Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas

Resumen

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Resumen

Se ha logrado un progreso considerable en la última década hacia la identificación y caracterización de las enzimas implicadas en la síntesis (guanilato diguanylate) y degradación (fosfodiesterasas) del segundo mensajero c-di-GMP. Por el contrario, hay poca información disponible acerca de los mecanismos moleculares y componentes celulares a través del cual esta molécula de señalización regula una amplia gama de procesos celulares. La mayoría de las proteínas efectoras conocidas pertenecen a la familia Pilz o se degeneró guanilato diguanylate o fosfodiesterasas que han renunciado a la catálisis y han adoptado la función efectora. Por lo tanto, para definir mejor la red de c-di-GMP celular en una amplia gama de bacterias se requieren métodos experimentales para identificar y validar nuevos efectores para el cual fiable en las predicciones in silico fallar.

Recientemente hemos desarrollado una novela de captura compuesto Espectrometría de Masas (CCMS) tecnología basada como una poderosa herramienta parabioquímicamente identificar y caracterizar proteínas de unión a c-di-GMP. Esta técnica ha sido previamente informado para ser aplicable a una amplia gama de organismos ^1. Aquí se da una descripción detallada del protocolo que utilizamos para investigar tales componentes de señalización. Como un ejemplo, usamos Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista en la que c-di-GMP juega un papel crítico en el control de la virulencia y la biopelícula. CCMS identificó 74% (38/51) de los componentes conocidos o previstos de la red de c-di-GMP. Este estudio explica el procedimiento CCMS en detalle, y lo establece como una herramienta potente y versátil para identificar nuevos componentes que participan en la señalización de pequeña molécula.

Introducción

c-di-GMP es un segundo mensajero clave usada por la mayoría de las bacterias para controlar varios aspectos de su crecimiento y comportamiento. Por ejemplo, c-di-GMP regula la progresión del ciclo celular, la motilidad y la expresión de exopolisacáridos y adhesinas de superficie ^2-4. A través de la coordinación de tales procesos de c-di-GMP promueve la formación de biofilm, un proceso que está asociado con infecciones crónicas de una gama de bacterias patógenas ^5. c-di-GMP se sintetiza por enzimas llamadas guanilato diguanylate (PED) que albergan un dominio catalítico GGDEF ^4. Algunos PED poseen un sitio de inhibidor que regula hacia ....

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Protocolo

1. Preparación de lisado

1. Crecer P. aeruginosa células en LB a la DO deseada.
   NOTA: Para obtener orientación: utilizar ≈ 100 ml de cultivo / muestra para cultivos en fase estacionaria y ≈ 500 ml cultur / muestra para cultivos en fase log (OD _{600 nm} = 0,5).
2. Pellet por centrifugación durante 20 min a 5000 x g.
3. Resuspender 0,5-1 g de sedimento en 1 ml de tampón de lisis (MES 6,7 mM, 6,7 mM de HEPES, NaCl 200 mM, 6,7 mM Kac, DDT 1 mM, pH 7,5) y se añade inhibidor de la proteasa (mini completo, libre de EDTA), así como DNaseI.
4. Lisan las células mediante 3 pasos a través de una célula de presión fr....

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Resultados

Para identificar nuevos efectores c-di-GMP en P. aeruginosa se ​​utilizó sistemáticamente CCMS para analizar las fracciones solubles y de membrana de P. aeruginosa cepa PAO1 de un cultivo en fase log (OD ₆₀₀ = 0,5). Aquí resumimos y discutimos los resultados representativos de esta expedición de pesca. Se utilizaron cuatro réplicas biológicas independientes. Para cada experimento se utilizaron dos concentraciones CDG-CC diferentes (5 mM y 10 mM). Para investigar la especificidad, l.......

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Discusión

Especial cuidado se debe tomar en varias etapas del protocolo. La concentración de proteínas es un parámetro crítico con una concentración de 10 mg / ml siendo difícil de alcanzar cuando las células se cultivan bajo condiciones de crecimiento específicas (por ejemplo biofilms o pequeñas variantes de colonias). Por lo tanto, la resuspensión de pellets se debe realizar en un bajo volumen de tampón de lisis. Las concentraciones de proteína se pueden reducir a 8 mg / ml. En comparación con el método p.......

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
caproBox	caprotec bioanalytics	1-5010-001 (220 V)	UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation
caproMag	caprotec bioanalytics	included in the CCMS Starter Kit	For easy handling of magnetic particles without pipetting
c-di-GMP caproKit	caprotec bioanalytics	upon request	The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer
Disposable PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01
12-tube PCR strips	Thermo Scientific	AB-1114
UIS250v sonicator with VialTweeter	Hielscher ultrasound technology	UIS250v and VialTweeter
Miniature French Pressure Cell	Thermo Electron Corporation	FA-003