Captation composé spectrométrie de masse - un outil puissant pour identifier de nouveaux c-di-GMP protéines effectrices

Résumé

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Résumé

Des progrès considérables ont été réalisés au cours de la dernière décennie vers l'identification et la caractérisation des enzymes impliquées dans la synthèse (des cyclases diguanylate) et de dégradation (phosphodiestérases) du second messager c-di-GMP. En revanche, peu d'informations sont disponibles concernant les mécanismes moléculaires et de composants cellulaires à travers laquelle cette molécule de signalisation réglemente un large éventail de processus cellulaires. La plupart des protéines effectrices connus appartiennent à la famille Pilz ou sont dégénéré cyclases ou phosphodiestérases diguanylate qui ont renoncé à la catalyse et ont adopté fonction d'effecteur. Ainsi, afin de mieux définir le réseau c-di-GMP cellulaire dans un large éventail de bactéries méthodes expérimentales sont nécessaires pour identifier et valider de nouveaux effecteurs pour lesquels fiable dans prédictions in silico sûr.

Nous avons récemment développé une capture nouveau composé spectrométrie de masse (CCMS) technologie comme un outil puissant pourbiochimiquement identifier et de caractériser les protéines de liaison c-di-GMP. Cette technique a déjà été signalé comme étant applicable à une large gamme d'organismes ^1. Ici, nous donnons une description détaillée du protocole que nous utilisons pour sonder ces composants de signalisation. A titre d'exemple, on utilise Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste dans laquelle c-di-GMP joue un rôle essentiel dans la virulence et le contrôle du biofilm. CCMS identifié 74% (38/51) des composants connus ou prévus du réseau c-di-GMP. Cette étude explique la procédure CCMS en détail, et l'établit comme un outil puissant et polyvalent pour identifier de nouveaux composants impliqués dans la signalisation de petite molécule.

Introduction

c-di-GMP est un second messager clé utilisé par la plupart des bactéries de contrôler différents aspects de leur croissance et leur comportement. Par exemple, c-di-GMP régule la progression du cycle cellulaire, la motilité et de l'expression d'exopolysaccharides adhésines de surface et ^4/2. Grâce à la coordination de ces procédés c-di-GMP favorise la formation du biofilm, un processus qui est associée à des infections chroniques d'une gamme de ⁵ bactéries pathogènes. c-di-GMP est synthétisé par des enzymes appelées CYCLASES diguanylate (DGCS) qui abritent un domaine catalytique GGDEF ^4. Certains DGCS possèdent un site inhibiteur qui régule négativement l'activité de cyclase lors de la liaison c-di-GMP. La dégradation de c-di-GMP est catalysée par deux classes distinctes des phosphodiestérases (PDE) hébergeant soit un EAL catalytique ou HD-GYP domaine ^6,7.

La majorité des protéines effectrices connus qui se lient directement c-di-GMP appartiennent à l'une des trois classes de protéines: catalytiqueGGDEF ou EAL domaines allié inactifs et domaines Pilz, petits interrupteurs moléculaires qui subissent des changements conformationnels sur c-di-GMP liaison ^8. DGCS, PDE et Pilz protéines sont bien caractérisés et leurs domaines peuvent être prédites in silico de façon relativement sûre. Un intérêt particulier est désormais axée sur l'identification de nouvelles classes d'effecteurs c-di-GMP. Certains effecteurs c-di-GMP avec différents motifs de liaison ont été récemment décrits comme le CRP / FNR Bcam1349 de la famille des protéines dans Burkholderia cenocepacia ou FleQ de régulateur transcriptionnel dans P. aeruginosa ^9,10. En outre, riboswitchs-GMP-c-di spécifique ont été récemment identifiés et affichés pour contrôler l'expression génique d'une manière c-di-GMP-dépendante ^11. Les motifs c-di-GMP de liaison des différents effecteurs sont seulement mal conservée faire des prédictions bioinformatiques de telles protéines difficile. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une méthode biochimique, qui est basé sur l'utilisation d'un spe c-di-GMPcifique de captation composé combinée avec la spectrométrie de masse ^1,12,13.

Nous avons récemment conçu un roman trivalent c-di-GMP captation composé (CDG-CC, figure 1) ^1. Cet échafaudage chimique est composé de: 1) un fragment C-di-GMP utilisée comme appât pour capturer les protéines de liaison à c-di-GMP, 2) un groupe réactif photoactivable-UV utilisé pour réticuler la CDG-CC pour les protéines liées et 3) une biotine d'isoler les protéines capturées en utilisant des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Le CDG-CC peut être utilisé pour capturer directement et spécifiquement effecteurs c-di-GMP de mélange complexe de macromolécules que lysats cellulaires. Capturer composé à base de produits chimiques et les approches protéomique base ont déjà été signalés à être applicable à un large éventail d'organismes, par exemple Caulobacter crescentus, Salmonella enterica sérotype typhimurium et P. aeruginosa ^1,14.

Dans ce document méthodologique,nous fournissons une dans la description de la profondeur de la procédure CCMS en utilisant des extraits de P. aeruginosa titre d'exemple. Cette étude établit CCMS comme un outil puissant et polyvalent pour identifier biochimiquement nouveaux composants impliqués dans la signalisation de petite molécule.

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Protocole

1. Préparation Lysate

1. Cultivez P. cellules aeruginosa dans LB à la DO souhaitée.
   REMARQUE: Pour obtenir des conseils: utiliser ≈ 100 ml de culture / échantillon pour cultures en phase stationnaire et ≈ 500 ml cultur / échantillon pour les cultures en phase logarithmique (DO _{600 nm} = 0,5).
2. Pellet par centrifugation pendant 20 min à 5000 x g.
3. Remettre en suspension de 0,5 à 1 g de culot dans 1 ml de tampon de lyse (mM MES 6,7 mM HEPES 6,7 mM, NaCl 200 mM KAC 6,7, DDT 1 mM, pH 7,5) et ajouter inhibiteur de la protéase (mini complète, sans EDTA) ainsi que DNaseI.
4. Lyse des cellules par trois passages à travers une cellule de pression française, à 20 000 psi (voir liste des matières).
5. Ultra-centrifugeuse de la lysat cellulaire à 100 000 x g pendant 1 h à 4 ° C.
6. Enregistrez le surnageant (passez à l'étape 2).
7. Laver le culot avec 1 ml de tampon de lyse 1x par pipetage de haut en bas.
8. Ultracentrifugeuse à 100 000 x g pendant 1 heure à 4 ° C.
9. Flash geler le culot dansazote liquide et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisé pour la capture des protéines membranaires (voir l'étape 3).

2. Suppression des nucléotides libres c-di-GMP et les autres (fraction soluble uniquement)

1. Laver une colonne PD10 de dessalage (voir la liste des matériaux) avec 10 ml de tampon de lyse froid.
2. Verser le surnageant (≈ 1 ml) sur la PD10 afin d'éliminer les nucléotides.
3. Eluer avec 4 ml de tampon de lyse froid (500 étapes pi).
4. Sélectionnez les fractions les plus concentrées comme déterminé par dosage de Bradford, et mettre en commun leur.

3. Pellet et resuspension solubilisation (Fraction membrane seulement)

1. Reprendre le culot dans 500 à 1000 pi de tampon 1x de capture (sans détergent) (voir le tableau 1).
   NOTE: Le culot est difficile de remettre en suspension. Il est conseillé à la première pipette de haut en bas avec une pipette pour remettre en suspension à peu près le culot, puis d'utiliser une seringue 27 G pour bien homogénéiser la solution.
2. Ajouter 1% (p / v) de n-dodécyl-β-D-maltopyranoside (DDM).
3. Incuber à 4 ° C pendant au moins 2 heures (ou O / N) sur une roue rotative.
4. Ultracentrifugeuse à 100 000 x g pendant 1 heure à 4 ° C.
5. Récolter le surnageant.

4. Concentration en protéines Mesure

1. Mesurer la concentration en protéine par dosage de Bradford (par dosage BCA pour la fraction de membrane).
2. Régler la concentration totale en protéine de 10 mg / ml.

5. capture

1. Mélanger 300 ug de protéine avec 1 mM de PIB, GTP, ATP, CTP, et 20 ul de tampon de capture 5x (100 mM de HEPES, 250 mM de KAc, MgAc 50 mM, 5% de glycerol, pH 7,5) (tableau 1). Ajuster le volume de réaction de 100 ul avec du H ₂ O.
   REMARQUE: le volume total inclut le volume de la CDG-CC et c-di-GMP en cas de contrôle de la concurrence (voir l'étape 5.3 et le tableau 2).
   REMARQUE: Les expériences ont été effectuées dans 200 &bandes l 12 tubes PCR (Thermo Scientific); # 181.
   REMARQUE: pour la fraction membranaire, assurez-vous de toujours garder la concentration de DDM-dessus de la concentration micellaire critique (0,01% p / v) jusqu'à ce que l'étape de solubilisation de protéines dans 8 M d'urée (étape 7.1).
2. Incuber à 4 ° C pendant 30 min sur une roue rotative.
3. Ajouter 10 uM CDG-CC (concentration finale).
   REMARQUE: inclure un contrôle sans CDG-CC (dénommé «contrôle de perles»), et un contrôle additionné de 1 mM c-di-GMP ("de contrôle de la concurrence") (voir le tableau 2).
   NOTE: la concentration CDG-CC peut être réglée de 1 à 10 uM.
4. Incuber à 4 ° C pendant au moins 2 heures (O / N pour la fraction de membrane) sur une roue rotative, dans l'obscurité.
5. Après une courte rotation, réticulation par l'activation de la partie réactive de la CDG-CC avec une lumière UV pendant 4 min, en utilisant un CaproBox (voir la liste des matériaux, λ = 310 nm, Irradiance ≥10 mW / cm², la distance de la source = 2 cm). REMARQUE: retirer le couvercle des bandes croisées de liaison avant.
6. Ajouter 25 ul 5x tampon de lavage (5 M de NaCl, Tris 250 mM, pH 7,5) et 50 pi de billes magnétiques de streptavidine ainsi remis en suspension, homogénéiser délicatement.
7. Incuber à 4 ° C pendant 1 heure sur une roue rotative.

6. étapes de lavage

NOTE: (Magnet: voir liste des matières). Commencez avec une capture des billes magnétiques dans le couvercle de la bande PCR, avec l'aimant. Puis remplacer la bande PCR par un nouveau contenant la solution de lavage suivant. Retirer l'aimant et remettre en suspension les perles, et incuber 2 min. Isoler et remplacer le couvercle par un couvercle frais.

1. Les étapes de lavage (fraction soluble uniquement)
   1. Laver 6 fois dans 200 tampon de lavage ul 1x.
   2. Laver une fois dans 200 pi qualité HPLC H ₂ O.
   3. Laver 6 fois dans 200 pi 80% d'acétonitrile.
   4. Laver deux fois dans 200 pi qualité HPLC H ₂ O.
2. Les étapes de lavage (membrane partie seulement)
   1. Laver 5 fois dans 200 pi de tampon de lavage 1x + 0,1% DDM.
   2. Laver deux fois dans 200 pi de tampon de lavage 1x + 0,05% DDM.
   3. Laver une fois dans 200 pi de tampon de lavage 1x + 0,025% DDM.
   4. Laver une fois dans 200 pi de tampon de lavage 1x + 0,0125% DDM.
   5. Lavez 3 fois dans 200 pi mM ABC 100 (bicarbonate d'ammonium, NH ₄ CO ₃₎ + 2 M d'urée.

7. MS Préparation de l'échantillon

1. Resuspendre les billes (directement dans le couvercle) dans 20 ul ABC 100 mM (100 mM ABC + 8 M d'urée pour la fraction de membrane) et transférer dans des tubes de 1,5 ml.
2. Fraction membranaire seulement: incuber à 60 ° C pendant 5 min, sous agitation à 500 tours par minute.
3. Ajouter 0,5 ul mM PTCE 200 (tris (2-carboxyéthyl) phosphine) et incuber à 60 ° C pendant 1 heure, en agitant à 500 rpm. Refroidir à 25 ° C.
4. Ajouter 0,5 ul de 400 mM fraîchement préparée iodoacétamide et incuber à 25 ° C pendant 30 min, en secouant uneT 500 tours par minute et dans l'obscurité.
5. Ajouter 0,5 pi de 0,5 M de N-acétyl-cystéine et incuber à 25 ° C pendant 10 min, sous agitation à 500 tours par minute.
6. Fraction membranaire uniquement: ajouter 1 pl Lys-C et incuber à 37 ° C, O / N.
7. Ajouter 2 pg de trypsine et incuber O / N à 37 ° C, en agitant à 500 rpm (enveloppement dans Parafilm pour éviter le dessèchement).
   NOTE: les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C à ce stade.
   REMARQUE: fraction membrane uniquement: ajouter 100 mM ABC pour ajuster la concentration de l'urée à <2 M avant l'addition de trypsine.
8. Brièvement centrifuger les tubes et de recueillir des perles avec l'aimant.
9. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml (répéter cette étape si les perles sont de gauche).
10. Ajouter 5 ul de 5% de TFA (acide trifluoroacétique) + 1 ul de HCl 2 M (+ HCl 5 M ul 15 ul de 5% de TFA 2 pour la fraction de membrane).
11. Condition colonnes C18 MicroSpin (Le Groupe de Nest, MA, USA) avec 150 ul acétonitrile (spin 20 secondes à 2400 tours par minute).
12. Equilibrate les colonnes C18 deux fois avec 150 ul de 0,1% de TFA (spin 20 sec, 2400 rpm).
13. Chargez l'échantillon et de spin 2 min, 2000 rpm.
14. Recharger l'écoulement sur la colonne et répéter l'étape de filage (2 min, 2000 rpm).
15. Laver trois fois avec 150 ul de 0,1% de TFA, 5% d'acétonitrile (20 sec, 2400 rpm).
16. Prendre un nouveau tube et on élue deux fois avec 150 ul de 0,1% de TFA, 50% d'acétonitrile (2 min, 2000 rpm).
17. Sécher les peptides dans un speed-vac.
18. Remettre en suspension dans 40 ul de 98% de H ₂ O, 2% d'acétonitrile, d'acide formique à 0,15%.
19. Soniquer 20 sec (cycle d'impulsion 0,5, amplitude de 100%; voir la liste des matériaux) et centrifuger 5 sec, 12000 rpm (centrifugeuse de paillasse). Vortex 10 sec, et centrifuger 5 secondes, 12 000 rpm. Transférer dans un flacon de HPLC pour l'analyse LC-MS / MS.
20. Congeler à -20 ° C.
    NOTE: les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C à ce stade.

8. LC-MS / MS Analysis

1. Exécutez un nano-LC (systèmes nano-LC) equipped avec une colonne de RP-HPLC (75 pm x 37 cm) garnie de résine C18 (Magic C18 AQ 3 um) en utilisant un gradient linéaire de 95% de solvant A (acide 0,15% de l'acide formique, 2% d'acétonitrile) et 5% de solvant B ( 98% d'acétonitrile, d'acide formique à 0,15%) à 35% de solvant B sur 60 min à un débit de 0,2 ul / min.
2. Analyser les peptides par LC-MS / MS (double-pression LTQ Velos Orbitrap spectromètre de masse, relié à une source d'ions à électronébulisation).
   REMARQUE: Le mode d'acquisition de données a été créée pour obtenir une haute résolution MS SCAN dans la partie FT du spectromètre de masse à une résolution de 60000 FWHM suivie par des analyses MS / MS dans le piège à ions linéaire des 20 ions les plus intenses. Pour augmenter l'efficacité de tentatives MS / MS, la projection modus chargée de l'Etat a été activé à exclure non affecté et charge individuellement ions. Collusion dissociation induite a été déclenchée lorsque le précurseur dépassé les 100 chefs d'ions. La durée d'exclusion dynamique a été réglée à 30 sec. Le temps d'accumulation d'ions a été réglée à 300 ms (MS) et 50msec (MS / MS).

9. Base de données Recherche

1. Télécharger le P. aeruginosa NCBI-base de données via la page d'accueil du NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
2. Convertir les spectres MS brut en fichiers génériques de mascotte (mgf) en utilisant l'outil de conversion MassMatrix ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
3. Chercher dans ce fichier mgf utilisant MASCOT version 2.3 contre le P. aeruginosa NCBI-base de données contenant de l'avant et les entrées de protéines reverse-leurres.
4. Effectuer une in silico la digestion de la trypsine après lysine et l'arginine (moins suivi par la proline) tolérer manqué deux clivages dans les peptides tryptiques pleinement.
5. Définissez les paramètres de recherche de base de données pour permettre methionines oxydé (15,99491 Da) que des modifications variables et carboxyamidomethylation (57,021464 Da) des résidus cystéine que la modification fixe. Pour MASCOT nous scruteing scans haute résolution, définir la tolérance de masse de précurseur de 15 ppm et définir la tolérance de masse de fragment à 0,6 Da. Enfin, réglez la protéine FDR à 1%.
6. Importez les recherches mascotte de P. expériences aeruginosa CDSM dans Échafaudages (Proteomesoftware, Version 3), définissez les paramètres pour obtenir une protéine FDR près de 1%, et extraire les comtes spectrale totale.
7. Pour les résultats représentatifs présentés dans cet article, nous avons utilisé un test t apparié pour comparer l'expérience avec le contrôle de la concurrence, et seulement considéré succès avec une valeur de p inférieure à 0,1, et un ratio de comptage spectrale supérieure à 2 (expérimenter compte spectrales / contrôle de la concurrence spectrale chiffres).
8. Les données peuvent être exportées dans ne importe quel tableur pour une analyse ultérieure.

10. Quantification Sans étiquette

1. Importez les fichiers bruts dans le logiciel ProGenesis LC-MS (dynamique non linéaire, la version 4.0).
2. Effectuez un alignement LC-MS et détection de caractéristiques de Setti par défautNGS.
3. Exporter les données au format mgf de ProGenesis LC-MS.
4. Rechercher les spectres MS / MS en utilisant la mascotte contre le NCBI P. base de données contenant aeruginosa avant et entrées de protéines reverse-leurres.
5. Importez les résultats de la recherche de base de données dans ProGenesis LC-MS et cartographier les peptides identifications aux fonctionnalités MS1.
6. Pour l'évaluation des données (calcul des niveaux de signification, plier changement ratios) le script ProteinSQAnalysis de SafeQuant a été utilisée (seuil: valeur de q inférieur à 0,1, le ratio de comptage spectrale supérieure à 2).

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Résultats

Pour identifier de nouveaux effecteurs c-di-GMP dans P. aeruginosa nous avons systématiquement utilisé CCMS pour analyser les fractions solubles et membranaires de P. aeruginosa souche PAO1 d'une culture en phase logarithmique (DO ₆₀₀ = 0,5). Nous résumons ici et discutons des résultats représentatifs de cette expédition de pêche. Quatre répliques biologiques indépendants ont été utilisés. Pour chaque expérience, deux concentrations CDG-CC différents ont été utilisés (5 ...

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Discussion

Une attention particulière devrait être prise à plusieurs étapes du protocole. La concentration en protéine est un paramètre critique avec une concentration de 10 mg / ml étant difficile à atteindre lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions de croissance spécifiques (par exemple des biofilms ou des variants petites colonies). Ainsi, la remise en suspension du culot doit être effectuée dans un faible volume de tampon de lyse. Les concentrations de protéines peuvent être diminuées à ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
caproBox	caprotec bioanalytics	1-5010-001 (220 V)	UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation
caproMag	caprotec bioanalytics	included in the CCMS Starter Kit	For easy handling of magnetic particles without pipetting
c-di-GMP caproKit	caprotec bioanalytics	upon request	The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer
Disposable PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01
12-tube PCR strips	Thermo Scientific	AB-1114
UIS250v sonicator with VialTweeter	Hielscher ultrasound technology	UIS250v and VialTweeter
Miniature French Pressure Cell	Thermo Electron Corporation	FA-003