuçlara sahip, ancak membran şeklin kontrolü ile ilgili olduğu diğer hücresel fonksiyonların bir ev sahibi olmaz. Son yıllarda, zar-şekillendirme özellikleri olan bir dizi protein kimliği tespit edilmiştir. Ne eksik kaldığı zaman, nerede ve nasıl füzyon ve içerik serbest ilerleme olarak hareket bir yol haritasıdır.

Membran yeniden etkinleştirmek moleküler olayların anlayışımız tarihsel membran eğrilik duyarlı veya zamansal çözünürlük TRAC zorunda analitik yöntemlerin eksikliği ile sınırlı olmuşturhızlı değişikliklerin k. PTIRFM Bu kriterlerin ikisi de karşılar. Biz pTIRFM yoğun çekirdek vezikül (AEOV) füzyon sırasında kromafin hücre zarlarının yönde hızlı, submikron değişiklikleri görselleştirmek ve yorumlamak için nasıl uygulandığını tartışmak. Kullandığımız kromafin hücreler sığır adrenal bezlerinden izole edilmiştir. Zar, bir lipofilik karbosiyanin boya, 1,1 '-dioktadesil-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-klorobenzensülfonat ile boyanmış ya da olduğunu gösterdi. "Sabit" yönlendirme ile membran düzlemde intercalates yaptım ve kaybolan alanın kutuplaşma nedenle duyarlıdır. -Lekeli yaptım hücre zarı bir 561 nm lazer (p-pol, s-pol) ortogonal polarizasyonlar sıralı heyecanlı. Bir 488 nm lazer füzyon moment vezikül bileşenleri ve zamanı göstermek için kullanılır. Ekzositoz yerel olarak depolarize edici KCI çözeltisi ile perfüze hücreler tarafından tetiklenir. Analiz nasıl yaptığını anlamak için özel yazılmış yazılımını kullanarak çevrimdışı yapılıremisyon yoğunluğu değişiklikler füzyon gözenek genişlemesi ile ilgilidir.

Giriş

Ekzositoz uygun yürütülmesine tam orkestra için zar bilayeri şeklinde aşırı değişiklikler gerektirir. Önceki füzyon, granül altında plazma zarının lokal bükülme ikili katmandan etkileşimi için enerji bariyerini azaltmak için kısmen oluşur. Zarlar daha sonra birleştirme gibi, yüksek bir eğrilik alanları oluşturulur ve stabil olması gerekir. Son olarak, kaynaşmış membranlar füzyon gözenek genişletmek ve içerik salınımını ¹ etkinleştirmek için onların ilk eğilebilir gerekir. Tek başına zarlar dramatik ve koordine değişikliklere olası olduğu için, proteinler olaylara aracılık için gereklidir. Ama nasıl füzyon sürecinde membran topoloji değişiklikleri etkilemek için hareket çok açık bir soru kalır.

In vitro modellerde iyi membran eğrilik görselleştirmek için vardır. Negatif leke EM kullanımı, örneğin, iki büyük kaçakçılık p eylemler için geçerli moleküler modelleri şekillendirmek için önemli olmuşturroteins - synaptotagmin ve Dynamin (değerlendirmeleri için, Chapman ² ve Henshaw ^3). Ekzositoz çoğu gerçek-zamanlı tahlilleri doğrudan eğrilik tespit yok. Bunun yerine, eğrilik lümene ilişkin yük serbest ^4-8 ya da zar bölgesinde ^9-11 değişim kinetiği deneyleri rapor anlaşılmaktadır. PTIRFM membran mikroskobik değişikliklerin doğrudan, gerçek zamanlı ölçümler sağlayarak in vivo ve in vitro çalışmalar arasındaki köprü.

PTIRFM, bir nonimaging modunda, bir model membran ^{12 içerisine} dahil NPD-PE yönünü ölçmek için Axelrod ve arkadaşları tarafından öncülük edilmiştir. Bu teknik, daha sonra DII ve FM1-43 ^13-18 etiketli canlı hücrelerde dinamik değişimleri görselleştirmek için uygulanmıştır. P-polarizasyon (insidans düzlemi içinde) ve (yansıma düzlemine dik) s-polarizasyon: pTIRFM olarak, iki alan polarizasyonlar kaybolan bir sekans, bir zar-gömülü prob uyarmak için kullanılır. Önceki görüntüleme için, prob - bu durumda, yaptı - kısa bir süre için, hücre dışı ortama ilave edilir ve incelenmesi gereken hücrelerin plazma zarlarında enterkale bırakılır. Membran (zar fırfır veya çentiğe gibi) coverglass için paralel olmayan olduğu bölgelerde, aynı zamanda paralel olmayan olacaktır yaptı. Bu nedenle, bu bölgeler, p-pol ışını ile uyarılabilir olacaktır. P-pol ışın daha az etkili çoğunlukla coverglass paralel olan membran bölgelerde yaptım heyecanlandıracak. Piksel-piksel oranı görüntüleri (P / S), bu nedenle, özellikle membran deformasyon bölgeleri vurgulamak olacaktır yaptım sıralı p-ve s-pol uyarma gelen emisyon raporlama. Teorik olarak, P / S oranı görüntüleri hassas olan bilgisayar simülasyonları ¹⁸ öngördüğü değişikliklerin genliği ile coverglass plazma zarı sapma, hatta küçük açılarla. P / S görüntüleri de coverglass yüzeyinden fluoroforun mesafe bağımsız ve Yerel Fluoroforkonsantrasyonu. Yerel florofor konsantrasyon yerine P emisyon piksel-piksel toplamı ve 2 kez S emisyon (P +2 S) rapor görüntüleri ile sağlanmaktadır. P 2 S ölçüm bazı mümkün az ya da hiç bir değişiklik ile, girinti tam geometrisi duyarlıdır. Bu bilgisayar simülasyonları ile gösterilebilir ki bir sonraki durumuna ^16,18 (a dar boyunlu yani) erken bir füzyon gözenek modeli geçişler. P, bir dar boyunlu ile plazma zarına bağlanmış bir kaynaşık vesikülün 2 S (ve daha arayüze kapattı mı) (daha geniş bir gözenek ile kaynaşmış bir vezikül daha, örneğin, daha büyük olduğu tahmin edilmektedir burada yaptım) yiten alanın dimmest parçası içinde.

Bu yazıda, pTIRFM hayata ve füzyon gözenek genişlemesi sırasında meydana gelen membran şeklinde hızlı, lokalize değişiklikleri incelemek için kullanılır nasıl tartışacağız. Sadece bir uygulama açıkça di ikenscussed, yöntem doğrudan veya dolaylı olarak zar yeniden dahil diğer hücre biyolojik süreçlerin çeşitli genellenebilir bulunmaktadır.

Protokol

1.. PTIRF Sistem Kurulumu

PTIRFM teknik ters bir mikroskop platformu üzerine inşa edilmiştir. Lazer ışınları bir yan aydınlatma liman ve bir nonpolarizing yan bakan filtre küp aracılığıyla yönlendirilir, ve sonra 60X 1.49 NA TIRF objektif arka odak düzlemi üzerine odaklanmıştır. Mikroskop ve kamera arasında EMCCD emisyon yolu iki ek lens (1.6X ve 2X), yaklaşık 80 nm'lik bir nihai piksel boyutunu verir. Lazer ışınları epi-ve toplam iç yansıma (TIR) ​​aydınlatma arasında hızlı geçiş için yazılım kontrollü galvanometre aynalar kullanılarak yönlendirilir. Aşağıda tarif edilen protokol TIRF için optik zaten florofor uyarma ve görüntüleme için uygun pozisyonlarda hava masaya yerleştirilmiş olduğunu varsayar. Bu polarizasyon optik hücre zarı deformasyonların görüntüleme sağlamak için varolan TIRF mikroskop set-up eklenir nasıl açıklar. TIR ve polarizat hem üretmek için bizim laboratuarın optik set-up şematikiyon bazlı TIR Şekil 1A'da gösterilmiştir. Protokol karbosiyanin boyanın görüntüleme için floresan vezikül proteinlerin uyarılması için bir 488-nm lazer kullanımı ve 561 nm lazer varsayar yaptım.

1. Tüm mikroskop bileşenleri, lazerler, ve bilgisayarlarda güç.
2. 488 nm lazer Şekil 1A'da gösterildiği gibi, 1.49 NA merceğin arka odak düzlemi (BFP) bir kiriş Doğrudan. Lazer ışını BFP odaklanmıştır, bu paralelleştirilmiş ortaya ve doğrudan objektif yukarıda tavana küçük iyi tanımlanmış nokta görünür.
3. X galvanometre ayna (eşdeğer örnek düzlemde bulunan ayna) ayarlayın, böylece lazer ışını eksen dışı hareket ve objektif normal kademeli dik açılarda hedeften ortaya çıkar.
4. Sonraki, TIR elde doğrulayın. Bir cam alt tabak içinde PSS bir 1 ml hacme flüoresan mikro 10 ul ekle. O alt mikro sadece flüoresançanak f, TIR arayüzüne yakın, tespit edilmelidir. Yüzer mikro tespiti gelen ışık ve objektif, normal arasındaki açı yetersiz olduğunu gösterir.
   
   Aşağıdaki bölümde, polarizasyon tabanlı görüntüleme için gerekli optik bileşenlerin set-up açıklanır.
5. Bir aynı optik yol boyunca hareket eden, böylece bir kılavuz olarak hizalanmış 488 nm ışın kullanarak, ham 561 nm lazer ışınının konumunu ayarlamak. 561 nm lazer karbosiyanin boyanın görüntüleme için kullanılacak yaptım.
6. 561 nm lazer aşağı bir farklılaştı lens ve aynalar yerleştirin. , Aynalar kullanılarak, bu 488 nm ışını ile coaligned böylece ışın ayarlamak ve galvano aynalar "0" konumunda olduğunda nokta tavana noktasını oluşturur.
7. Lazer açıklığın hemen alt baş ışın yolunda bir çeyrek dalga plakası (QW) ortalayın. Renksiz ya da dalgaboyu için ayarlanmış olan bir ya da QW kullanın.Bir QW dairesel optik ekseni ile 45 ° 'lik açıyla giren herhangi bir doğrusal polarize ışığı kutuplaşmaya olacaktır. Böyle polarizasyon küpler gibi bazı optik bileşenleri, kutuplaşma bir eksen yönünde bir zayıflatma önyargı var. QW bu önyargı telafi etmek için döndürülebilir. Bu ayarlama, eliptik olarak polarlanmış ışın neden olur. Bu açıklıktan çıkar gibi, lazer huzmesi, yüksek doğrusal (dikey olarak) polarize olduğu için A QW gereklidir.
8. Eliptik polarize ışının aşağı bir polarizasyon küp (PC1) yerleştirin. Polarizasyon küp elektrik alanının dikey (y) bileşeni yansıtır ve yatay (x) bileşen geçer. Polarizasyon küp polarizasyon ışın yolları takip eden hizalanmasını kolaylaştırmak için küçük bir çeviri kademesi üzerine yerleştirilmiştir.
9. Işınlarını recombine ikinci bir kutuplaştırıcı küp (PC2) ve aynalar (Şekil 1A) kullanın.
10. İlk polarizasyon küp (PC1) ve dikey işbirliği arasında bir deklanşör yerleştirinmponent ayna. Yatay bileşen ayna ve ikinci polarizasyon küp (PC2) arasında ikinci bir deklanşör yerleştirin. Bu perdeler hızla ışın kutuplaşmalar arasındaki seçmesini sağlayan görüntüleme yazılımı tarafından kontrol edilir.
11. Her ışın yolu elektrik alan yönünü doğrulamak için bir polarizasyon filtresi kullanın. Bir polarize filtre yalnızca filtrenin ekseni doğrultusunda iletimini sağlayacak.
12. Lazer ışınının dikey ve yatay bileşenleri birbirlerine ve 488 nm ışın ile hizalanmış olduğundan emin olun. Gerekli ayarlamaları yapın. Üç kirişler, tüm BFP odaklanmış ve tavana aynı noktaya hedeften collimated ortaya edilmelidir. Bu noktada gelecek uyumu kolaylaştırmak için bir X ile işaretlenmiş olabilir.
13. Amaç üzerinde daldırma bir damla yağ koyun. Amaç üzerinde floresan küreleri içeren çanak (yukarıdaki adım 4) yerleştirin.
14. X galvanometre aynayı hareket ettirerek TIR girin. TIR, dikey componen içindekirişin t s-pol ve kirişin yatay bileşen artık p-pol olmasıdır. QW plakayı çevirerek kirişler arasındaki göreli yoğunluğunu ayarlayın. Rastgele odaklı öngörülmektedir bir rhodamine numune, her polarize yiten alanını görüntüleyebilirsiniz. Ortalama piksel yoğunlukları maç QW plakasını döndürün. Gerekirse, yoğunluğunu azaltmak için bir polarize ışın yolunda bir nötral yoğunluk filtresi eklemek.

2. Kromafin Hücre İzolasyonu

Baldır adrenal bezi sağlıklı kromafin hücrelerinin izole edilmesi için bir prosedür aşağıda verilmiştir. Bu Wick, Senter ve diğ. ¹⁹ ve O'Connor tarafından, daha önce yayınlanmış protokollere uyarlanmıştır, Mahata et al. ²⁰ izole edildikten sonra, hücrelere, bir elektroporasyon sistemi kullanılarak ilgi plazmid (ler) ile elektroporasyona edilir. İstenen floresan proteinleri ifade eden hücrelerin% 20-30 Bu sistem elde edilir. Tipik olarak, hücrelerin% 70'i hayatta seçecekroporation süreci. PSS ve ortam bileşenleri detayları Tablo 2, 3 ve 4 de verilmiştir.

1. İki gün hücre hazırlık, 1.25 ml sığır kollajeni, ardından 1 mL poli-D-lisin (0.1 mg / ml) ile birlikte 35 mm optik kalitede cam alt (kalın 0.17 mm) yemekler tedavi. Doku kültürü kaputu kuru hava yemekleri bırakın.
2. Mezbahaya sığır adrenal bezleri edinin. Onlar laboratuara geri taşınır ise buz üzerinde bezleri tutun. Sığır adrenal bezleri yağ kalın bir tabaka ile kaplı olabilir. Aşırı yağ çıkarmak ve adrenal ven açıklığı ortaya çıkarmak için cerrahi makas kullanın. Bezi kan temizlendi kadar art arda hazırlık-PSS ile ven serpmek.
3. Daha sonra, yavaş yavaş bezi şişer kadar damar açıklığı içine TH-PSS çözeltisi 2 ml pipetle. 15 dakika boyunca 37 ° C 'de şişirilmiş bezleri inkübe edin. TH-PSS tedaviyi tekrarlayın ve tekrar kuluçkaya yatmaktadır.
4. S ile bezinin kenarında dış adrenal korteks ile kesticissors ve medulla maruz ayrı bezi kabuğu. Hafifçe kazıyın ve kortikal doku medullayı ayırmak için bir neşter kullanın.
5. 5-10 dakika süreyle neşter bir çift medulla kıyma.
6. Son bir sindirim adımı tek kromafin hücreleri izole etmek için gereklidir. Bir dönen şişe içerisine kıyılmış hücre süspansiyonu dökün. Kısmen TL-PSS (15 mi) TH-PSS (30 mi) bir 02:01 oranı ile şişe girip yaklaşık 100 rpm'de dönen ise 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
7. Bir 400 um elek içinden süzme ile sindirilmemiş doku, bireysel kromafin hücreleri ayırın. Filtrat toplayın. 200 pelet hücreleri xg ve buz soğuk PSS'teki tekrar süspansiyon santrifüj.
8. Bir 250 um ağ gözü, pelet yoluyla hücrelerin filtre ve son olarak (adım 2.9 bakınız), elektroporasyon tamponu içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
9. Hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı ve nakil için hazırlamak.
10. Göre olan elektroporasyon sistemi hücreleri transfekteüreticinin önerileri. Elektroporasyon için kesin koşullar ampirik olarak belirlenmelidir. Not: sığır kromafin hücrelerin bu hazırlık için transfeksiyon verimlilik ve hücre sağkalım oranı arasındaki en iyi dengeyi sağlayacak ayarları 1,100 V, 40 msn, ve 1 darbe. Biz, bu koşullar ile, hücrelerin transfekte% 20-30 olduğu tahmin edilmektedir. Hücrelerin yaklaşık% 30 elektroporasyon sürecini hayatta yok.
11. Yavaşça, poli-D-lisin ve kollajen levhalar hücreleri elektropore ısıtılmış ortam 1 ml yemekler işlemden geçirildi.
12. Bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde yemekleri Sıra (% 5 _CO2). 6 saat sonra her bir tabak için 2x antibiyotik ortam 1 ml ilave edilir. Ertesi gün normal medya ortamı değiştirin.
13. Kromafin hücreleri genellikle 2-5 gün elektroporasyon sonra görüntülenmiş.

3. pTIRF Image Acquisition

1. Görüntüleme sistemi üzerinde güç ve satın alma yazılımını başlatmak.
2. Lazerler uyumlu olduğunu doğrulayın. Fani edinmikro küreleri kullanarak alan profili.
3. Küresel ve yerel perfüzyon sistemi hazırlayın. Temiz çözelti filtre deiyonize H ₂ O ile rezervuarlar ve bazal ve PSS çözümler uyarıcı ile doldurun.
4. Kromafin hücreleri görüntüleme önce, p-pol ve s-pol uyarılmaları görüntüleme alanının aynı bölge aydınlatmak ve aydınlatma yoğunlukları kabaca eşdeğer olduğunu doğrulamak. Bunu yapmak için, 10 mM'lik bir son konsantrasyonda rodamin PSS içeren 2 ml bir cam alt çanak doldurun. Sırayla p-pol ve s-pol ışık ile rodamin örnek heyecanlandırmak ve görüntüleri yakalayabilir. Uygulamada, mı gelen P ve S emisyon P ve S rodamin emisyonlarının ortalama normalize edilmiştir. Daha fazla ayrıntı için Görüntü Analizi ve Tartışma bölümlerine bakın.
5. Şimdi yaptım ile sığır kromafin hücrelerin boyanması geçin. Kromafin hücreleri içeren çanak kültür ortamları durulayın ve bazal-PSS 2 ml ile değiştirin. 10 mM'lik çözeltiden 10 ul (etanol içinde seyreltilmiş) yaptıdoğrudan hücreleri ihtiva eden çanak. Yavaşça 2-10 saniye boyunca yemek ajitasyon ve yaptım + PSS çözüm kaldırın.
6. Herhangi bir kalıntı DID kaldırmak için bazal-PSS ile çanak 3-4x yıkayın. Hücreler artık lekeli ve kullanmaya hazırdır.
7. Hedefe daldırma bir damla yağ ekleyin. Objektif üstüne yaptım-lekeli kromafin hücreleri içeren tabak yerleştirin.
8. Objektif aracılığıyla veya kamera ya çanak görüntülerken, ilgilenilen protein ile transfekte ve muydunuz ile boyanmış bir hücreyi bulmak. İyi boyanan hücre canlı hücrenin kenarlarını vurgular P emisyon gösterir; S emisyon hücre ayak izi boyunca kabaca eşit olmalıdır (cama yapıştırılır ve TIRF görüntülü hücrenin bölgesi, yani.)
9. Bu aşağı yukarı 100 um uzak hücreden böylece yerel perfüzyon iğne yerleştirin.
10. Hücre zarı odaklanın ve hemen hücre stimülasyon / görüntü elde önce otofokus donanım etkinleştirin.
11. Görüntü alımı başlar. Bir depolarize 56 mM KCI çözeltisi ile 60 saniye daha sonra, taban çözelti ile 10 saniye için hücreleri serpmek. Hızla 561 nm p-pol arasındaki perde ise görüntüleri almak, 561 nm s-pol (P değişiklikleri yaptım ve S emisyonu izlemek için) ve (görüntü transfekte vezikül prob için) 488 nm uyarma. Deneyler sırasında elde edilen görüntü örnekleri Şekil 2 ve Şekil 3 'de gösterilmiştir.

4. Görüntü Analizi

Görüntü işleme için hesaplamalar ImageJ ile yapılabilir, ancak IDL veya Matlab gibi esnek bir programlama dili kullanarak komut ölçüde görevi otomatik tarafından analiz verimini artırabilir. Görüntülerin iki tip ham emisyon görüntüler topolojik bilgi edinmek için hesaplanması gerekir -. P / S ve P +2 S P +2 S toplamı belirli bir bölgedeki toplam membran boya bildiriyor P / S yerel membran deformasyonlar raporlarıAlanın.

1. Tüm resimler plan çıkarılmalıdır. , Bir off-hücre ROI seçin ROI ortalama piksel yoğunluğunu ölçmek ve daha sonra görüntü yığını tüm pikseller bu değeri çıkarılarak.
2. , P / S hesaplamak sonraki "S" emisyon çerçeve (piksel-piksel) ile her bir "P" emisyon çerçeve bölün. P / S, p-ve S-pol kuvvetlerin, nispi yoğunlukları, önyargıları göre değişir optik sistem ve girişim saçakları. Bu etkileri azaltmak 10 mM rodamin ¹⁸ ihtiva eden bir çözelti ile elde edilen oran için yaptığı emisyon elde edilen gelen P / S oranı normalleştirmek için.
3. Bireysel DCVs ekzositozu gibi Synaptotagmin-1 pHluorin (Şekil 2B) gibi bir floresan protein vezikül, yoğunluğundaki bir ani değişimin bellidir. P / S lokalize artışlar üzerinde merkezli bir 240 nm yarıçapı ROI piksellerin ortalama P / S ve P 2 S değişiklikleri belirlemekekzositoz sitelerde oranı. Füzyon P / S, belirgin bir artış olmadan oluştuğunda, ROI DCV eritme bölgesi üzerine ortalanır.
4. Bilgisayar simülasyonları bir genişleten füzyon gözenek basit geometriler açısından P / S ve P +2 S membran yoğunluğu değişiklikleri yorumlamak için yapılabilir. Simülasyonları ayrıntılar için Anantharam vd. ^18'e bakın lütfen

Sonuçlar

Konvansiyonel ve polarize TIRFM görüntüleme teknikleri aynı hava masaya uygulanmaktadır. Optik elemanların konfigürasyonu uyarma ışık polarize edilir önemli fark (Şekil 1A) ile benzerdir. Polarize ışık tercihen polarizasyon yönünde emme dipollerde florosforlar heyecanlandırıyor. PTIRFM zar topolojik değişiklikleri izleyerek etkili olduğu için bu nedenle, kullanılan prob sabit bir yönlendirme ile zardaki enterkale gerekir. Floresan karbosiyanin boyalar (DII yaptım) membran düzleminde (Şekil 1B) geçiş dipollerde yönlendirilmiş bir şekilde lipit tabakalarının içine enterkale. -Etiketli yaptım membranların P-polarize aydınlatma (Şekil 1C) seçici lamel eğik florosforlar (Şekil 1B RED ve 1D) heyecanlandırıyor.

Kromafin hücrelerinin Exuberant membran etiketleme ab sonra elde ediliryaptı. Şekil 2A ile rief inkübasyon iyi boyanmış bir hücre zarının bir örneğini göstermektedir. Sağlıklı, yapışık hücre P ve S emisyonlarında belirgin farklılıklar gösterecektir. P emisyon görüntüsü hücrenin geri kalanına göre daha parlak bir sınır hücre gösterir. S emisyon görüntüsü hücre ayak izi boyunca kabaca homojen floresans gösterir. Hesaplanan piksel-piksel P / S ve P +2 S görüntüleri sırasıyla membran eğrilik ve boya konsantrasyonu, duyarlıdır. Gösterilen kromafin hücresi ayrıca salgı vezikülleri (Şekil 2B) etiket Synaptotagmin-1 pHluorin (Syt-1) ile transfekte edilmiştir.

Kromafin hücre, hücre zarını depolarize ve eksositosizini tetiklemek için 56 mM KCI ile uyarılır. Parlak floresan Syt-1 pHluorin yerlerinden bir dizi aniden DCVs sigorta (Şekil 2B, sağ panel) olarak belirginleşmiştir. Beyaz bir kutu, bir füzyon olayı (Şekil 2B, sağ panel) etrafında çizilir. Bu füzyon olayı iŞekil 2C ve 2D analiz var. Şekil 2C Syt-1-pHluorin, P / S ve P +2 S görüntü şiddetleri de kare kare değişiklikleri gösterir. Protein sitesi füzyon (Şekil 2D) uzağa doğru difüzyon yaparken SYT-1 floresans yoğunluğu hızlı bir şekilde azalır. Erimiş vezikül / plazma zarı kompleksini temsil girinti nispeten yavaş bir hızda (Şekil 2B grafikleri Not) de azalır. Illüstrasyon (Şekil 2E) bu ölçümlerin her biri yorumunu gösteriyor.

Şekil 2'de gösterildiği gibi, hızlı ve lokalize zar şekil uyarıyla tetiklenen ^{Ca2 +} akışı bir sonucudur. Bu, Şekil 3A'da gösterilmiştir. A kromafin hücre genetik Ca ^{2 +} göstergesi GCaMP5G ^21,22 ile transfekte edilmiş ve 56 mM KCI ile uyarılır. Membran depolarizasyon (GCaMP5G floresanın belirgin bir artışa neden olmaktadır ng> 3A ve Şekiller 3B) subplasmalemmal artışa ^{Ca2 + düzeyi} gösterme. Hücrenin bir 30 x 20 piksel seçilir ve GCaMP5G, P / S, ve P 2 S piksel yoğunlukları çerçeve kare değişiklikler görüntüleri (Şekil 3B) ve şemalar (Şekil 3C) 'de gösterilmiştir. Time "0" Bir değişiklik, bir P / S önce çerçevesini belirler (ekzositoz önce, yani kare) açıktır. Beyaz ok başları membran deformasyon (P / S artış) P 2 S emisyonunda azalma ile birlikte olduğunu işaret eder. Sitosolik protein GCaMP5G kaynaşık DCV ile alanından hariçtir. Ayrıca Şekil 3C'de, sol panelde 0 zamanında GCaMP5G yoğunluğunda ani düşüş dikkat edin. Uzun ömürlü P / S artış ve P 2 S azalma yavaş yavaş (Şekil 3D) genişletir bir füzyon gözenek öneririz.

/ Files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg "/>
Şekil 1. PTIRFM tekniği için illüstrasyonlar. A) polarizasyon bazlı TIRF görüntüleme ile, geleneksel bir araya getirilmesi için bir şema gösterilmiştir. Bir çeyrek-dalga (QW) plaka eliptik lazer ışınını kutuplaştırmak için 561-nm safir lazer önünde yerleştirilir. Bir polarize küp (PC1) düz dikey (V) ve yatay (h) bileşenlerine polarizasyonda ayırmak için kullanılır. Dikey ve yatay bileşenleri TIR yüzeyde, sırasıyla p-pol ve s-pol uyarma kirişler hale gelir. P-pol ve s-pol yolları bağımsız (S1 ve S2) kepenk indirdi. Onlar aynalar ve ikinci bir kutuplaştırıcı küp (PC2) ile yeniden birleştirilir. Onlar bir ayna oluşan ve çift renkli ayna (DC) nonpolarizing bir ışın direksiyon elemanı vasıtasıyla 488 nm ışın (ayrıca bağımsız S3, kepenkli) katılacak. Lensler (L) ışınlarını genişletmek ve odaklanmak için kullanılır. Combined 488-nm ve 561-nm kirişler galvano via mikroskop a yan ışıklandırma port to direksiyonlametre aynalar (GM). Onlar objektif arka odak düzlemi (BPP) için odak. Florofor ikinci fotonların) bir PC. B'ye bağlı olan bir EMCCD kamera ile çekilen mı etiketleme kısaca fazlasının ayrılması için, art arda boya ve yıkama ile hücrelerin inkübe edilmesi ile gerçekleştirilir. DiD kabaca gösterildiği gibi insidansı (p-pol) düzleminde polarize gelen ışık, arabirime, normal ağırlıklı olarak polarize olan genliği azalan bir alan oluşturur, zar uçak. ° C) içindeki geçiş dipol momentleri ile membran içinde intercalates. D) p-polarize ışık ile bir etiketli yaptım zar aydınlatma seçici coverglass-eğik (RED) olan bu florosforlar heyecanlandıracak. Bu bir s-polarize yiten alanı olsaydı, coverglass paralel olan bu flüoroforlar yerine (SİYAH) heyecanlı olacaktır.

Şekil 2. trong> pTIRFM ile İzleme hücre zarı deformasyonlar. A) hesaplanır P / S ve P +2 S emisyon görüntüleri ile birlikte Ham P ve S emisyon görüntüleri gösterilir. Ölçek çubuğu, 3.2 mikron. B) Syt-1 pHluorin ifade A kromafin hücre KCl ile depolarize. Parlak floresan noktalar (sağ panel) bir dizi bireysel DCVs füzyon göstermektedir. Ölçek çubuğu, bir eritme Syt-1 pHluorin DCV 3.2 mikron. C) Kare kare görüntüleri. (Görüntülerin yukarıda) Times saniye vardır. Zaman 0 DCV füzyonu önce çerçevesini belirler. Karşılık gelen P / S ve P +2 S emisyon görüntüleri de gösterilmiştir. .. Füzyon çerçevesi E) C ve D sonuçlarından biri olası yorumlama gösterilir - Ölçek çubuğu 1 mikron D) Grafikler C. Noktalı çizgi görüntüler için zaman 0 olduğunu. "boş> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3.. Deformasyonlar uyaran-uyarılmış Ca ^{2 +} akını bir sonucudur. A) GCaMP5G ile transfekte edilmiş bir hücre kromafin 56 mM KCI ile depolarize edildi. GCaMP5G floresansta bir artış ortaya çıkan görüntüler üzerinde A. Times hücrenin 30 x 20 piksel alanının kare-çerçeve görüntüleri saniye içindedir subplasmalemmal bir artış Ca ^{2 +} kat. B) anlamına gelir. Beyaz ok uçları P / S artış ve P +2 S azalma bölgesini göstermektedir. Sitozolik GCaMP5G protein kaynaştırma DCV tarafından bölgeden çıkarılmıştır. B. gösterilen görüntüler için Ölçek çubuğu, 1 mikron. C) Grafikler D) B ve C sonuçların Bir olası yorumlama gösterilmiştir.3highres.jpg "target =" _blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

iXon3 EMMCD Kamera	Andor	897
IX81 Ters Mikroskop	Olimpos		Yandan monteli Filtercube Meclisi
43 Serisi Ar-Ion Lazer	CVI Milles Griot Lazer Optik	543-AP-A01	488 nm için ayarlanabilir
561 LP Diode lazer Sapphire	Tutarlı		561 nm
Galvo Ayna Sistem tarama	Thorlabs	GVS102
VC 3 Kanal Odak Perfüzyon Sistemi	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Kuvars MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA-4 QMM
10 psi Basınç Regülatörü	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipülatör	Burleigh	TS 5000-150
Atlı Akromatik Çeyrek Dalga Plaka	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680 nm Polarize zayiflatıcı Cube	Thorlabs	PBS201
Altı İstasyonu Nötr Yoğunluk Tekerlek	Thorlabs	FW1AND
Step motor Driven SmartShutter	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp Dikroyik Filtre	Renk parlaklığı	NC255583	488 nm ve 561 nm kirişler Katıldı
Kaplı-konkav mercek	Edmund Optik	PCV 100mm VIS 0	488 nm ışın uzaklaşmakta
Kaplı-konkav mercek	Edmund Optik	PCV 250mm VIS 0	561 nm ışın uzaklaşmakta
Kaplı Plano-Konveks Lens	Edmund Optik	PCX 125mm VIS 0	Iki ışınlarını odaklanır
Kaplı Plano-Konveks Lens	Edmund Optik	PCX 50mm VIS 0	Küp düzeneğini filtrelemek için çimentolu
z488/561rpc Dikroyik	Renk parlaklığı	z488/561rpc	Filtercube dikroik
z488/561_TIRF Emisyon Filtre	Renk parlaklığı	z488/561m_TIRF	Filtercube emisyonu
UIS2 60X Amaç	Olimpos	UPLSAPO 60xO	NA 1.37
Neon Transfeksiyon System	Invıtrogen	MPK 5000
MetaMorph Görüntüleme Yazılımı	Molecular Devices
DII Membran Boya	Invıtrogen	V-22885	Uyum Amaçlı
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
Büyükbaş ikinci DNAse I Tipi IV	Sigma	D5025
Hemositometre	Balıkçı	0267110
Membran mı boyadın	Invıtrogen	D-7757
Rodamin	Invıtrogen	R634
0,22 um membran şırınga Filtre Ünitesi	Millipore	SLGS033SS
Floresbrit Polikromatik Kırmızı MİKROSFERLERİ	Polysciences	19507	0.5 mikron
Daldırma Yağ	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Kontroller aynalar galvo
Spinner Flask	Bellco	1965-00250

Tablo 1. pTIRF Mikroskopi ekipmanları.

Içindekiler	Hazırlık-PSS	Bazal-PSS	Stim-PSS
NaCl	145 mM	145 mM	95 mM
KCl	5.6 mM	5.6 mM	56 mM
MgCI2	-	0.5 mM	0.5 mM
CaCl2	-	2.2 mM	5 mM
Hepes	15 mM	15 mM	15 mM
pH	7.4	7.4	7.4
Glikoz	2.8 mM	5.6 mM	5.6 mM
Pen-Strep	1x	-	-

Tablo 2.. Perfüzyon ve kromafin hücre hazırlık çözümleri.

Içindekiler	Electroporating Medya	Normal Kaplama Medya	2x Antibiyotik Medya
1x DMEM/F-12	1 ml / plaka	2 ml / tabak	1 ml / plaka
FBS	% 10.	% 10.	% 10.
Sitozin arabinofuranosid (CAF)	-	10 mM stokta 1 ul / ml	-
Penisilin	-	100 ünite / ml	200 ünite / ml
Streptomisin	-	100 ug / ml	200 ug / ml
Gentamisin	-	25 ug / ml	50 ug / ml

Tablo 3. Kromafin Hücre Medya.

Içindekiler	TH-PSS	TL-PSS
TH Liberase	2 mi	-
Liberase TL	-	0.85 mi
Hazırlık-PSS	98.0 ml	84.0 mi
Dnaz	8.75 mg	7.4 mg

Tablo 4. TH-PSS ve TL-PSS Çözümleri.

Tartışmalar

Polarizasyon tabanlı TIRFM membran topolojisinde hızlı, mikroskopik değişiklikleri algılar. Tekniği uygulayarak TIRF optik zaten yerinde, özellikle nispeten basittir. Gerekli tüm çeyrek dalga plakası, iki polarize küpler, ve p-pol ve s-pol aydınlatma yolları ayırmak için kepenkleri olduğunu. Masaya bu bileşenlerin kesin konumu, genellikle mevcut olan yer ile belirlenir.

Membran topolojik bilgi elde etmek amacıyla, kullanılan floresan prob, bir sabit ya da bilinen bir yönlendirme ile enterkale gerekir. Bu teknik, bu makalede anlatıldığı gibi, bu tür FM1-43 ¹⁴ da kullanılabilir edilebilir karbosiyanin boya ancak diğer boyaların kullanılmasını varsayar. Zar, boyama işlemi kendisi basittir. Kültürlenmiş hücreler, canlı bir zarın elde edilmesi için etiketleme mi DII / 'küçük bir miktar için sadece çok kısa bir poz (10 saniyeden az) gerektirir. Fazla boya ekleme ışık saçılım aggreg yol açargörüntü kalitesini düşürecektir camına ates. Boya ile Over-hücrelerinin kuluçkalanması görüntü kalitesi ve muhtemelen hücre canlılığı üzerinde zararlı etkileri vardır içselleştirme boya yol açar. Bir hücre de lekeli ise, P ve S emisyon görüntülerde net bir ayrım olacaktır. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, P emisyon canlı S emisyon yoğunluğu hücre ayak izi üzerinde kabaca homojen olacak ise (hücre ayak izi kenarlarında örneğin) lamel eğik olan membran alanları vurgular. P ve S arasında net bir ayrım belirgin değilse, o zaman hücre kötü alt-tabakaya yapıştırılmış ya da hücre zarı sağlıklı değildir ve hücre deneyleri için kullanılmaz, olanaklıdır.

PTIRFM açıklayan önceki çalışmalar floresan membran sensörü olarak dII kullanılmaktadır. Bu diğer flüorofor GFP / pHluorin istihdam çift renkli görüntüleme deneyleri için uygundur çünkü burada, yaptığımız kullanmaktadır. Yaptığımız wi heyecanlandırmakBir 561 nm lazer yerine (kendi uyarma zirveye yakın) 640 nm lazer inci çünkü 640 nm daha hızlı flüoroforun beyazlatıcılar. 561 nm lazer yayınlanmış uyarım spektrumu, floresan verimli yayılan muydunuz kuyruk olduğu gerçeğine rağmen. 561 nm lazer diğer avantajı hem dII heyecanlandıran ve hem de problar için aynı polarizasyon ayarlarını kullanmak için bize sağlayan olmasıdır. Zardaki fluorofor oryantasyon zar topoloji yorumlanmasını etkileyecek unutmayın. (DII ile mi ya da olduğu gibi, daha çok paralel, ya da neredeyse paralel bir yerine) bir florofor membran düzlemine dik olan geçiş dipoller ile oryante edilmiştir, örneğin, daha sonra düzlemsel olmayan zar bölgelerde daha kolay bir şekilde S ile vurgulanır yerine olacak P emisyon.

Ayrıca, sığır adrenal kromafin hücrelerinin izolasyonu ve elektroporasyon teknikleri tarif eder. Sığır kromafin hücre mükemmel secretory modeli. Bu salgılatıcı çeşitli duyarlı kültür içinde bakımı kolay olan ve hali hazırda geleneksel ışık mikroskopisi ile görselleştirildiği büyük salgı vezikülleri sahip olma avantajlarına sahiptir. Floresan proteinleri ifade etmek için, hücreler önce kollajen ile muamele edilmiş kültür çanakları üzerinde kaplama süspansiyon içinde elektroporate edilmiştir. Bizim tecrübelerimize göre, ifade verimliliği Ca ^{2 +-fosfat} veya Lipofektamin reaktifleri ile ya daha elektroporasyon ile daha yüksektir. Elektroporasyon dezavantajı daha fazla hücre gerektirir (birçok olarak süreci hayatta yok) ve pahalı ticari reaktifler olmasıdır. Bizim için belirsiz nedenlerden dolayı, her zar yaptım içermektedir. Buna ek olarak, tabağına hücrelerin yalnızca bir kısmını transfekte edilir. Transfekte olan yaptım ve iyi lekeli hücrelerin bulma boyama ve elektroporasyon çabaya değer için koşulları optimize neden olduğu zaman alıcı olabilir.

Özet olarak, burticle pTIRFM sığır chromaffin hücreleri yoğun çekirdek veziküllerin füzyonu sırasında meydana hızlı ve lokalize membran deformasyonları izlemek için nasıl uygulandığını açıklar. Sadece bir uygulama yer almaktadır, ancak, teknik ideal endositoz, sitokinez ve hücre hareketi gibi zar şekil değişiklikleri, içeren diğer biyolojik süreçlerin çalışma için uygundur.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
iXon3 EMMCD Camera	Andor	897
IX81 Inverted Microscope	Olympus		Side-mounted Filtercube Assembly
43 Series Ar-Ion Laser	CVI Milles Griot Laser Optics	543-AP-A01	Tunable to 488nm
Sapphire 561 LP Diode Laser	Coherent		561nm
Scanning Galvo Mirror System	Thorlabs	GVS102
VC3 Channel Focal Perfusion System	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM Quartz MicroManifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 PSI Pressure Regulator	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
Manipulator	Burleigh	TS 5000-150
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube	Thorlabs	PBS201
Six Station Neutral Density Wheel	Thorlabs	FW1AND
Stepper-motor Driven SmartShutter	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp Dichroic Filter	Chroma	NC255583	Joins 488nm and 561nm beams
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	Diverges 488nm beam
Coated Plano-Concave Lens	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	Diverges 561nm beam
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 125mm VIS 0	Focuses both beams
Coated Plano-Convex Lens	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	Cemented to filter cube assembly
z488/561rpc Dichroic	Chroma	z488/561rpc	Filtercube dichroic
z488/561_TIRF Emission Filter	Chroma	z488/561m_TIRF	Filtercube emission
UIS2 60x Objective	Olympus	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph Imaging Software	Molecular Devices
DiI Membrane Dye	Invitrogen	V-22885	For Alignment Purposes
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
DNAse I Type IV from bovine	Sigma	D5025
Hemocytometer	Fisher	0267110
DiD Membrane Dye	Invitrogen	D-7757
Rhodamine	Invitrogen	R634
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres	Polysciences	19507	0.5 microns
Immersion Oil	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		Controlls galvo mirrors
Spinner Flask	Bellco	1965-00250