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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Resumo

Um progresso considerável foi feito durante a última década para a identificação e caracterização de enzimas envolvidas na síntese (ciclases diguanylate) e degradação (fosfodiesterase) do segundo mensageiro c-di-GMP. Em contraste, há pouca informação disponível sobre os mecanismos moleculares e componentes celulares através do qual essa molécula de sinalização regula uma gama diversificada de processos celulares. A maioria das proteínas efetoras conhecidos pertencem à família Pilz ou estão degenerados ciclases diguanylate ou phosphodiesterases que desistiram de catálise e adotaram a função efetora. Assim, para definir melhor a rede c-di-GMP celular numa vasta gama de bactérias, métodos experimentais são necessários para identificar e validar novos efectores para os quais fiável em predições silico falham.

Recentemente, desenvolvemos um romance Captura Espectrometria de Massa Compound (CCMS) de base tecnológica como uma ferramenta poderosa paraidentificar e caracterizar bioquimicamente as proteínas de ligação c-di-GMP. Esta técnica tem sido relatada previamente para ser aplicável a uma vasta gama de organismos 1. Aqui nós damos uma descrição detalhada do protocolo que nós utilizamos para investigar tais componentes de sinalização. Como um exemplo, usamos a Pseudomonas aeruginosa, um agente patogénico oportunista, em que c-di-GMP desempenha um papel crítico no controle de biofilme e virulência. CCMS identificados 74% (38/51) dos componentes conhecidos ou previstos da rede c-di-GMP. Este estudo explica o procedimento CCMS em detalhe, e estabelece-lo como uma ferramenta poderosa e versátil para identificar novos componentes envolvidos na pequena molécula de sinalização.

Introdução

c-di-GMP é um segundo mensageiro chave utilizados pela maioria das bactérias para controlar vários aspectos do seu crescimento e comportamento. Por exemplo, c-di-GMP regula a progressão do ciclo celular, motilidade e a expressão de exopolissacáridos e adesinas de superfície 2-4. Através da coordenação de tais processos c-di-GMP promove a formação de biofilme, um processo que está associado com infecções crónicas de uma variedade de bactérias patogénicas 5. c-di-GMP é sintetizado por enzimas chamadas ciclases diguanylate (PED) que abrigam um domínio GGDEF catalítico 4. Alguns PED possuem um site de inibidor que regula a atividade para baixo ciclase após ligação c-di-GMP. A degradação da proteína c-di-GMP é catalisada por duas classes distintas de fosfodiesterases (PDEs) ou albergando um EAL catalítica ou HD-GYP domínio 6,7.

A maioria das proteínas efectoras conhecidos que se ligam directamente c-di-GMP pertencem a uma das três classes de proteínas: catalíticaGGDEF ou EAL domínios aliado inativos e domínios Pilz, pequenos interruptores moleculares que passam por mudanças de conformação após ligação c-di-GMP 8. PEDs, Pilz PDEs e proteínas estão bem caracterizados e os seus domínios pode ser prevista em silício de forma relativamente segura. Um interesse particular agora está focado na identificação de novas classes de efetores c-di-GMP. Alguns efetores c-di-GMP com diferentes motivos de ligação foram descritos recentemente, como o CRP / FNR Bcam1349 família de proteínas em Burkholderia cenocepacia ou o FleQ regulador de transcrição em P. aeruginosa 9,10. Além disso, riboswitches específico GMP-c-di foram recentemente identificados e mostrado para controlar a expressão de genes de uma forma c-di-GMP-dependente 11. Os motivos c-di-GMP ligação dos diferentes efetores são apenas mal conservada fazer previsões de bioinformática de tais proteínas difícil. Para resolver este problema, foi desenvolvido um método bioquímico, o qual se baseia na utilização de uma spe c-di-GMPCaptura espe- Composto combinada com a espectrometria de massa 1,12,13.

Nós projetamos recentemente um romance trivalente c-di-GMP Captura Composto (CDG-CC, Figura 1) 1. Este andaime química é composta por: 1) um radical de c-di-GMP utilizado como isca para capturar c-di-GMP proteínas de ligação, 2) um grupo reactivo UV-fotoactivável usadas para reticular o CDG-CC para as proteínas ligadas e 3) uma biotina para isolar as proteínas capturadas usando esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. O CDG-CC podem ser usadas para capturar directamente e especificamente efectores c-di-GMP partir de uma mistura complexa de macromoléculas como lisados ​​celulares. Composto de captura com base e abordagens químicas proteómica à base ter sido previamente relatado para ser aplicável a uma vasta gama de organismos, por exemplo, Caulobacter crescentus, Salmonella typhimurium enterica serovar e P. aeruginosa 1,14.

Neste trabalho metodológico,nós fornecemos uma descrição em profundidade do procedimento CCMS utilizando extratos de P. aeruginosa como um exemplo. Este estudo estabelece CCMS como uma ferramenta poderosa e versátil para identificar bioquimicamente novos componentes envolvidos na sinalização molécula pequena.

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Protocolo

1. Preparação Lysate

  1. Crescer P. aeruginosa células em LB para a densidade óptica desejada.
    NOTA: Para obter orientação: usar ≈ 100 ml Cultura / amostra para culturas em fase estacionária e ≈ 500 ml cultur / sample para culturas em fase log (OD 600 nm = 0,5).
  2. Pelete por centrifugação durante 20 min a 5.000 x g.
  3. Ressuspender 0,5-1 g de sedimento em 1 ml de tampão de lise (6,7 mM de MES, HEPES 6,7 mM, NaCl 200 mM, Kac 6,7 mM, DDT 1 mM, pH 7,5) e adicionar inibidor de protease (mini completo, isento de EDTA), bem como DNaseI.
  4. Lyse as células por três passagens através de uma célula de pressão francesa, a 20.000 psi (ver lista de materiais).
  5. Ultra-centrifugação do ligado celular a 100.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
  6. Salve o sobrenadante (vá para o passo 2).
  7. Lave o pellet com 1 ml 1x tampão de lise por pipetagem cima e para baixo.
  8. Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
  9. Flash congelar o sedimento emazoto líquido e armazenar a -20 ° C até ser utilizado para a captura de proteínas membranares (ver etapa 3).

2. Remoção de nucleótidos livres c-di-GMP e Outros (Fração Solúvel Only)

  1. Lave uma coluna PD10 dessalinização (ver Lista de Materiais) com 10 ml de tampão de lise frio.
  2. Verter o sobrenadante (≈ 1 ml) para a PD10, a fim de remover nucleótidos.
  3. Elui-se com 4 ml de tampão de lise frio (500 ul passos).
  4. Selecione as frações mais concentrados, como determinado pelo ensaio de Bradford, e reuni-los.

(Apenas Fracção de Membrana) 3. pelota e ressuspensão Solubilização

  1. Ressuspender o sedimento em 500 a 1.000 ul de 1x tampão de captura (sem detergente) (ver Tabela 1).
    NOTA: O pellet é difícil para voltar a suspender. Aconselha-se a primeira pipeta cima e para baixo com uma pipeta para voltar a suspender aproximadamente o pellet, em seguida, usar uma seringa de 27 G para bem homogeneizar a solução.
  2. Adicionar 1% (w / v) n-dodecil-β-D-maltopiranósido (DDM).
  3. Incubar a 4 ° C durante pelo menos 2 horas (ou O / N) a uma roda rotativa.
  4. Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
  5. Colha o sobrenadante.

Medição da Concentração 4. Protein

  1. Medir a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford (por ensaio BCA para a fracção de membrana).
  2. Definir a concentração total de proteína de 10 mg / ml.

5. Captura

  1. Misturar 300 ug de proteína com 1 mM de PIB, GTP, ATP, CTP, e 20 ul de tampão de captura de 5x (100 mM de HEPES, 250 mM de KAc, MgAc 50 mM, 5% de glicerol, pH 7,5) (Tabela 1). Ajustar o volume da reacção para 100 ul com H 2 O.
    NOTA: o volume total inclui o volume do CDG-CC e c-di-GMP no caso do controlo de competição (ver passo 5.3 e Tabela 2).
    NOTA: Todos os experimentos foram realizados em 200 &# 181; l de 12 tubos de tiras de PCR (Thermo Scientific).
    NOTA: para a fração de membrana, certifique-se de manter sempre a concentração DDM acima da concentração micelar crítica (0,01% w / v) até a etapa de solubilização de proteínas em 8 M ureia (Passo 7.1).
  2. Incubar a 4 ° C durante 30 min numa roda rotativa.
  3. Adicionar 10 uM CDG-CC (concentração final).
    NOTA: incluir um controle sem CDG-CC (referido como "controle de talão"), e um controle suplementado com 1 mM c-di-GMP ("o controlo da concorrência") (ver Tabela 2).
    Nota: A concentração CDG-CC pode ser ajustado de 1 a 10? M.
  4. Incubar a 4 ° C durante pelo menos 2 h (de N para a fracção S / membrana) sobre uma roda rotativa, no escuro.
  5. Depois de uma breve centrifugação, de ligação cruzada pela activação do grupo reactivo do CDG-CC com luz UV durante 4 minutos, utilizando uma CaproBox (ver Lista de Materiais, λ = 310 nm, irradiância ≥10 mW / cm², a distância da fonte = 2 cm),. Nota: Retire a tampa das tiras cross-linking anterior.
  6. Adicionar 25 ul de tampão de lavagem 5x (NaCl 5 M, Tris 250 mM, pH 7,5) e 50 uL de pérolas magnéticas de estreptavidina bem ressuspensos, homogeneizar suavemente.
  7. Incubar a 4 ° C durante 1 hora numa roda rotativa.

6. Passos de lavagem

NOTA: (Magnet: veja a lista de materiais). Comece com uma captura das esferas magnéticas na faixa tampa PCR, com o ímã. Em seguida, substituir a tira de PCR por um novo contendo a solução de lavagem seguinte. Remova o ímã e ressuspender as contas, e incubar 2 min. Spin down e substituir a tampa por uma nova tampa.

  1. As etapas de lavagem (fração solúvel apenas)
    1. Lavar 6 vezes em 200 ul de 1x tampão de lavagem.
    2. Lavar uma vez em 200 ul de grau HPLC de H 2 O.
    3. Lavar 6 vezes em 200 ul de 80% de acetonitrilo.
    4. Lavar duas vezes em 200 ul de grau HPLC de H 2 O.
  2. As etapas de lavagem (membrafração ne apenas)
    1. Lavar cinco vezes em 200 ul de 1x tampão de lavagem + 0,1% de DDM.
    2. Lavar duas vezes em 200 ul de 1x tampão de lavagem com 0,05% de DDM.
    3. Lavar uma vez em 200 ul de tampão de lavagem 1x + 0,025% DDM.
    4. Lavar uma vez em 200 ul de tampão de lavagem 1x + 0,0125% DDM.
    5. Lavar 3 vezes, com 200 ul de 100 mM de ABC (bicarbonato de amónio, NH 4 CO 3) + 2 M de ureia.

7. MS Preparação de amostras

  1. Ressuspender as contas (diretamente na tampa) em 20 ul ABC 100 mM (ABC mM 100 + 8 M uréia para a fração de membrana) e transferir para tubos de 1,5 ml.
  2. Fracção de membrana só: incubar a 60 ° C durante 5 min, agitando a 500 rpm.
  3. Adicionar 0,5 uL de 200 mM de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina) e incubar a 60 ° C durante 1 hora, agitando a 500 rpm. Arrefecer a 25 ° C.
  4. Adicionar 0,5 mL de 400 mM frescamente preparado iodoacetamida e incubar a 25 ° C durante 30 min, agitando umat e 500 rpm no escuro.
  5. Adicionar 0,5 uL de 0,5 M de N-acetil-cisteína e incubar a 25 ° C durante 10 min, agitando a 500 rpm.
  6. Fracção de membrana só: adicionar 1 ul Lys-C e incubar a 37 ° C, O / N.
  7. Adicionar 2 mg de tripsina e incubar O / N a 37 ° C, agitação a 500 rpm (envoltório em Parafilm para evitar a secagem).
    Observação: as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C nesta fase.
    NOTA: fracção de membrana só: adicionar ABC 100 mM para ajustar a concentração de ureia para <2 M antes da adição de tripsina.
  8. Mexer um pouco abaixo dos tubos e recolher contas com o ímã.
  9. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml (repetir este passo se grânulos são deixados).
  10. Adicionam-se 5 ul de 5% de TFA (ácido trifluoroacético) + 1 ul de 2 M de HCl (15 mL de 5% de TFA + 5 ul de 2 M de HCl para a fracção de membrana).
  11. Condição colunas C18 Microspin (The Nest Group, MA, EUA) com 150 ml de acetonitrila (spin 20 segundos a 2.400 rpm).
  12. Equilibrate as colunas C18 duas vezes com 150 ul de 0,1% de TFA (20 segundos de centrifugação, 2.400 rpm).
  13. Carregar a amostra e girar 2 min, 2000 rpm.
  14. Recarregar o fluxo de passagem na coluna e repetir a etapa de fiação (2 min, 2000 rpm).
  15. Lavar 3 vezes com 150 ul de 0,1% de TFA, 5% de acetonitrilo (20 seg, 2.400 rpm).
  16. Tomar um novo tubo e eluir duas vezes com 150 ul de 0,1% de TFA, 50% de acetonitrilo (2 min, 2000 rpm).
  17. Secam-se os péptidos em uma velocidade vac.
  18. Ressuspender em 40 ul 98% de H 2 O, 2% de acetonitrilo, 0,15% de ácido fórmico.
  19. Sonicate 20 sec (ciclo de pulso de 0,5, amplitude de 100%; veja a lista de materiais) e spin down 5 seg, 12.000 rpm (centrífuga de bancada). Vortex 10 seg, e spin down 5 seg, 12.000 rpm. Transferir num frasco de HPLC para análise por LC-MS / MS.
  20. Congelar a -20 ° C.
    Observação: as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C nesta fase.

8. LC-MS / MS Análise

  1. Executar um nano-LC (sistemas nano-LC) equed com uma coluna de RP-HPLC (75 mm x 37 cm) cheia com resina C18 (C18 mágica AQ 3 mm) usando um gradiente linear de 95% de solvente A (ácido fórmico a 0,15%, acetonitrilo a 2%) e 5% de solvente B ( 98% de acetonitrilo, ácido fórmico a 0,15%) para 35% de solvente B ao longo de 60 min a uma velocidade de fluxo de 0,2 mL / min.
  2. Analisar os péptidos utilizando LC-MS / MS (dupla pressão LTQ-Orbitrap Velos espectrómetro de massa, ligada a uma fonte iónica de electropulverização).
    NOTA: O modo de aquisição de dados foi criado para obter uma alta resolução MS varredura na parte FT do espectrômetro de massa com uma resolução de 60.000 FWHM seguidos por varreduras MS / MS no ion trap linear dos 20 íons mais intensos. Para aumentar a eficiência de tentativas de MS / MS, o rastreio modus estado carregado foi activado para excluir não atribuído individualmente e carrega iões. Conluio dissociação induzida foi acionado quando o precursor ultrapassado contagem de íon 100. A duração da exclusão dinâmico foi ajustada para 30 seg. O tempo de acumulação de íons foi definido para 300 ms (MS) e 50ms (MS / MS).

9. Banco de Dados de Pesquisa

  1. Baixe o P. aeruginosa NCBI-banco de dados através da homepage do NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
  2. Converta os espectros MS bruto em mascote arquivos genéricos (MGF), utilizando a ferramenta de conversão MassMatrix ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
  3. Pesquisar neste arquivo mgf usando MASCOTE versão 2.3 contra o P. aeruginosa NCBI-banco de dados contendo a frente e entradas de proteína reversa de engodo.
  4. Executar uma na digestão de tripsina silico após lisina e arginina (a não ser seguido por prolina) tolerando dois perderam clivagens na peptídeos trípticos totalmente.
  5. Defina os parâmetros de pesquisa de banco de dados para permitir metioninas oxidada (15,99491 Da) como modificações variáveis ​​e carboxyamidomethylation (57,021464 Da) de resíduos de cisteína como a modificação fixa. Para MASCOTE nos perscrutaing scans de alta resolução, definir a tolerância massa precursor para 15 ppm e definir a tolerância massa fragmento de 0,6 Da. Finalmente, a proteína definida FDR para 1%.
  6. Importe as pesquisas mascote do P. experimentos aeruginosa CCMS em Andaime (Proteomesoftware, versão 3), defina os parâmetros para obter uma proteína FDR perto de 1%, e extrair as contagens totais espectrais.
  7. Para os resultados representativos apresentados neste trabalho, foi utilizado um teste t pareado para comparar a experiência com o controle de concorrência, e só consideradas hits com um valor p inferior a 0,1, e uma relação de contagem espectral acima de 2 (Experimento contagens espectrais / espectral competição controle contagens).
  8. Os dados podem ser exportados em qualquer software de planilha para análise posterior.

10. livre-Label Quantificação

  1. Importe os arquivos brutos em software progênese LC-MS (Nonlinear Dynamics, versão 4.0).
  2. Efetue o alinhamento LC-MS e detecção de recurso em Setti padrãoNGS.
  3. Exportar os dados em formato de mgf progênese LC-MS.
  4. Pesquisar os espectros de MS / MS usando o MASCOTE contra o NCBI P. banco de dados contendo aeruginosa frente e entradas de proteína reversa de engodo.
  5. Importe os resultados da pesquisa de banco de dados em progênese LC-MS e mapear os peptídeos identificações para recursos MS1.
  6. Para a avaliação de dados (cálculo de níveis de significância, dobram-change rácios) foi utilizado o script ProteinSQAnalysis de SafeQuant (limiar: valor q abaixo de 0,1, relação de contagem espectral acima de 2).

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Resultados

Para identificar novos efectores c-di-GMP em P. aeruginosa foi utilizado sistematicamente CCMS para analisar as frações solúvel e de membrana de P. aeruginosa PAO1 estirpe a partir de uma cultura em fase logarítmica (OD600 = 0,5). Aqui vamos resumir e discutir os resultados representativos desta expedição de pesca. Foram utilizados quatro réplicas biológicas independentes. Para cada experimento, foram utilizadas duas concentrações CDG-CC diferentes (5 mm e 10 mm). Para investigar a...

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Discussão

Um cuidado especial deve ser tomado em vários passos do protocolo. A concentração de proteína é um parâmetro crítico com uma concentração de 10 mg / ml de ser difícil de alcançar quando as células são cultivadas sob condições específicas de crescimento (por exemplo, biofilmes ou pequenas variantes de colónias). Assim, a re-suspensão da pelota deve ser realizada num pequeno volume de tampão de lise. As concentrações de proteína pode ser diminuída para 8 mg / ml. Comparado com o método pub...

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Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
caproBoxcaprotec bioanalytics1-5010-001 (220 V)UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation
caproMagcaprotec bioanalyticsincluded in the CCMS Starter KitFor easy handling of magnetic particles without pipetting
c-di-GMP caproKitcaprotec bioanalyticsupon requestThe kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer
Disposable PD-10 Desalting ColumnsGE Healthcare17-0851-01 
12-tube PCR stripsThermo ScientificAB-1114
UIS250v sonicator with VialTweeterHielscher ultrasound technologyUIS250v and VialTweeter
Miniature French Pressure CellThermo Electron CorporationFA-003

Referências

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